Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

O objetivo geral do seguinte experimento em design geneticamente rastreável Caenorhabditis elegans é identificar interações de chaperonas específicas do tecido. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina ensaios fáceis de usar, como o ajuste de Golan AI e leituras comportamentais para expor novas interações específicas de tecido. Para uma sincronização de embriões não estressante, use uma picareta de minhoca para mover cerca de 100 ovos de uma placa de minhoca não sincronizada para uma placa NGM recém-assentada e cultive os animais de acordo com o cronograma experimental apropriado.

Quando os animais atingirem o primeiro dia de postura dos ovos, adicione lentamente um mililitro de tampão M9 ao prato, distante do gramado bacteriano, e gire o prato para que o tampão cubra completamente o prato. Incline o prato para um lado para remover o líquido e lavar os animais do prato. Quando todos os vermes tiverem sido lavados da placa, use uma ponta de pipeta de plástico padrão para cortar um quadrado de ágar ao redor de onde os ovos estão concentrados e coloque o pedaço de ágar em uma placa NGM recém-assentada.

Cultive os ovos nas mesmas condições de cultivo. No final da incubação, a placa deve ser coberta com ovos sincronizados. Depois de lavar todos os animais da placa, conforme demonstrado, adicione um mililitro de tampão M9 fresco e use um raspador de células para liberar os ovos da placa.

Quando todos os ovos tiverem sido destacados, transfira todo o volume de tampão da placa para um tubo cônico para centrifugação. Centrifugue o tubo e descarte o sobrenadante. Depois de remover o sobrenadante, adicione até um mililitro de tampão M9 fresco à placa e pipete para ressuspender os ovos.

Lave os ovos mais cinco vezes, como acabamos de demonstrar. Após a última lavagem, o pellet de ovo deve parecer branco e todos, exceto os últimos 200 microlitros de sobrenadante, podem ser removidos. Para cultivar nematóides sincronizados para um experimento, coloque uma gota de cerca de 30 ovos perto do gramado bacteriano e cada placa assentada de RNA de interferência e cerca de 30 ovos em uma placa assentada com vetor vazio contendo bactérias.

Em seguida, cultivar os animais nas condições de cultura adequadas, de acordo com o protocolo experimental. Para avaliar a letalidade embrionária dos animais sincronizados, quando os animais começarem a botar ovos, transfira cerca de 100 ovos para um prato vazio e espalhe os ovos em fileiras para simplificar a contagem. Após 24 a 48 horas, marque a porcentagem de ovos não eclodidos.

Para referência, compare os ovos de animais experimentais com os ovos de animais tratados com bactérias de controle de vetores vazias. Para configurar um ensaio de paralisia, cultive animais sincronizados com a idade em bactérias de controle de vetores vazias, até que os animais atinjam a idade adulta, mas antes do início da postura dos ovos. Use um marcador fino para desenhar uma linha na parte de trás de uma placa de ágar NGM normal e coloque de cinco a dez animais na linha marcada.

Defina um cronômetro para 10 minutos e marque a porcentagem de animais restantes na linha como vermes paralisados. Para referência, compare esses dados com a porcentagem de animais mutantes criados em bactérias de controle vetorial vazias. Para validação de knockdown de proteína, coloque 250 a 300 ovos sincronizados em uma placa de RNA de interferência NGM de 60 milímetros assentada com a bactéria contendo RNA de fita dupla ou vetor vazio relevante e cultive os ovos pelo período experimental apropriado.

Ao final da incubação, transferir um total de 200 animais adultos jovens para a tampa de um tubo de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de PBST mantido na temperatura de cultivo dos animais. Feche a tampa com cuidado e centrifugue os animais a 1000 vezes G por 1 minuto. No final da centrifugação, adicione 800 microlitros de PBST fresco ao tubo e centrifugue os vermes novamente.

Remova cuidadosamente os 900 microlitros superiores do sobrenadante e lave os nematóides em PBST fresco mais 3 vezes, conforme demonstrado. Após a última lavagem, remova todos, exceto os últimos 100 microlitros do sobrenadante e adicione 25 microlitros de tampão de amostra 5X aos animais. Aqueça as amostras por 10 minutos a 92 graus Celsius e 1000 rotações por minuto, antes de carregar 20 microlitros de cada amostra em um gel de página SDS.

Em seguida, execute a análise de Western blot usando os anticorpos apropriados para determinar a estabilidade relativa da proteína de interesse e use um software densitométrico para determinar a intensidade das proibições. HSP6 derrubado durante o desenvolvimento resulta em uma forte parada do desenvolvimento em animais selvagens. Ao mesmo tempo, HSP6 derrubado em uma cepa de RNA de interferência específica do músculo expressando RDE1 do tipo selvagem no tecido muscular não causa parada no desenvolvimento.

Considerando que o HSP6 derrubou uma cepa de RNAI específica do intestino expressando RDE1 do tipo selvagem nas células intestinais, resulta em uma forte parada do desenvolvimento e fenótipo. Uma mutação no HSP6 MG585 que causa um leve atraso no crescimento pode, portanto, ser usada para rastrear o agravamento ou alívio das interações chaperonas, cruzando uma cepa que carrega esse gene mutado em uma cepa de RNA de interferência específica do intestino e rastreando a biblioteca de RNA de interferência da chaperona. A organização da miosina e os animais mutantes UNC45 tratados com RNA de interferência STI1, AHSA1 ou DAF41 são semelhantes aos vermes do tipo selvagem no quarto estágio larval.

Embora os mutantes exibam sarcômeros interrompidos após atingirem a idade adulta. Em contraste, tanto os animais mutantes UNC45 tratados com um controle vetorial vazio quanto os animais do tipo selvagem permanecem inalterados. As interações genéticas não são indicativas de interação física.

Assim, experimentos de acompanhamento usando triagem de interação genética devem ser realizados para validar e examinar diretamente a natureza das interações identificadas.