Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar camundongos portadores de um sistema imunológico humano projetado. Isso é conseguido primeiro preparando o mouse para a cirurgia e, em seguida, carregando o trocarte com um pedaço de timo na segunda etapa. O matrigel é misturado com células transduzidas CD 34 negativas e CD 34 positivas, e a mistura é então adicionada ao trocarte.

Em seguida, as construções de matrigel são transplantadas sob a cápsula renal. Em última análise, a rejeição dos tumores-alvo pelas células T CD oito geneticamente modificadas pode ser monitorada por imagens de animais de estimação vivos e medições físicas de tumores. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos de metanfetamina existentes, como modelos totalmente neurais, é que este método permite o estudo do desenvolvimento de células-tronco humanas geneticamente modificadas dentro do timo humano e subsequentes testes de eficácia in vivo de linhagens derivadas demonstrando o procedimento será três técnicos de nossos laboratórios, Gregory Bristol, Bernard Levin, e Sean Kim.

Neste diagrama esquemático, o modelo BLT modificado usado nesses estudos para a geração de camundongos quiméricos portadores de mart, uma célula T específica é descrita. O implante é reconstruído a partir de células CD 34 transduzidas e não transduzidas isoladas de um fígado fetal autólogo. Uma fração das células transduzidas é então congelada e injetada nos camundongos irradiados quatro a seis semanas depois.

Neste vídeo, a implantação da construção viva é demonstrada quando os animais ficam lentos com a anestesia. Comece raspando o lado esquerdo de cada mouse do quadril ao ombro entre o centro das costas e a barriga. Depois de registrar o peso de cada animal, dê um soco nas orelhas para numeração e, por via subcutânea, injete 0,3 mililitros de carprofeno em cada um dos ombros.

Em seguida, coloque os ratos do lado direito, voltados para a esquerda. Agora lave o trocarte de uma agulha de implante de câncer de calibre 16 com uma ponta de lima redonda com PBS. Usando um par de pinças de ponta fina, adicione um pedaço de timo ao prato de PBS e, em seguida, segure o trocarte na horizontal com a haste.

Logo dentro da ponta, aspire o tecido. Deslizar o trocarte sob a cápsula renal e injetar o tecido é um dos aspectos mais desafiadores desse procedimento. Em seguida, peça a um ajudante.

Use uma pipeta de deslocamento positivo eend orph para misturar cinco microlitros de matrigel frio em um tubo de células com agitação suave. Mantendo o trocarte na horizontal. Puxe lentamente a haste para trás enquanto o ajudante pipeta o gel matri.

Misture no trocarte para cada mouse. Primeiro, limpe a pele nua do animal com Betadine e depois limpe-a com um pano de isopropanol. Duas vezes determinam o ponto mais escuro sob a pele, indicando a localização do baço.

O rim é encontrado cerca de cinco milímetros dorsal ao baço usando uma pinça romba para pegar a pele sobre o rim. Faça um corte de cerca de 15 milímetros de comprimento na pele paralela ao baço. Faça um corte semelhante na camada muscular do peritônio abaixo.

Nos homens, o rim deve ser diretamente visível. Basta apertar o abdômen para retirá-lo. Manter a pressão no abdômen com a mão esquerda para manter o rim exposto nas mulheres primeiro use um hemostático para pegar o ovário e depois arraste o rim para ajudar a reter o órgão fora do corpo.

Faça um pequeno orifício na extremidade posterior da cápsula renal e, em seguida, deslize o trocarte para dentro deste orifício e ao longo do rim até que o orifício do trocarte esteja completamente coberto pela cápsula renal. Em seguida, usando o dedo mindinho da mão direita, injete o tecido. Agora use o hemostático fechado para empurrar suavemente o rim de volta ao lugar.

Amarre um ponto no peritônio com um laço duplo, apertando a pele como uma bolsa e, em seguida, coloque-o em dois clipes enrolados. Finalmente, coloque uma gota de PBS em cada olho e coloque o rato de lado em uma gaiola em cima de uma cama. Depois de implantar todos os ratos da mesma maneira, confirme se os animais voltaram a deitar de barriga para baixo antes de deixá-los.

Esta primeira figura mostra uma imagem representativa do implante vivo THI em camundongos humanizados. Nesta figura, é demonstrado o desenvolvimento normal do tecido tímico e a distribuição tecidual fisiológica do CD quatro humano e do CD oito T positivo. Após a reconstituição, os animais carregam um sistema imunológico humano com uma distribuição normal de células T positivas para CD quatro e oito CDs.

Aqui é mostrada uma imagem representativa de um camundongo portador de um tumor de melanoma. As áreas cinzas indicam a imagem da tomografia computadorizada. As áreas coloridas indicam a atividade metabólica do tumor detectada pelo PET scan.

A tomografia computadorizada sozinha neste experimento indicou uma grande massa tumoral na área indicada pelo círculo branco. No entanto, como a imagem PET in vivo ilustra, essa área consiste principalmente em tecido necrótico e cicatricial, ressaltando a utilidade da imagem PET como uma maneira mais sensível e precisa de avaliar a regressão e a eliminação do tumor. Após este procedimento, outros ensaios, como células T, fenotipagem e ativação ex vivo, podem ser realizados para responder a perguntas relevantes sobre a função das células T.