Name: Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprenda a gerar camundongos com sistema imunológico humano engenhado para estudos de imunologia e oncologia. Este método utiliza transplante de timo e células-tronco CD34 para reconstituir respostas imunes anti-tumorais in vivo.

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Gostaríamos de agradecer Alvin Welch e Larry Pang para a sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) prêmio P50 CA086306, o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) subvenções RC1-00149-1 e RS1-00203-1; CIRM Prêmio Nova Faculdade RN2-00902-1 , o Caltech-UCLA Centro Conjunto de Translational Medicine, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, a UCLA Aids Institute, as ferramentas CIRM e Prêmio Tecnologia RT1-01126, ea UC Programa de Pesquisa multicampus e Iniciativas da Califórnia Centro de antiviral Drug Discovery (número MRPI-143226).

<ol><li>McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCID-hu+mouse%3A+murine+model+for+the+analysis+of+human+hematolymphoid+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function.</a> Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).</li>
<li>Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+maintenance+of+SCID-hu+mice+for+HIV+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research.</a> Methods. 12 (4), 343-347 (1997).</li>
<li>Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+functional+human+immune+system+to+mice+with+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency.</a> Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).</li>
<li>Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li>
<li>Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+pre-exposure+prophylaxis+prevents+vaginal+transmission+of+HIV-1+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice.</a> PLoS Med. 5 (1), e16(2008).</li>
<li>Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarectal+transmission%2C+systemic+infection%2C+and+CD4%2B+T+cell+depletion+in+humanized+mice+infected+with+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1.</a> J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).</li>
<li>Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li>
<li>V, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+Latency+in+Humanized+BLT+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice.</a> J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+from+antigen-specific+CD8+T+cells+generated+in+vivo+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O modificado BLT modelo de rato humanizado juntamente com in vivo PET são ferramentas poderosas para estudar doenças crônicas humanos. Este sistema tem o modelo do rato BLT e avança para além do escopo limitado para pesquisa do HIV. Além disso, é um excelente sistema em que podemos examinar diversos protocolos de terapia de genes, bem como técnicas de diagnóstico, antes de poderem atingir o ambiente clínico. Este último acoplado com o baixo custo do uso de ratos contra os primatas torna este modelo muito útil. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> A1049101 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove </td><td></td><td> 12440061 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td></td><td> 16000085 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase tipo IV </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td></td><td> H3506 </td><td></td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10104159001 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Piptazo (Zosyn) </td><td> Pfizer </td><td></td><td> <a href="http://labeling.pfizer.com/showlabeling.aspx?id=416" target="_blank">Piperacilina / tazobactam combinação</a> </td></tr><tr><td> Ficoll (Ficoll-Paque Plus) </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> MACS buffer </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> Veja os comentários </td><td> MACS tampão: PBS suplementado com 0,5% de soro fetal bovino e 2 mM de citrato dextrose fórmula-A </td></tr><tr><td> CD34 microbead Kit </td><td></td><td> 130-046-702 </td><td></td></tr><tr><td> Colunas LS </td><td></td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> Retronectin </td><td> Takara </td><td> T100A </td><td></td></tr><tr><td&gt; Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354263 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluorano </td><td> Baxter </td><td></td><td> <a href="http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html" target="_blank">http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html</a> </td></tr><tr><td> Carprofeno (Rimadyl) </td><td> Pfizer Saúde Animal </td><td></td><td> <a href="https://www.rimadyl.com/default.aspx" target="_blank">https://www.rimadyl.com/default.aspx</a> </td></tr></tbody></table>

utilizando o rato como um blt humanizado baseado stem modelo gene therapy célula tumoral

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Modelos de pequenos animais, como ratos têm sido amplamente utilizados para estudar a doença humana e ao desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas. Apesar da riqueza de informação obtida a partir destes estudos, as características únicas de imunidade do rato, assim como a especificidade de espécie de doenças virais, tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), levou ao desenvolvimento de modelos de ratinhos humanizados. Os modelos anteriores envolveram a utilização de C. B 17 scid / scid ratos e o transplante de timo fetal humano e de fígado fetal denominados tua / liv (SCID-hu) 1, 2 ou a transferência adoptiva de leucócitos do sangue periférico humano (huPBL-IDCG ) 3. Ambos os modelos foram utilizados principalmente para o estudo da infecção por HIV. Uma das limitações principais de ambos os modelos foi a falta de reconstituição estável de células imunitárias na periferia para torná-los um modelo mais fisiologicamente relevante para estudar a doença de HIV. Para este fim, o zumbido BLTmodelo do rato anized foi desenvolvido. BLT significa medula óssea / fígado / timo. Neste modelo, de 6 a 8 semanas de idade NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) ratinhos imunocomprometidos receber o implante tua / liv como no modelo de ratinho SCID-hu apenas a ser seguido por um segundo transplante de células-tronco hematopoiéticas humanas 4. A vantagem deste sistema é a reconstituição completa do sistema imune humano na periferia. Este modelo foi utilizado para estudar a infecção por HIV e de latência 5-8. Nós geramos uma versão modificada do modelo em que usamos geneticamente modificados células-tronco hematopoiéticas (HHSC) para construir o implante teu / liv seguido de injeção de transduzidas autólogo HHSC 7, 9. Esta abordagem resulta na geração de linhagens geneticamente modificados. Mais importante ainda, adaptou-se este sistema para examinar o potencial de gerar funcionais As células T citotóxicas (CTL) que expressam um receptor de melanoma de células T específico. Usando esse modelo, pudemos avaliar a funcionalidade do nosso CTL transgênico vivo utilizando tomografia por emissão de tomografia (PET) para determinar a regressão do tumor (9). O objetivo deste protocolo é o de descrever o processo de gerar esses camundongos transgênicos e avaliação de eficácia in vivo utilizando imagens de PET ao vivo. Como uma nota, uma vez que usamos tecidos humanos e vetores lentivirais, nossas instalações estão em conformidade com as diretrizes do CDC NIH para o Nível de Biossegurança 2 (BSL2) com precauções especiais (BSL2 +). Além disso, os ratos do NSG são severamente imunocomprometidos, assim, a sua habitação e manutenção devem estar de acordo com os mais elevados padrões de saúde ( <a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a> ).

Um diagrama de fluxo do processo de transplante é mostrado na Figura 1A. Uma imagem do implante teu / liv é mostrado na Figura 1B. O tecido tímico desenvolve normalmente e tem uma distribuição fisiológica de CD4 humano e células T CD8. Após a reconstituição, os animais carregam um sistema imune humano com distribuição normal de CD4, CD8, células T e outras linhagens de células imunes. A discrepância entre o tamanho do tumor e do tecido vivo é mostrada na <st...

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Modelos de animais pequenos, como camundongos, têm sido amplamente utilizados para estudar doenças humanas e desenvolver novas intervenções terapêuticas. Apesar da abundância de...

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar camundongos portadores de um sistema imunológico humano modificado. Isso é alcançado primeiramente preparando o camundongo para cirurgia e, em seguida, carregando o trocarte com um fragmento de timo na segunda etapa. O Matrigel é misturado com células transduzidas CD34 negativas e CD34 positivas, e a mistura é então adicionada ao trocarte.Em seguida, os constructos de matrigel são transplantados sob a cápsula renal. Em última análise, a rejeição dos tumores-alvo pelos linfócitos T CD8 geneticamente modificados pode ser monitorada por imagem por PET in vivo e por medições físicas do tumor. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como modelos totalmente imunodeficientes, é que este método permite o estudo do desenvolvimento de células-tronco humanas geneticamente modificadas dentro do timo humano e a subsequente avaliação da eficácia in vivo das linhagens derivadas. O procedimento será demonstrado por três técnicos de nossos laboratórios: Gregory Bristol, Bernard Levin e Sean Kim.Neste diagrama esquemático, está ilustrado o modelo BLT modificado utilizado nestes estudos para a geração de camundongos quimér

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o método para gerar um camundongo BLT ósseo humanizado duplo (medula, fígado e timo) com um sistema imunológico humano funcional e um microbioma intestinal humano enxertado estável.

Gerando um modelo de camundongo BLT (medula óssea, fígado, timo) duplamente humanizado

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Aqui, apresentamos um novo modelo de fígado de camundongo humanizado gerado em camundongos knockout celular mediado por receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID após o transplante de células-tronco hepáticas humanas imaturas e expansíveis.

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

As células estaminais são portadores terapêuticos promissores para tratar tumores cerebrais devido ao seu tropismo intrínseco de tumor. A entrega de células estaminais intranasais não invasivas ultrapassa a barreira hematoencefálica e demonstra um forte potencial de tradução clínica. Este artigo resume os princípios básicos da administração de células estaminais intranasais em um modelo de glioma de mouse.

Entrega intranasal de células-tronco terapêuticas para Glioblastoma em um modelo de mouse

Nós descrevemos um método novo para gerar os BLT-ratos humanizados dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como enxertado estável do intestino. Este protocolo pode ser seguido sem a necessidade para ratos germe-livres ou facilidades gnotobióticos.

Um duplo humanizado BLT-MICE modelo caracterizando um estável humano-como o intestino Microbiome e sistema imunológico humano

Este protocolo descreve a geração de camundongos do sistema imunológico humano (HIS) para estudos de imuno-oncologia. Instruções e considerações sobre o uso deste modelo para testes de imunoterápicos humanos em tumores humanos implantados neste modelo são apresentadas com ênfase na caracterização da resposta do sistema imune humano ao tumor.

Testando imunoterápicos contra o câncer em um modelo humanizado de camundongo com tumores humanos

A utilização de um modelo de tumor autóctone imunocompetente conduzido por mutações comuns de pacientes para testes pré-clínicos é fundamental para testes imunoterapêuticos. Este protocolo descreve um método para gerar modelos de tumor cerebral em camundongos usando a entrega baseada em eletroporação de DNA plasmidial que representa mutações comuns em pacientes, fornecendo assim um modelo de camundongo preciso, reprodutível e consistente.

Modelando Tumores Cerebrais In Vivo Usando a Liberação Eletroporada de DNA Plasmidial Representando Assinaturas de Mutação de Pacientes

O objetivo desse protocolo é fornecer aos pesquisadores uma técnica altamente reprodutível para implantações intracranianas.

Implantação intracraniana estereotáxica de linhagens celulares de xenoenxerto derivadas de Glioblastoma em Pacientes

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

Aprenda a gerar camundongos com sistema imunológico humano engenhado para estudos de imunologia e oncologia. Este método utiliza transplante de timo e células-tronco CD34 para reconstituir respostas imunes anti-tumorais in vivo.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

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