Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais

O objetivo geral deste procedimento é derivar uma população de progenitores neuronais purificados dos gânglios do sistema nervoso periférico. Isso é feito dissecando primeiro o órgão ou gânglios específicos de interesse de camundongos fetais. Os tecidos são então parcialmente dissociados para liberar as células individuais no meio circundante.

Em seguida, a suspensão celular é filtrada para remover quaisquer aglomerados de tecido residual ou agregados grandes. Finalmente, a suspensão celular é classificada por fluxo para isolar a população de interesse com base na expressão de um repórter fluorescente nessa população de células. Em última análise, os padrões de expressão gênica podem ser comparados entre progenitores, isolados em diferentes estágios de desenvolvimento, ou entre populações purificadas de diferentes tipos de células neuronais.

A principal vantagem dessa técnica sobre o isolamento de populações de células com base na marcação de anticorpos é que muitas vezes os imunorreagentes não estão disponíveis. Que rotulam as células que expressam um gene específico, linhagens geneticamente modificadas de camundongos que produzem proteína fluorescente em subconjuntos neuronais discretos permitem o isolamento dessas populações de células. Embora demonstremos esse método para isolamento de progenitores neurais do intestino e do rastreamento de neurógenos da boca, ele também pode ser aplicado a outros sistemas modelo que expressam repórteres fluorescentes.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque tendem a digerir demais os tecidos de origem, resultando em uma perda de viabilidade celular. Antes de iniciar a dissecção, visualize os embriões por iluminação de campo claro para garantir que as estruturas relevantes estejam em foco. Em seguida, identifique os embriões positivos para transgene rastreando a expressão do repórter fluorescente usando um microscópio estéreo fluorescente.

Após a eutanásia, os embriões começam adicionando uma quantidade mínima de PBS à placa de dissecação, para que o embrião não flutue enquanto os tecidos são dissecados. Abra a pele do embrião ao longo dos lados do corpo e através do abdômen ao nível do fígado. Role o embrião de costas e use uma pinça fina para prendê-lo no lugar.

No nível do membro anterior, insira outro par de pinças no nível do diafragma e, em seguida, rapidamente. Puxe os órgãos internos para baixo em direção à cauda e para longe da parede dorsal do corpo para remover as vísceras do fígado até o tubérculo genital. Se algum órgão da cavidade torácica, como o coração ou os pulmões, sair preso às vísceras, remova-o antes de prosseguir.

Uma vez que as vísceras abdominais estejam separadas da carcaça, insira um par de pinças abaixo do fígado, perto do estômago, e gentilmente afaste o fígado do intestino. Em seguida, disseque cuidadosamente o intestino posterior da uretra dorsal e remova o intestino do trato urogenital. Finalmente, vire o intestino para que o baço fique visível sob o estômago.

Remova o baço e o pâncreas. Separe as alças do intestino segurando a mesentary. Em seguida, retire a mesícula e a vasculatura que a acompanha do intestino, puxando suavemente a mesentália.

Evite segurar o intestino diretamente com a pinça. Se o intestino quebrar, apenas junte as peças separadas no estágio de dissociação. Agrupe cada tipo de tecido em um tubo cônico de 15 mililitros contendo HBSS gelado de acordo com o tipo de tecido e o tipo de fenótipo do embrião.

Após a peletização, os tecidos subdissecados aspiram o máximo possível de HBSS. Em seguida, ressuspenda o pellet de tecido em um a vários mililitros de ACU max. Troca de ponteiras de pipeta entre cada amostra.

Para evitar a contaminação cruzada dos tipos de tecido, coloque os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 a 45 minutos. Dependendo do estágio do tecido que está sendo isolado, a dissociação e a filtragem do tecido são a parte mais complicada do procedimento para evitar a dissociação evidente do tecido. E, como resultado, baixa viabilidade celular.

Limite o tempo de dissociação e não tente dissociar completamente todos os pedaços de tecido na metade. E no final do tempo de dissociação, quebre manualmente o tecido batendo vigorosamente o tubo contra a lateral do banho-maria e arremessando o tubo para baixo com um movimento de pulso de estalo. Agora mova as amostras dissociadas para o gelo e adicione imediatamente um mililitro de têmpera recém-preparada a cada tubo usando uma nova ponta de pipeta para cada amostra, tri a amostra para cima e para baixo até que o tecido esteja quase completamente dissociado.

Agora, usando um par de pinças esterilizadas com etanol, coloque um quadrado de três centímetros de membrana de malha de náilon de 38 mícrons sobre a boca de um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, use pontas de furo estreito para filtrar a solução de célula ressuspensa individual através da malha, pipetando no centro da membrana. Uma vez filtrada a suspensão celular, lavar o tubo de recolha com um mililitro de têmpera de um a cinco e filtrar as células restantes.

Em seguida, remova a membrana tomando cuidado para evitar que amostras de tecido não filtradas entrem no tubo. Após a peletização, as suspensões celulares aspiram o sobrenadante e ressuspendem o pellet em um mililitro de têmpera de um a cinco. Em seguida, filtre cada suspensão celular através de uma malha de náilon em tubos de poliestireno de cinco mililitros, como acabamos de mostrar.

Comece reservando uma pequena alíquota da amostra de fluorescência para o controle de compensação apenas EGFP. Em seguida, divida a amostra de tecido do tipo selvagem em duas porções, rotulando apenas um tipo selvagem e as outras sete A, a d. Apenas. Agora encha todos os tubos de amostra com têmpera de um a cinco e, após a peletização das amostras, aspire todos, exceto os últimos 200 microlitros de sobrenadante em cada tubo.

Finalmente, adicione sete a a d às amostras a serem classificadas e os sete a a d apenas controle. Em seguida, adicione 0,75 mililitros de triazol LS à microcentrífuga de 1,5 mililitro. Os tubos de coleta de amostras começam usando as amostras de controle para definir os parâmetros de compensação e portas para evitar sete células mortas positivas A a D e coletar células exibindo uma alta intensidade de fluorescência GFP.

Depois de definir os parâmetros de compensação, comece a classificar na pressão mais baixa possível com um bico de furo largo e baixa vazão. Colete no máximo 25.000 células em cada tubo de microcentrífuga para que o triol LS não seja diluído demais. Imediatamente após o vórtice de classificação, cada tubo de células capturado no triol ls.

Nesta primeira figura, um trato genital europeu de montagem inteira 15,5 dias após o coito visto ventralmente sob iluminação de campo claro é mostrado aqui. A mesma amostra é vista sob iluminação de fluorescência Para demonstrar a distribuição de células positivas para EGFP nos gânglios celíacos adrenais e medialmente localizados, conforme identificado por sua expressão transgênica TH EGFP. Esta visão lateral de uma bexiga subdissecada de 15,5 dias pós-cotus TH EGFP mostra fluorescência da expressão do transgene nos gânglios pélvicos, na parede da bexiga e na uretra.

Nesta visão dorsal do mesmo EGFP, as células positivas são evidentes na dissociação do tecido da uretra dorsal anterior para produzir suspensões celulares para classificação de fluxo é um equilíbrio delicado entre a digestão enzimática adequada e evitar a digestão excessiva que pode resultar em baixas variabilidades celulares. Essas micrografias fotográficas mostram o trato urogenital inferior e os tecidos intestinais na metade do tempo de dissociação. Como visto nessas fotos de tecido adequadamente digerido antes e depois do manual, três pedaços de órgãos subdissecados ainda são claramente evidentes em tecidos que são tratados enzimaticamente por muito tempo ou com uma concentração muito alta de enzima.

No entanto, a suspensão resultante carece de grandes pedaços residuais de tecido dissociação apropriada e a filtragem manual produz perfis de citometria de fluxo que normalmente exibem células viáveis superiores a 90% e as células que expressam o repórter nesta população viável, as células retêm a expressão de EGFP de alta intensidade. A população negra é composta de células únicas que estão mortas e marcadas pela captação de sete matrizes de fluorescência. A população cinza é composta de células singlete baseadas na dispersão direta e lateral que excluíram sete a a d e, portanto, são viáveis.

A população verde é da área fechada positiva para GFP e é composta por células viáveis únicas que excluíram sete A a d e que exibem fluorescência EGFP. Com este procedimento, o isolamento de progenitores neuronais de outros tecidos periféricos, como a cadeia simpática, raiz dorsal, gânglios ou pulmão, pode ser realizado para responder a perguntas sobre diferenças nos perfis de expressão gênica entre populações ou sobre o desenvolvimento de linhagens distintas.