Name: Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a imaginar o comportamento de células únicas de diferentes linhagens de levedura sob condições dinâmicas idênticas usando um dispositivo microfluídico de duas camadas. Este método evita contaminação cruzada.

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YG é apoiado por uma bolsa de estudos do BID. IN é um companheiro Alon e um colega da faculdade da J Edmond ‭. ‬ Safra Centro de Bioinformática da Universidade de Tel Aviv ‭. ‬ Esta pesquisa foi apoiada pela ISF concessão 1499-1410.

1. Criando um Mestre Scotch-5 <ol><li> Desenhar ou imprimir desejado disposição de microcanais, à escala, no papel. No nosso caso, o desenho consiste em dois canais em forma de Y, cada uma com 3 mm de largura (Figura 2). </li><li> Cobrir uma lâmina de vidro com camadas de fita adesiva. O número de camadas irá determinar a altura do canal (cerca de 60 mM por camada). Foram usados ​​3 camadas de fita adesiva. </li><li> Coloque o projeto de layout em uma superfície plana. Alinhe o slide sobre o padrão de design. Cuidadosamente cortar a fita na lâmina de vidro com um bisturi de acordo com o layout. </li><li> Retire a fita adesiva de todas as regiões da lâmina de vidro, exceto aqueles no layout do microcanal. </li><li> Colocar as lâminas em um forno de aquecimento a 65 ° C durante 2-3 min. Limpar cuidadosamente com etanol. </li></ol> 2. A fabricação de um dispositivo micro PDMS <ol><li> Misturar a base e os componentes de cura de PDMS, tal como recomendado pelo fabricante. Nós usamos uma mistura 10:1proporção da base para o agente de cura. Verter cerca de 30 ml da mistura de PDMS em uma placa de Petri a uma altura de ~ 0,5 cm. Desgasificar o PDMS em vácuo, se necessário. Corrediça submergir o vidro no PDMS com a fita Scotch padronizada voltada para cima. Colocar o padrão após o PDMS, evita a formação de bolhas de ar entre a corrediça e inferior do prato. Curar durante 48 horas a 65 ° C, garantindo que o prato está horizontal utilizando um nível de bolha. </li><li> Num prato de 90 milímetros novo Petri despeje 3 ml de mistura de PDMS, o que resulta em uma camada de cerca de 0,5 mm de profundidade. (Se um revestidor de rotação estiver disponível, ele pode ser usado para esta fase). </li><li> Degas e curar, como em 2.1. </li><li> Gentilmente cortar o dispositivo micro para o tamanho desejado com um bisturi. Esta camada será chamado de &quot;camada de fluxo&quot;. </li><li> Corte um pedaço do mesmo tamanho de fina camada de PDMS da placa de Petri segundo. Isto irá ser chamado de &quot;camada poços&quot;. </li><li> Usar um perfurador de biópsia de tamanho apropriado (Usamos 1,2 mm ID) para os furos para as entradas e as saídas da camada de fluxo. </li&gt; <li> Coloque a camada poços numa lâmina de vidro de espessura sobre a topografia e perfurador de poços, utilizando 2 mm ID perfurador de biópsia, em alinhamento com os microcanais no layout. </li><li> Limpar ambas as camadas de PDMS, bem como uma lamela de vidro de 24 mm x 60 mm com etanol. Ar seco e manter limpo. </li><li> Plasma tratar tanto a lamela de vidro e da camada de PDMS poços usando etcher plasma padrão (para ligação não-reversível) ou de um tratador de mão corona 6 para ligação reversível. Coloque cuidadosamente a camada de poços em cima da lamela para provocar a adesão (Figura 3). Esfregue suavemente para fora todas as bolhas de ar (se necessário). </li></ol> 3. Experimento imagens de células <ol><li> Certifique-se de que você tem a mídia desejada pronto em seringas apropriadas ligadas a tubos flexíveis de plástico com diâmetro interno de 0,02 &quot;(Tygon) na bomba de seringa. </li><li> Crescer S. cerevisiae para a fase desejada de YPD líquido. Vortex completamente e local μ 300l de cada estirpe num tubo de microcentrífuga. </li><li> Coloque suavemente 1 ul de Concanavalina A (Sigma) 2 mg / ml em cada poço. Lavar Concanavalina excesso Um de cada poço duas vezes com cuidado pipetando água. </li><li> Enquanto a Concanavalina A secagem é, estirpes lavar duas vezes com 300 ul de meio sem glicose SC. Lavagem glucose residual das paredes das células contribui para a aderência adequada Concanavalina A. </li><li> Células Vortex cuidadosamente. Pipetar 0,75 jil ou menos de cada suspensão de células no seu próprio bem (Figura 3). Gentilmente lavar células residuais com meio rico. Os dois passos seguintes devem ser realizadas rapidamente, a fim de evitar que as células se esgote. </li><li> Plasma tratar o chip e os poços, cuidadosamente, com o tratador de mão corona, tomando cuidado para não bater os poços diretamente. Com cuidado, coloque o chip nos poços, prestando muita atenção ao alinhamento entre os dois (este passo pode ser feito sob um estereoscópio). Pressione suavemente a aderir as duas camadas de PDMS. Encher lentamente o dispositivo completamente com cerca de 50 ul de meio rico, certificando-se de nenhuma bolha de ar é deixado no interior do canal. </li><li> Conectar o dispositivo, inserindo os tubos para as entradas adequadas e iniciar o fluxo de mídia. Ter cuidado para que nenhuma bolha de ar são introduzidas no dispositivo, tal como estas podem ser difíceis de remover, isto pode ser conseguido através de desconectar uma entrada ou saída e batendo suavemente no dispositivo em que as bolhas são, tendo cuidado para não romper a lamela de vidro. </li><li> Colocar sob microscópio e encontrar os pontos de imagem apropriados em cada poço. </li><li> Manter as células sob fluxo de meio rico durante 1 hora ou mais para permitir a recuperação, se necessário. </li><li> Iniciar a experiência: usamos fluxo constante de cada uma das duas bombas de seringa para impedir o refluxo dos meios de comunicação, alterando as taxas de fluxo relativas, como desejado. Configuração da bomba A a 0,8 ml / hr e B da bomba para 0,2 ml / hr resulta em meio A que flui ao longo de 80% da largura do canal (Fig. 4). Isto pode ser dinamicamente cpendurado alterando os dois caudais. As novas condições estabilizar dentro de segundos ao longo de todo o comprimento do canal 2. </li></ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo, apresentamos um método de bancada simples para criar um dispositivo micro que permite seguintes cepas de leveduras simultaneamente vários em condições dinâmicas. Na sequência de várias estirpes de um canal fornece uma ferramenta fiável para comparar dinâmica de respostas de células individuais em várias estirpes. Uma vantagem da nossa abordagem é a capacidade para fabricar o dispositivo com técnicas simples sem a necessidade de uma sala limpa. Na verdade, nós também realizaram o protocolo pulando as operaç...

As células são constantemente reagindo a um ambiente de alterar dinamicamente, alterando o seu metabolismo, o perfil de transcrição e funções celulares. Para estudar estes fenômenos, os métodos capazes de quantificar essas mudanças são necessárias. Um tipo de leitura para tais respostas é a mudança de localização de factores de transcrição relacionados com stress, em resposta ao stress nutricional. Microfluídico dispositivos 1 ter sido usado para manipular dinamicamente as condições ambientais para as células 2-4. Eles apresentam várias vantagens para imagens de células vivas: o ambiente do que as células podem ser controladas com precisão e alterados dinamicamente, as células podem estar vivas, com imagens em todas as vezes, incluindo durante a manipulação das condições externas, e os volumes de reagentes mínimos são obrigatórios. Uma concepção muito simples para um dispositivo de microfluidos, que permite a alternância entre duas condições, é um dispositivo em forma de Y 2. Nós usam rotineiramente em forma de Y dispositivos microfluídicos que permitemaplicação de mudanças dinâmicas para as células do canal. Usamos este dispositivo para acompanhar as mudanças de localização de fluorescente etiquetado estresse fatores de transcrição relacionados em células de levedura. Nós seguimos essas mudanças sob novas condições nutricionais. Por exemplo, pode-se fornecer um impulso (ou uma série de impulsos) de glucose contendo meio dentro de um período de não-glicose média, com uma resolução muito fina temporal. Muitas vezes, em tais experiências, um está interessado em comparar as respostas de linhagens celulares diferentes (por exemplo, os mutantes diferentes, ou diferentes isolados selvagens). O canal em forma de Y é limitada a uma estirpe de cada um dos canais - se mais do que uma estirpe é utilizado, não há nenhuma maneira simples para distinguir entre as estirpes. Para superar isto, os canais podem ser usados ​​diferentes. Se quiser aplicar as mesmas condições dinâmicas para várias cepas, gostaríamos de combinar o conceito Y canais com múltiplos canais. Existem dois desafios na implementação desta solução: Pode ser difícil de aplicar tele mesmas condições, ao mesmo tempo para todos os canais, e não é uma limitação geométrica do número de canais de Y que podem ser montados em um único dispositivo. Fomos, pois, procurando uma maneira para visualizar várias linhagens em um canal em condições dinâmicas. Descrevemos aqui um dispositivo de duas camadas destinado a microfluídico estirpes de imagens múltiplas em um canal, nas mesmas condições dinâmicas. A camada inferior é constituída por PDMS fina com uma fileira de furos. Esta camada está ligada à lamela de vidro de furos em que irá colocar as diferentes estirpes, aderindo-as com concanavalina A para o vidro. A segunda camada é um dispositivo em forma de Y microfluídico criados usando o método da fita adesiva 5. Depois de colocar as estirpes nas cavidades da segunda camada é rapidamente alinhados e ligados com a primeira, a criação de um canal com vários poços que contêm as diferentes estirpes. Este dispositivo permite a última sequência de várias estirpes de um canal, onde todosestirpes são submetidos às mesmas condições, no momento exacto mesmo. Este conjunto e processo de produção pode ser feito sobre a bancada, usando meios simples, sem litografia suave.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> PDMS-184 SYLGARD </td><td> Dow Corning EUA </td><td></td></tr><tr><td> Exsicador de vácuo </td><td> Nalgene </td><td> 5310-0250 </td></tr><tr><td> Biópsia perfuradores </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15,074 (1,2 mm) </td></tr><tr><td> Bombas de seringa </td><td> Chemyx </td><td> Fusão 200 </td></tr><tr><td> Corona tratador </td><td> Electro-técnica produtos </td><td> BD-20 </td></tr><tr><td> Tubagem Tygon </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Concanavalina-A </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> Fita adesiva </td><td> 3M Scotch </td><td> Fita Transparente 1/2 &quot; </td></tr></tbody></table>

um dispositivo micro para o estudo múltiplas linhagens distintas

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

O estudo de respostas de células para as alterações ambientais coloca muitos desafios experimentais: as células têm de ser trabalhada sob condições variáveis, muitas vezes, de uma forma comparativa. Placas com vários poços são usados ​​rotineiramente para comparar várias espécies diferentes ou linhas de células, mas permitem um controle limitado sobre a dinâmica do ambiente. Dispositivos microfluidicos, por outro lado, permite o controle dinâmico requintado nas condições do ambiente, mas é um desafio para imagem e distinguir mais do que algumas estirpes neles. Aqui nós descrevemos um método para facilmente e rapidamente fabricar um dispositivo micro capaz de aplicar condições de alterar dinamicamente a várias cepas de leveduras distintas em um canal. O dispositivo está concebido e fabricado por meios simples, sem necessidade de litografia suave. É composto por um canal de fluxo em forma de Y ligado a uma segunda camada portadora micropoços. As estirpes são colocados em micropoços separados, e visualizados sob as mesmas condições dinâmicas. Nós demonstrate a utilização do dispositivo para a medição das respostas de localização de proteínas de pulsos de alterações de nutrientes em diferentes estirpes de levedura.

Para demonstrar a separação entre as diferentes estirpes que imaged duas estirpes de levedura distinguíveis em poços alternados. Imagiologia dos poços cheio mostra nenhuma fuga de células entre os poços (Figura 5a, b). Ambas as estirpes possuem o factor de transcrição MSN2 marcado com YFP. Para testar o efeito simultâneo de alterar dinamicamente condições, as taxas de fluxo ligado em dois canais de entrada, criando um passo de não-glicose média, o que resultou na localização de MSN2-YFP ao núcleo <stron...

Apresenta-se um método simples para a produção de dispositivos microfluídicos capazes de aplicar semelhantes condições dinâmicas de múltiplas linhagens distintas, sem a necessidade de uma sala de limpeza ou de litografia suave.

Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

O estudo das respostas celulares a mudanças ambientais apresenta diversos desafios experimentais: as células precisam ser imageadas sob condições variáveis, frequentemente em um...

O objetivo geral do método a seguir é imaginar o comportamento de células individuais de diferentes cepas de levedura sob as mesmas condições dinâmicas. Isso é alcançado pela fabricação de um dispositivo microfluídico de duas camadas, na qual a camada inferior conterá separadamente cada uma das diferentes cepas, e a camada superior proporcionará as condições de fluxo dinâmico em um segundo passo. Diferentes cepas de levedura são colocadas nos poços e o dispositivo é fechado, criando um único canal com múltiplas cepas separadas.Em seguida, registramos as respostas celulares a alterações dinâmicas do meio. Ao controlar as taxas de fluxo nas duas entradas do Canal Y, os resultados demonstram diferentes cepas submetidas às mesmas condições dinâmicas e ausência de contaminação cruzada entre poços. Este dispositivo microfluídico apresenta diversas vantagens principais em comparação com outros sistemas existentes. Ele permite o registro de imagens de múltiplas cepas distintas sob as mesmas condições dinâmicas.Além disso, é importante destacar que ele pode ser facilmente fabricado em qualquer laboratório, sem necessidade de equipamentos especiais. A origem deste método surgiu a partir de discussões sobre como acompanhar as respostas de diferentes isolados selvagens de levedura à passagem por inanição. Inicialmente, desenhe ou imprima o layout desejado dos microcanais em escala.Em seguida, cubra uma lâmina de vidro com camadas de fita adesiva transparente. Para atingir a altura desejada do canal, coloque o desenho do layout sobre uma superfície plana e alinhe a lâmina sobre o padrão do desenho. Agora, corte cuidadosamente a fita na lâmina de vidro de acordo com o layout. Remova a fita adesiva transparente de todas as regiões da lâmina de vidro.Posicione aqueles no arranjo do microcanal. Coloque a lâmina em uma estufa aquecida a 65 graus Celsius por três minutos. Em seguida, limpe suavemente com etanol.Misture os componentes base e de cura do PDMS conforme recomendado pelo fabricante. Despeje cerca de 30 mililitros da mistura de PDMS em uma placa de Petri até uma altura de aproximadamente 0,5 centímetro. Desgaseifique o PDMS sob vácuo, se necessário.Submerja a lâmina de vidro no PDMS com a fita adesiva gravada voltada para cima. Colocar o padrão após o PDMS evita a formação de bolhas de ar entre a lâmina e o fundo do recipiente. Cure por 48 horas a 65 graus Celsius, certificando-se de que o recipiente esteja na posição horizontal usando um nível de bolha em um novo recipiente de Petri de 90 milímetros. Despeje três mililitros da mistura de PDMS.Esta etapa pode ser realizada em um spin coder, se disponível. DGAs e cura conforme mostrado anteriormente. Agora, corte cuidadosamente a camada de fluxo do dispositivo microfluídico no tamanho desejado com um furador de biópsia.Crie orifícios para as entradas e saídas na camada de fluxo. Corte também uma camada de poços de tamanho semelhante do segundo recipiente de Petri e coloque-a sobre um vidro grosso. Deslize sobre o layout do design.Em seguida, perfure os poços alinhados aos microcanais no layout utilizando etanol, limpe ambas as camadas de PDMS e uma lamínula de vidro e deixe secar ao ar. A seguir, trate a lamínula de vidro e a camada de poços de PDMS com um gravador de plasma padrão para ligação não reversível ou com um tratador de corona portátil para ligação reversível. Coloque cuidadosamente a camada de poços sobre a lamínula para promover a adesão.Removendo suavemente quaisquer bolhas de ar. Prepare o meio desejado em seringas apropriadas e conecte à tubulação tigon passada por uma bomba de seringa. Para imagem celular.Utilize as concentrações. Vá para a fase desejada, vorte o cultivo completamente e transfira 300 microlitros para tubos de microcentrífuga. Coloque suavemente um microlitro de con canna A em cada poço da camada de poços de PDMS.Lave o excesso de conna A de cada poço duas vezes, pipetando água suavemente enquanto o con em A estiver secando. Lave as cepas duas vezes com 300 microlitros de meio SC sem glicose. A remoção da glicose residual das paredes celulares ajuda na aderência adequada ao conval.Após a vorticização, pipete cuidadosamente aproximadamente 0,5 microlitros da suspensão celular em poços individuais. Lave suavemente as células residuais com meio rico. Os próximos dois passos precisam ser realizados rapidamente para evitar que as células sequem.Como um passo opcional, trate o chip e os poços, tomando cuidado para não atingir diretamente os poços. Em seguida, sob um estereoscópio, coloque cuidadosamente o chip sobre os poços, prestando muita atenção no alinhamento entre os dois. Pressione suavemente para aderir as duas camadas de PDMS.Encha lentamente o dispositivo completamente com cerca de 50 microlitros de meio rico, certificando-se de que não fiquem bolhas de ar dentro do canal. Agora, conecte o dispositivo inserindo os tubos nas entradas apropriadas e inicie o fluxo do meio. Tenha cuidado para que não se formem bolhas de ar nos tubos, pois elas podem ficar presas no dispositivo e interromper o fluxo.Prossiga colocando o dispositivo sob um microscópio e localize pontos apropriados para imagem em cada um. Mantenha as células sob fluxo rico e médio por uma hora ou mais, se necessário, para permitir a recuperação.Inicie o experimento com a configuração de fluxo constante. A bomba A para 0,8 mililitros por hora e a bomba B para 0,2 mililitros por hora. Para o meio A fluindo por 80% da largura do canal.Podemos alterar dinamicamente as condições no dispositivo modificando as taxas de fluxo relativas. As novas condições se estabilizam em segundos ao longo de todo o canal. Para demonstrar a separação entre diferentes cepas, duas cepas distintas de levedura são visualizadas em poços alternados.Observe que não há vazamento celular entre os poços neste experimento. Ambas as linhagens possuem o fator de transcrição MSN dois marcado com YFP para testar o efeito simultâneo de condições dinamicamente variáveis. As taxas de fluxo nos dois canais de entrada foram alteradas para criar um degrau de meio sem glicose.Isso resultou na localização da MSN dois no núcleo. Importante, a análise do rastreamento temporal dos níveis de MSN dois YFP no núcleo em células individuais pode ser realizada. Assim, o dispositivo microfluídico de PDMS pode ser usado para aplicação de condições dinâmicas simultâneas em múltiplas poças.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não deixar as células secarem durante a montagem do dispositivo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada facilmente sem necessidade de litografia macia.

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