Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

O objetivo geral do método a seguir é obter imagens do comportamento de células individuais de diferentes cepas de levedura sob as mesmas condições dinâmicas. Isso é conseguido fabricando um dispositivo microfluídico de duas camadas, ou a camada inferior conterá cada uma das diferentes cepas separadamente, e a camada superior fornecerá as condições de fluxo dinâmico como uma segunda etapa. Diferentes cepas de levedura são colocadas nos poços e o dispositivo é fechado, criando um único canal com várias cepas separadas.

Em seguida, imaginamos as respostas das células às mudanças dinâmicas do meio Ao controlar as taxas de fluxo nas duas entradas do Canal Y, os resultados mostram diferentes cepas sujeitas às mesmas condições dinâmicas e sem contaminação cruzada entre os poços. Este dispositivo microfluídico tem várias vantagens importantes sobre outros sistemas existentes. Ele permite a aquisição de imagens de várias cepas distintas sob as mesmas condições dinâmicas.

Além disso, é importante ressaltar que pode ser fabricado facilmente em qualquer laboratório, sem a necessidade de equipamentos especiais. O método surgiu da discussão sobre como seguir as respostas de diferentes isolados selvagens do Oriente a passes de fome. Inicie, desenhe ou imprima o layout de microcanal desejado para dimensionar.

Em seguida, cubra uma lâmina de vidro com camadas de fita adesiva Para atingir a altura desejada do canal, coloque o design do layout em uma superfície plana e alinhe a lâmina sobre o padrão de design. Agora corte cuidadosamente a fita na lâmina de vidro de acordo com o layout. Remova a fita adesiva de todas as regiões da lâmina de vidro.

Aceite-os no layout do microcanal. Coloque a lâmina em um forno de aquecimento a 65 graus Celsius por três minutos. Em seguida, limpe suavemente com etanol.

Misture a base e os componentes de cura do PDMS conforme recomendado pelo fabricante. Despeje cerca de 30 mililitros da mistura PDMS em uma placa de Petri a uma altura de aproximadamente 0,5 centímetros. Desgaseifique o PDMS no vácuo, se necessário.

Mergulhe a lâmina de vidro no PDMS com a fita adesiva estampada voltada para cima. Colocar o padrão após o PDMS evita a formação de bolhas de ar entre a lâmina e o prato Cura inferior por 48 horas a 65 graus Celsius, certificando-se de que o prato esteja na horizontal usando um nível de bolha em uma nova placa de Petri de 90 milímetros. Despeje três mililitros da mistura PDMS.

Esta etapa pode ser feita em um codificador de rotação, se disponível. DGAs e cura como mostrado anteriormente. Agora corte suavemente a camada de fluxo do dispositivo microfluídico no tamanho desejado com um perfurador de biópsia.

Crie furos para as entradas e saídas na camada de fluxo. Corte também uma camada de poços de tamanho semelhante da segunda placa de Petri e coloque em um copo grosso. Deslize sobre o layout do design.

Em seguida, perfure os poços em alinhamento com os microcanais no layout usando etanol, limpe as duas camadas de PDMS e uma lamínula de vidro e seque ao ar. Em seguida, trate a lamínula de vidro e a camada de poços PDMS com gravador de plasma padrão para colagem não reversível ou um tratador corona portátil para colagem reversível. Coloque cuidadosamente a camada de poços em cima da lamínula para causar aderência.

Esfregue suavemente quaisquer bolhas de ar. Prepare o meio desejado em seringas apropriadas e conecte ao tubo tigon rosqueado através de uma bomba de seringa. Para imagens celulares.

Use pontos fortes. Vá para a fase desejada, vortex a cultura completamente e transfira 300 microlitros para tubos de microcentrífuga. Coloque suavemente um microlitro de con canna A em cada poço da camada de poços PDMS.

Lave o excesso de conna A de cada poço duas vezes, pipetando suavemente a água enquanto o con em A está secando. Lave as cepas duas vezes com 300 microlitros de meio SC sem glicose. A lavagem da glicose residual das paredes celulares ajuda na aderência adequada ao conval.

Em um vórtice posterior, as células pipetam completamente aproximadamente 0,5 microlitros da suspensão celular em poços individuais. Lave suavemente as células residuais com meio rico. As próximas duas etapas precisam ser executadas rapidamente para evitar que as células sequem.

Como um plasma de etapa opcional, trate o cavaco e os poços tomando cuidado para não atingir os poços diretamente. Em seguida, sob um estereoscópio, coloque cuidadosamente o chip nos poços, prestando muita atenção ao alinhamento entre os dois. Pressione suavemente para aderir as duas camadas de PDMS.

Encha lentamente o dispositivo completamente com cerca de 50 microlitros de meio rico, certificando-se de que não haja bolhas de ar dentro do canal. Agora conecte o dispositivo inserindo os tubos nas entradas apropriadas e inicie o fluxo de mídia. Tome cuidado para que não se formem bolhas de ar na tubulação, pois elas podem ficar presas no dispositivo e destruir o fluxo.

Prossiga para colocar o dispositivo sob um microscópio e encontre os pontos de imagem apropriados em cada um. Bem, mantenha as células sob fluxo rico e médio por uma hora ou mais, se necessário. Para permitir a recuperação.

Inicie o experimento com a configuração de fluxo constante. Bombeie A para 0,8 mililitros por hora e bombeie B para 0,2 mililitros por hora. Para o meio a fluindo sobre 80% da largura do canal.

Podemos alterar dinamicamente as condições no dispositivo alterando as taxas de fluxo relativas. As novas condições se estabilizam em segundos ao longo de todo o canal Para demonstrar a separação entre diferentes cepas. Duas cepas de levedura distinguíveis são fotografadas em poços alternados.

Observe que não há vazamento de células entre os poços neste experimento. Ambas as cepas têm o fator de transcrição MSN dois marcado com YFP para testar o efeito simultâneo de condições que mudam dinamicamente. As taxas de fluxo nos dois canais de entrada foram alteradas para criar uma etapa sem meio de glicose.

Isso resultou na localização do MSN dois no núcleo. É importante ressaltar que o rastreamento de tempo dos níveis nucleares de MSN dois YFP em células individuais pode ser analisado. Assim, o dispositivo microfluídico PDMS pode ser usado para aplicação de condições dinâmicas simultâneas a vários poços.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não deixar as células secarem durante a montagem do dispositivo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita facilmente, sem a necessidade de litografia suave.