Iterativo Otimização de Duplexos de DNA para Cristalização de SEQA-Complexos de DNA

Este experimento detalha como obter cristais de qualidade de difração de uma proteína ligada ao DNA contendo uma bainha em tandem metilada. GATC. Repita para favorecer o empacotamento de cristal do complexo de DNA da proteína. Comece com o design racional do comprimento do DNA, o espaçamento GATC e as extremidades do DNA prossigam com os oligonucleotídeos de fita simples complementares para purificar o DNA e, em seguida, o anele para formar o duplex de DNA hemimetilado e, em seguida, misture o seq A purificado para formar o complexo.

Em seguida, encontre condições ideais para cultivar cristais de qualidade de difração do complexo de DNA de proteína com testes de cristalização usando telas comerciais de matriz esparsa. Resultados demonstrados. Compartilhar o efeito da variação do comprimento do DNA, espaçamento e extremidades do GATC na qualidade da difração dos cristais de DNA CQ A.

O objetivo deste trabalho é obter cristais de qualidade de difração de CK ligados ao DNA, mas também pode ajudar a entender as variáveis gerais que precisam ser consideradas ao projetar duplex de DNA para cristalização de outros complexos de DNA de proteínas, demonstrando que este procedimento será usado em Chang, A para bolsista de doutorado do meu laboratório. Este estudo usa uma variante das proteínas reguladoras de replicação do DNA. Procure um que forme dímeros estáveis e tenha uma região de ligação encurtada entre seus domínios de ização e ligação ao DNA.

Esta variante restringe a ligação ao DNA a repetições GATC em tandem separadas exclusivamente por uma volta no DNA primeiro transforma BBL 20 1D três células com o plasmídeo que codifica DEMETRIC seq A sob o controle da placa promotora T sete. A reação de transformação em placas de ágar LB contendo 100 microgramas por mililitro, ampicilina e colocar na incubadora bacteriana durante a noite. Escolha colônias mistas e comece uma cultura noturna em pequena escala.

Na manhã seguinte, inoculador de uma cultura de litro com 10 mililitros do inóculo noturno. Quando a cultura estiver em fase logarítmica, adicione dois mililitros de IPTG 0,5 molar para induzir a produção de proteínas. Continue a incubação por três horas em um agitador orbital de 37 graus Celsius.

Em seguida, colher as células por centrifugação a 3.300 G por 10 minutos. Reese, suspenda a paleta de células em purificação, tampone a mentiras por sonicação e limpe o lisado por centrifugação a 39.000 vezes G por 40 minutos. Agora carregue o sobrenadante S em uma coluna de heparina equilibrada com tampão de purificação.

Para eluir a proteína CK. Use um gradiente linear para um molar de cloreto de sódio que a proteína CK elui em torno de 0,7 molar de cloreto de sódio. Puxe as frações contendo CK e dilua para diminuir a força iônica da amostra.

Em seguida, coloque a amostra em uma coluna de cromatografia de troca catiônica E equiparada a tampão de purificação. Aplique um gradiente de sal linear para enrolar a proteína CK pura em torno de 0,4 molar de cloreto de sódio. Combine as frações que contêm CK.

Concentrar a três miligramas por mililitro e conservar em armazém. Projeto de tampão oligonucleotídeos não metilados e metilados complementares. Prepare amostras de um micromol de cada DNA liofilizado de fita simples em 800 microlitros de autoclave, vórtice de água duplamente destilada e reserve por 15 minutos agora e 800 microlitros.

Pré-aqueça duas vezes o tampão de carregamento para cada amostra para oligonucleotídeos longos de 20 a 30 nucleotídeos, prepare um grande gel desnaturante de 10%. Depois de polimerizado, retire o pente e enxágue bem o poço. Monte o gel enchendo os reservatórios superior e inferior com um tampão de corrida TBE uma vez.

Pré-execute o gel a 750 volts para aquecê-lo a 55 graus Celsius. Em seguida, pare a corrida e enxágue bem os poços com tampão de corrida. Agora aqueça os oligonucleotídeos a 90 graus Celsius por dois minutos.

Vórtice e rotação. As amostras procedem imediatamente ao carregamento do gel. Execute o gel em cerca de 700 volts até que o oligonucleotídeo tenha migrado.

No meio do caminho: Em um gel de poliacrilamida a 10%, o azul de fenol alph comigra com oligonucleotídeos em torno de 20 bases de comprimento e xileno syl ff com cerca de 60 bases de comprimento. Desmonte o gel do aparelho e remova os espaçadores em uma superfície plana. Remova uma placa de vidro e cubra o gel com filme plástico.

Em seguida, vire o gel, remova a outra placa de vidro e cubra o gel com filme plástico. Em seguida, marque as bandas usando luz ultravioleta e uma placa fluorescente atrás do gel. Para ver a sombra do DNA com uma lâmina de barbear, retire a faixa e corte-a em pedaços pequenos.

Transfira cada amostra para um tubo estéril de 15 mililitros. Adicione nove mililitros de tampão eluciano e dilua durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. Transfira cuidadosamente a solução para um tubo de centrífuga de autoclave usando uma ponta de pipeta de carregamento de gel.

Para evitar a transferência de pedaços de acrilamida, adicione um mililitro de acetato de sódio de três mili a pH sete mais 25 mililitros de etanol a 100% resfriado incube a menos 20 graus Celsius por pelo menos três horas. Centrifugue o DNA precipitado. Em seguida, seque os pellets no speed vac em fogo médio, ressuspenda cada pellet em 400 microlitros de autoclave, água bidestilada e transfira para um tubo novo.

Adicione 40 microlitros de acetato de sódio de três molares a pH sete e um mililitro de vórtice de etanol a 100% e incube por 30 minutos a menos 20 graus Celsius após centrifugação por 15 minutos a 18.000 vezes. G, enxágue os grânulos de DNA com 100 microlitros de etanol frio a 70% para remover qualquer rotação de sal residual por seis minutos a 18.000 vezes. G então descarte o etanol e seque o pellet em um aspirador rápido.

Agora reenvie cada pellet em 100 microlitros de água bidestilada em autoclave. Determinar a concentração dos oligonucleotídeos por espectrometria. Para preparar os duplex de DNA hemimetilado, primeiro misture concentrações iguais de molo das fitas simples complementares.

Em seguida, aqueça as misturas a 95 graus Celsius em banho-maria por cinco minutos para anil os fios. Deixe as amostras esfriarem lentamente até a temperatura ambiente dentro do banho-maria. Combine volumes iguais de 81 proteínas CQ a purificadas micromolares e 81 DNA metilado com bainha micromolar.

Em seguida, incubado em temperatura ambiente por 15 minutos. Armazene a quatro graus Celsius até usar a tela para condições de cristalização usando telas comerciais de matriz esparsa. Uma vez que os cabos de cristalização iniciais tenham sido identificados, otimize as condições para cultivar cristais de qualidade de difração Para chorar e proteger os cristais de DNA CK resultantes.

Aumente a quantidade de PEG 400 presente na solução de cristalização para uma concentração final de 25% ou adicione 20% de glicerol à solução de cristalização. Retire cristais individuais com flash de laço de nylon. Congele as amostras em nitrogênio líquido.

Agora teste o limite de difração de cada cristal em 100 k. Para obter a estrutura cristalina do mutante encurtado de CK ligado ao DNA Hemi metilado, otimizamos consecutivamente três parâmetros no DNA, o espaçamento entre as sequências GATC Hemi metiladas, o comprimento do duplex e a ausência ou presença de cinco saliências primárias. Este estudo usa uma variante DME de seek a com uma mutação pontual no domínio terminal final que impede uma ligamentização adicional e um ligante encurtado que restringe a ligação ao DNA em conjunto.

As repetições GATC separadas exclusivamente por uma volta nos ensaios de mudança de eletromobilidade do DNA indicam que a proteína CK modificada se liga preferencialmente às repetições GATC separadas por nove a 10 pares de bases. Portanto, as telas iniciais utilizam duplexes de 23 a 24 pares de bases de comprimento contendo duas bainhas metiladas. Repetições GATC separadas por nove ou 10 pares de bases.

Três duplex produziram cristais bem formados. Enquanto nenhum dos cristais foi defractado para alta resolução. Os dados indicaram que a separação A-G-A-T-C de nove pares de bases foi preferida para a cristalização, aumentando inesperadamente as interações da estrutura do sulco, incluindo um dinucleotídeo CG entre os dois sítios GATC, não alterou o limite de difração dos cristais.

Por outro lado, a otimização do comprimento das saliências mudou drasticamente os contatos moleculares e a morfologia do cristal. A estrutura cristalina desta proteína CK ligada a um duplex de DNA metilado confirmou que a face livre do duplex de DNA não se envolve em contatos de cristal, apesar do tamanho relativo da proteína e do DNA, a maioria das interações entre companheiros de simetria são mediadas por interações de proteína, proteína e DNA de proteína. Curiosamente, neste caso particular, o efeito benéfico de uma saliência de cinco dinucleotídeos primos não se deve à formação de um DNA pseudocontínuo.

Em vez disso, as cinco extremidades principais da fita metilada se projetam para longe dos eixos do DNA e interagem com a molécula CK proximal do complexo, explicando por que dois nucleotídeos eram estritamente necessários para alterar o empacotamento do cristal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar proteínas e projetar duplex de DNA para cristalização de complexos de DNA de proteínas. É importante lembrar que, embora este protocolo tenha sido um dispositivo para cristalizar o complexo de DNA CK, a otimização racional da sequência de comprimento e extremidades do DNA fornece uma estrutura geral para o projeto de duplex de DNA para a cristalização de outros complexos de DNA de proteína.