Abordagem de processamento paralelo multi-alvo para Gene-a-estrutura Determinação da polimerase da gripe PB2 Subunidade

O objetivo geral do experimento a seguir é usar uma abordagem multialvo para determinação estruturada de uma proteína-alvo por cristalografia de raios-x, começando com apenas um único gene ou sequência genética no caso apresentado aqui. A proteína alvo é a subunidade PB duas polimerase da influenza A, um componente-chave da replicação viral. A abordagem multi-alvo é alcançada primeiro projetando e clonando uma série de construções genéticas em paralelo com base na sequência de alvo único e outras informações conhecidas sobre a proteína.

O segundo passo é testar os níveis de expressão para cada construção e selecionar os melhores para expressão de proteínas em larga escala em cultura de células. O próximo passo requer quebrar as células abertas para remover as proteínas-alvo do material de expressão e refinar cada uma delas para uma pureza muito alta. Uma série de testes de cristalização é então configurada com cada proteína para obter uma forma de cristal adequada para estudos de raios-x.

Os dados de difração de raios-x de alta resolução são então coletados em um ou mais cristais e usados para resolver e refinar um mapa de densidade de elétrons delineando a estrutura de cada proteína-alvo. Esses resultados permitem a renderização de uma estrutura tridimensional da proteína alvo com base no mapa de densidade eletrônica. O processamento de múltiplos alvos aumenta muito a probabilidade de sucesso na determinação estruturada, fornecendo alternativas viáveis em todos os obstáculos potenciais no caminho.

Trabalhar vários alvos em paralelo também é altamente eficiente, reduzindo o tempo e o custo por proteína em cada etapa. O potencial de aumentar a taxa na qual a determinação estruturada é concluída para alvos drogáveis permitirá mais oportunidades de desenvolvimento de terapia por ano. Embora esse método possa fornecer informações valiosas sobre biologia estrutural, a proteína de alta qualidade obtida por meio desses métodos pode apoiar qualquer investigação baseada em proteínas.

Cada fase do processo tem sua própria ciência e requer sua própria experiência, mas o investimento em pessoas, instrumentação e know-how pode render lindamente quando todas as peças são montadas. Uma vez que um gene alvo e um produto gênico são selecionados para investigação, a primeira etapa requer o design de múltiplas variantes ou construções genéticas. O software compositor de genes é usado para projetar essas construções no nível da proteína, juntamente com o código associado em sequências de genes sintéticos projetados.

Usando o módulo visualizador de alinhamento e o módulo de design de construção, compare os alinhamentos de sequência de proteínas e defina os primers ou e comerciais terminais de PCR de inserção de design de construção de proteínas e PCR vetorial. Em seguida, use o algoritmo de proteína para DNA do compositor de genes para traduzir cada sequência de aminoácidos em um código na sequência de ácido nucleico projetada. Use o código adequado na tabela de uso para otimizar a sequência de expressão em uma linha celular específica.

Neste caso, bactérias e coli. Assim que a sequência do gene alvo estiver pronta, clone virtualmente e insira o gene em um plasmídeo vetorial adequado para expressão bacteriana. Neste caso, um vetor PET 28 modificado.

Este vetor contém certos componentes necessários para a expressão e purificação de proteínas. O gene alvo é modificado para incorporar uma sequência de marcadores de histamina no terminal N ou C da proteína e uma sequência de clivagem para permitir a remoção do marcador durante a purificação. O vetor também possui um gene de resistência a antibióticos para testes de expressão e fermentação.

Cada sequência genética de proteína-alvo é então criada por métodos padrão de síntese de genes em preparação para clonagem de tubos, clonagem de extensão primária incompleta da polimerase, ou clonagem de tubos, é uma estratégia de clonagem baseada em PCR, onde o gene-alvo é amplificado com primers complementares ao vetor pretendido. Este método explora a natureza incompleta da PCR em estágio avançado, que deixa os produtos de PCR com terminais de fita simples variáveis. Eu preparo o inserto PCR ou IPCR adicionando cinco microlitros de primers diretos e reversos a cada reação.

Em uma placa de 96 poços de acordo com um mapa de placas, adicione dois microlitros de cada gene sintético de comprimento total ao seu poço apropriado de acordo com o mapa de placas. Depois de adicionar 25 microlitros de mistura principal de PFU a cada um, faça um ciclo de reações 25 vezes usando as seguintes condições de PCR. Desnature a 95 graus Celsius por 30 segundos.

Anil a 50 graus Celsius por 45 segundos e se estende a 68 graus Celsius por três minutos. A amplificação do fragmento é confirmada pela análise em gel AGROS de produtos IPCR. Os produtos IPCR bem-sucedidos são representados por bandas robustas.

Resultados menos desejáveis são frequentemente vistos como bandas fracas ou de esfregaço em uma reação separada. O plasmídeo de expressão é amplificado por PCR vetorial ou a amplificação de fragmentos de VPCR é confirmada pela análise em gel AROS de produtos VPCR. Uma vez que os produtos IPCR e VPCR são amplificados, eles são adicionados a uma placa de fusão e colocados em um termociclador para a reação de fusão.

As construções clonadas com sucesso são então transformadas em células de E coli quimicamente competentes e armazenadas em talos de glicerol para iniciar a sequência de testes de expressão. Uma pequena quantidade de cada amostra de um estoque de glicerol de clone é construída em uma placa de ágar separada. A placa é feita com caldo de nutrientes bacterianos e o marcador antibiótico canamicina codificado no vetor incubar durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte.

Comece uma pré-cultura para cada amostra, escolhendo uma única colônia da placa de ágar recém-cultivada. Use esta colônia para inocular 1,2 mililitros de caldo de tuberculose suplementado com micina de lata e glicose para processamento paralelo. Cada pré-cultura é cultivada em um bloco inferior redondo de 96 poços.

Cresça durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 220 rotações por minuto. Após o crescimento durante a noite. Inicie culturas de indução em pequena escala para cada amostra usando 40 microlitros da pré-cultura para inocular.

1,2 mililitros de caldo TB. Suplementado com 50 miligramas por mililitro de micina de lata e sistema expresso noturno novagen. Primeiro, cultive as culturas de indução a 20 graus Celsius por 48 horas, agitando a 220 RPM as células de colheita por centrifugação a 4.000 unidades GForce por 15 minutos.

Despeje o sobrenadante e armazene os pellets a 20 graus Celsius negativos por pelo menos uma hora antes do processamento posterior após a purificação. Analisar a proteína com e sem reação de clivagem por eletroforese capilar utilizando um paquímetro de laboratório CHIP 90 No caso da influenza, uma subunidade de duas proteínas PB 14 das 34 construções levou à proteína-alvo solúvel e entrou na próxima etapa: fermentação em larga escala.

Para iniciar uma fermentação em larga escala, inocule 100 mililitros de caldo de cultura de células bacterianas contendo 50 miligramas por mililitro. A micina de um estoque de glicerol pode crescer durante a noite a 37 graus Celsius? Agitando a 220 RPM no dia seguinte, expanda a pré-cultura usando 10 mililitros para inocular.

Um litro de caldo contendo meios de autoindução e 50 miligramas por mililitro podem micina em um frasco defletor de dois litros. Agite as culturas expandidas a 37 graus Celsius aproximadamente a cada 30 minutos. Verificar a densidade óptica da cultura medindo a absorbância UV a um comprimento de onda de 600 nanômetros.

Quando uma densidade óptica de 0,6 for atingida, altere a temperatura da incubadora agitada para 20 graus Celsius após o tempo de crescimento desejado. Remova um quad Ali representativo de 10 mililitros de cada constructo para teste de expressão. Colha células por centrifugação a 5.000 unidades GForce por 15 minutos.

Despeje o sobrenadante e congele o pellet celular a 80 graus Celsius negativos. Para iniciar este procedimento, descongele e ressuspenda a pasta de células no tampão de lise em uma proporção de volume mestre de um para cinco. Mexa vigorosamente por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Use uma espátula limpa para soltar os pedaços da lateral do copo. Limpe mecanicamente as células no gelo com um sonicado maçônico. Clarificar o lisado bruto por centrifugação a 18 000 unidades GForce durante 30 minutos a quatro graus Celsius.

Recolha o sobrenadante e guarde uma pequena alíquota para análise antes de proceder à purificação em grande escala. Confirme a expressão proteica em larga escala de cada cultura por meio da análise de gel de página SDS. Este resultado representativo da página SDS mostra uma expressão robusta de proteínas, aproximadamente 50% de solubilidade e cerca de 50% de clivagem.

Nesse caso, a etiqueta de histidina foi removida junto com uma etiqueta de solubilidade de proteína adicionada, que foi projetada na construção original. A resina de níquel é usada para separar a proteína-alvo com a etiqueta exclusiva de histamina de todos os outros materiais celulares, incluindo proteínas bacterianas nativas. Uma coluna de níquel é preparada por lavagem com quatro volumes de coluna de água UE para remover o buffer de armazenamento, seguido por um volume de coluna de buffer B e cinco volumes de coluna de buffer.

A paralelização de equilíbrio para E é feita com o fabricante de proteínas, que é capaz de executar várias colunas ao mesmo tempo. Carregue cada lisado clarificado contendo proteína solubilizada com etiqueta de histamina em uma coluna separada a uma taxa de dois mililitros por minuto, seguido por várias lavagens de volume de coluna com tampão A, colete o fluxo através do tampão e guarde para análise. Eluir a proteína ligada em uma série de gradientes de etapas com os tampões A e B em 95 a cinco, 60 a 40 e, finalmente, 100% de tampão B. Os componentes do tampão B competem com a histamina pela resina de níquel e, assim, removem a proteína da coluna em uma determinada proporção.

Coletar cada fração de eluição separadamente. Um resultado representativo do cromatograma de uma corrida em uma coluna de níquel é mostrado aqui. Analise as frações iludidas de níquel, o lisado bruto, o lisado clarificado e o fluxo de níquel por página SDS e compare com a absorbância UV a 280 nanômetros coletados durante a purificação da coluna.

Esta etapa determina se a purificação foi bem-sucedida. Selecione e agrupe frações contendo a proteína alvo a ser transportada para processamento posterior. Calcule a quantidade total de proteína nesta fase com o coeficiente de extinção teórico da proteína, medindo a absorvância UV a 280 nanômetros e levando em consideração o volume total das frações agrupadas.

Guarde uma pequena amostra para análise. O gene para a proteína alvo foi codificado com uma sequência específica, que é reconhecida pelo ULP um como um local de clivagem, portanto, a adição do ULP um resulta em clivagem entre a marca de histidina e a proteína de interesse. Para iniciar este procedimento, adicione um microlitro de ubiquitina como protease, um para cada cinco miligramas de proteína presente nas frações agrupadas.

Neste ponto, a proteína clivada é transferida do tampão B para o tampão A para processamento posterior usando tubos de diálise, dialisados a proteína contra dois litros de tampão, A por quatro horas a quatro graus Celsius com agitação. Use um corte de peso molecular de 10 kilodalton para PB dois após a diálise. Execute outro gel de página SDS da proteína-alvo com e sem ULP um presente.

Isso determinará se a clivagem ULP um foi bem-sucedida e permitirá a seleção das melhores frações a serem transportadas para processamento posterior. Mostramos aqui nossos resultados representativos da página SDS para três construções da polimerase pb. Dois marcadores de peso molecular de subunidade estão na pista um.

As pistas dois, seis e 10 são proteínas agrupadas de colunas de níquel um. As pistas três, sete e 11 contêm fluxo de proteína clivada no tampão A do níquel dois e das pistas quatro, oito e 12. Mostre a remoção da etiqueta de histamina no tampão B do níquel dois.

Após a remoção da histamina, as frações agrupadas do níquel dois são concentradas. Para iniciar o SEC, a resina adequada deve ser escolhida novamente com base no peso molecular do alvo Neste caso, a coluna acere S 110 over 30 GL é usada e equilibrada com tampão SEC de 200 mililitros a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto usando uma seringa de cinco mililitros, carregue a amostra em um loop de amostra de 10 mililitros e inicie a execução da coluna SEC. Monitore o cromatograma absorvente de UV em 280 nanômetros enquanto coleta pequenas frações de volume.

Execute todas as frações SEC relevantes por meio da página SDS. A abordagem padrão para testes de cristalização de proteínas é conduzida pelo método de gota sentada envolvendo difusão de vapor. Não é incomum configurar duas ou mais telas de matriz esparsas logo no início para cada proteína-alvo.

Para iniciar este processo, pré-encha cada reservatório de uma placa de cristalização júnior compacta de 96 poços com 80 microlitros em cada condição na tela de cristalização selecionada, dispense 0,4 microlitros de proteína em tampão SEC em cada um dos 96 poços. Em seguida, adicione 0,4 microlitros da tela de cristalização, garantindo a mistura completa da gota em cada um. Cubra todo o banal com fita de teto cristalina, garantindo uma vedação completa em cada poço, armazene a placa a 16 graus Celsius em um local imperturbável, livre de vibrações ambientais.

Verifique a cristalização de proteínas periodicamente nas próximas semanas sob um microscópio de dissecação. Se os cristais de proteína não aparecerem, coloque novas placas com condições diferentes e varie a concentração de proteína na gota final para aumentar a probabilidade de sucesso antes da colheita. Resfrie um disco estilo A LS em um fazedor cheio de nitrogênio líquido e cubra com uma tampa para começar a colheita.

Corte a fita transparente que cobre o poço com o cristal de proteína alvo até ficar vazio nas proximidades. Bem, adicione 1,6 microlitros da condição de cristalização correspondente e combine-a com 0,4 microlitros de etilenoglicol. Uma solução de 20% de etilenoglicol na condição de cristalização protege o cristal de proteína.

Durante o congelamento criogênico, analise o cristal ao microscópio e selecione uma alça criogênica adequada para a colheita, combinando o diâmetro interno da alça com a largura máxima do cristal. Conecte o laço criogênico a uma varinha de cristal magnético e enrole o cristal diretamente da solução do poço. Mergulhe imediatamente o loop criogênico com o cristal colhido em um crioprotetor e, em seguida, mergulhe em um disco estilo LS.

Para piscar, congele a repetição do cristal para um número desejado de cristais. Quando a colheita estiver concluída, use uma varinha de disco para colocar uma tampa magnética no disco contendo cristais congelados com línguas dobradas. Vire o disco de cabeça para baixo para a próxima etapa.

Aparafuse um empurrador de disco no disco, depois transfira o disco para o ator KU e use-o para perfurar a tampa. Os cristais no disco permanecem congelados em um banho de nitrogênio líquido até que estejam prontos para estudos de difração de raios-x usando o software de aquisição de imagem J Director. Configure os seguintes parâmetros para fenda do feixe de filtragem de cristal a 0,5 graus, distância do detector de 50 milímetros, passo da imagem a 70 graus e duração de exposição de 30 segundos.

Aqui está um exemplo de captura de tela do software de aquisição de imagem enquanto um cristal está sendo rastreado, o painel central mostra a difração de raios-x observada de um cristal representativo coletando imagens suficientes em alta resolução para um conjunto de dados completo necessário para a determinação da estrutura tridimensional. As estratégias de clonagem e purificação de proteínas demonstradas neste vídeo resultaram em 14 PB purificadas, duas amostras, das quais nove produziram cristais adequados para estudos de difração. O conjunto de dados interno de difração de raios-x foi coletado em cinco das nove construções com radiação alfa QK usando um gerador de raios-x de ânodo rotativo rigaku super brilhante e gerador, equipado com ossec variax hf, óptica HF e um detector Saturn 944 plus CCD.

Uma imagem de difração de raios-X da subunidade PB da polimerase é mostrada aqui. Cada conjunto de dados foi processado e um total de quatro estruturas da subunidade PB duas foram determinadas. Cada estrutura foi revisada por pares e carregada no banco de dados de proteínas para acesso público.

Esta figura mostra diagramas de fita das moléculas na unidade assimétrica cristalográfica. Das quatro estruturas PB dois, as estruturas secundárias são coloridas em um padrão de arco-íris com códigos PDB correspondentes. Nesta tabela é mostrada a análise de resultados para os dois alvos do PB da gripe pelos métodos descritos neste artigo em vídeo.

O pipeline de processamento paralelo multi-alvo para determinação do gene para a estrutura é ilustrado em cinco etapas, clonagem, solubilidade, purificação, cristalização e determinação da estrutura. O resultado de nosso pipeline de biologia estrutural não apenas fornece a base para pesquisas baseadas em estrutura, mas também alimenta estudos adicionais, como ensaios funcionais para confirmar a função da proteína ou triagem biofísica de novos compostos em um MAR ou SPR para identificar novos pontos de partida para o desenvolvimento de medicamentos. Essa técnica e as ferramentas inventadas junto com ela ajudaram a pavimentar o caminho para os biólogos estruturais detectarem muitos tipos de investigações baseadas em descobertas, incluindo o design de medicamentos baseado em estrutura, que teve um enorme impacto na saúde e nas doenças humanas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como o processamento paralelo de vários destinos pode aumentar muito o sucesso da determinação estruturada. Não se esqueça de que trabalhar em um laboratório de biologia estrutural pode ser extremamente perigoso e as devidas precauções, como o uso de EPI, devem sempre ser tomadas durante as atividades de laboratório.