Abordagem de processamento paralelo multi-alvo para Gene-a-estrutura Determinação da polimerase da gripe PB2 Subunidade

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar uma abordagem com múltiplos alvos para a determinação estrutural de uma proteína-alvo por cristalografia de raios X, partindo de apenas um único gene ou sequência genética, como no caso apresentado aqui. A proteína-alvo é a subunidade PB2 da polimerase do vírus da influenza A, um componente essencial da replicação viral. A abordagem com múltiplos alvos é alcançada primeiramente projetando e clonando uma série de construtos genéticos em paralelo com base na sequência-alvo única e em outras informações conhecidas sobre a proteína.

O segundo passo é testar os níveis de expressão para cada construto e selecionar os melhores para a expressão proteica em larga escala em cultura celular. O próximo passo requer a ruptura das células para remover as proteínas-alvo do material de expressão e purificar cada uma delas até uma alta pureza. Em seguida, é realizada uma série de ensaios de cristalização com cada proteína para obter uma forma cristalina adequada para estudos com raios X.

Dados de difração de raios X de alta resolução são então coletados em um ou mais cristais e utilizados para resolver e refinar um mapa de densidade eletrônica que delinea a estrutura de cada proteína alvo. Esses resultados permitem a obtenção de uma estrutura tridimensional da proteína alvo com base no mapa de densidade eletrônica. O processamento multialvo aumenta significativamente a probabilidade de sucesso na determinação estrutural, fornecendo alternativas viáveis em cada possível obstáculo ao longo do caminho.

Trabalhar com múltiplos alvos em paralelo também é altamente eficiente, reduzindo o tempo e o custo por proteína em cada etapa. O potencial de aumentar a taxa de conclusão da determinação estrutural para alvos passíveis de intervenção farmacológica permitirá mais oportunidades de desenvolvimento de terapias por ano. Embora este método possa fornecer informações valiosas em biologia estrutural, a proteína de alta qualidade obtida por meio desses métodos pode apoiar qualquer investigação baseada em proteínas.

Cada fase do processo possui sua própria ciência e exige sua própria especialização, mas o investimento em pessoal, instrumentação e conhecimento pode compensar plenamente assim que todas as partes forem montadas. Uma vez que um gene alvo e seu produto gênico forem selecionados para investigação, o primeiro passo requer o planejamento de múltiplas variantes genéticas ou construtos. Um software chamado Gene Composer é utilizado para projetar esses construtos ao nível da proteína, juntamente com o código associado em sequências gênicas sintéticas modificadas.

Utilizando o módulo do visualizador de alinhamento e o módulo de design de construto, compare os alinhamentos de sequências de proteínas e defina os desenhos dos construtos proteicos, inserindo iniciadores terminais de PCR para o gene e para o vetor, ou ampers. Em seguida, use o algoritmo de proteína para DNA do Gene Composer para realizar a tradução reversa de cada sequência de aminoácidos em um código de sequência de ácido nucleico projetado. Utilize a tabela apropriada de uso de códons para otimizar a sequência para expressão em uma linhagem celular específica.

Neste caso, bactérias Escherichia coli. Uma vez que a sequência do gene alvo esteja pronta, clone e insira virtualmente o gene em um plasmídeo vetor apropriado para expressão bacteriana. Neste caso, um vetor PET 28 modificado.

Este vetor contém certos componentes necessários para expressão e purificação de proteínas. O gene alvo é modificado para incorporar uma sequência de marcação de histidina em uma das extremidades da proteína, N ou C terminal, e uma sequência de clivagem que permite a remoção da marcação durante a purificação. O vetor também possui um gene de resistência a antibiótico para testes de expressão e fermentação.

Cada sequência genética da proteína-alvo é então criada por métodos padrão de síntese gênica em preparação para o pipe cloning polymerase incomplete primary extension cloning, ou pipe cloning, que é uma estratégia de clonagem baseada em PCR na qual o gene-alvo é amplificado com primers complementares ao vetor pretendido. Este método explora a natureza incompleta da PCR em estágios tardios, que deixa os produtos da PCR com extremidades simples variáveis. Preparo a PCR do inserto ou IPCR adicionando cinco microlitros de cada primer direto e reverso a cada reação.

Em uma placa de 96 poços de acordo com um mapa de placa, adicione dois microlitros de cada gene sintético completo ao poço apropriado conforme o mapa de placa. Após adicionar 25 microlitros da mistura mestra de PFU a cada poço, realize 25 ciclos das reações usando as seguintes condições de PCR. Desnaturar a 95 graus Celsius por 30 segundos.

Anil a 50 graus Celsius por 45 segundos e alongamento a 68 graus Celsius por três minutos. A amplificação do fragmento é confirmada pela análise em gel de agarose dos produtos de PCR. Produtos de PCR bem-sucedidos são representados por bandas intensas.

Resultados menos desejáveis são frequentemente observados como bandas fracas ou borradas em uma reação separada. O plasmídeo de expressão é amplificado por PCR de vetor ou a amplificação do fragmento VPCR é confirmada por análise em gel AROS dos produtos VPCR. Após a amplificação dos produtos IPCR e VPCR, eles são adicionados a uma placa de fusão e colocados em um termociclador para a reação de fusão.

Os construtos clonados com sucesso são então transformados em células de E. coli competentes quimicamente e armazenados em bastões de glicerol para iniciar o teste de expressão. Uma pequena quantidade de cada amostra de um estoque de glicerol do construto clonado é repicada em uma placa de ágar separada. A placa é preparada com caldo nutriente bacteriano e o marcador antibiótico Canamicina codificado no vetor, e incubada durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte.

Inicie um pré-cultivo para cada amostra selecionando uma única colônia da placa de ágar recém-cultivada. Use esta colônia para inocular 1,2 mililitros de caldo TB suplementado com canamicina e glicose para processamento paralelo. Cada pré-cultivo é cultivado em um bloco de 96 poços com fundo redondo.

Cultive durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 220 rotações por minuto. Após o crescimento noturno, inicie culturas de indução em pequena escala para cada amostra utilizando 40 microlitros da pré-cultura para inoculação.

1,2 mililitros de caldo TB. Suplementado com 50 miligramas por mililitro de canamicina e sistema Overnight Express da Novagen. Um, cultive as culturas de indução a 20 graus Celsius por 48 horas, sob agitação a 220 RPM; recolha as células por centrifugação a 4.000 unidades de força G por 15 minutos.

Descarte o sobrenadante e armazene os pellets a 20 graus Celsius negativos por pelo menos uma hora antes do processamento adicional após a purificação. Analise a proteína com e sem reação de clivagem por eletroforese capilar utilizando um sistema Caliper Lab Chip 90 de acordo com o protocolo do fabricante. No caso da proteína da subunidade PB2 do influenza A, 14 dos 34 construtos resultaram em proteína alvo solúvel e avançaram para a próxima etapa de fermentação em larga escala.

Para iniciar uma fermentação em larga escala, inocular 100 mililitros de caldo de cultura bacteriana contendo 50 miligramas por mililitro de canamicina a partir de um estoque glicerinado e cultivar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, sob agitação a 220 RPM, expandir a pré-cultura utilizando 10 mililitros para inoculação.

Um litro de caldo contendo meio de indução automática e 50 miligramas por mililitro de canamicina em um frasco erlenmeyer de dois litros com defletores. Agite os cultivos expandidos a 37 graus Celsius aproximadamente a cada 30 minutos. Verifique a densidade óptica do cultivo medindo a absorbância na faixa ultravioleta em um comprimento de onda de 600 nanômetros.

Quando uma densidade óptica de 0,6 for atingida, altere a temperatura do incubador agitador para 20 graus Celsius após o tempo de crescimento desejado. Retire um alíquota representativo de 10 mililitros de cada construto para teste de expressão. Recolha as células por centrifugação a 5.000 unidades de força G por 15 minutos.

Descarte o sobrenadante e congele o pellet celular a menos 80 graus Celsius. Para iniciar este procedimento, descongele e ressuspenda a pasta celular no tampão de lise numa proporção de volume de um para cinco. Agite vigorosamente durante 30 minutos a quatro graus Celsius.

Use uma espátula limpa para soltar pedaços da lateral do béquer. Lisar as células mecanicamente em gelo com um sonicador de Mason. Clarifique o lisado bruto por centrifugação a 18.000 unidades de força gravitacional por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Colete o sobrenadante e guarde uma pequena alíquota para análise antes de prosseguir com a purificação em larga escala. Confirme a expressão proteica em larga escala de cada cultura por meio de análise em gel de eletroforese SDS-PAGE. Este resultado representativo de SDS-PAGE mostra expressão proteica robusta, solubilidade aproximada de 50% e cerca de 50% de clivagem.

Neste caso, a marcação de histidina foi removida juntamente com uma marcação de solubilidade proteica adicionada, que foi projetada no construto original. A resina de níquel é utilizada para separar a proteína alvo com a marcação única de histidina de todo o outro material celular, incluindo proteínas bacterianas nativas. Uma coluna de níquel é preparada lavando-se com quatro volumes da coluna de água UE para remover o tampão de armazenamento, seguido por um volume da coluna de tampão B e cinco volumes da coluna de tampão.

A paralelização da equilibração com tampão A é realizada com o protein maker, que é capaz de operar múltiplas colunas simultaneamente. Carregue cada lisado clarificado contendo proteína solubilizada com marcação de histamina em uma coluna separada, a uma taxa de dois mililitros por minuto, seguido por várias lavagens com volumes de coluna do tampão A; colete o tampão do fluxo inicial e guarde para análise. Elua a proteína retida em uma série de gradientes em etapas com os tampões A e B nas proporções de 95 para 5, 60 para 40 e, finalmente, 100% do tampão B. Os componentes do tampão B competem com a histamina pela resina de níquel e, assim, removem a proteína da coluna em uma determinada proporção.

Colete cada fração de eluição separadamente. Um resultado representativo de cromatograma de uma corrida em uma coluna de níquel é mostrado aqui. Analise as frações eluídas da coluna de níquel, o lisado bruto, o lisado clarificado e o fluxo passante da coluna de níquel por eletroforese em gel de SDS-PAGE e compare com a absorbância ultravioleta em 280 nanômetros coletada durante a purificação em coluna.

Esta etapa determina se a purificação foi bem-sucedida. Selecione e reúna as frações contendo a proteína alvo para prosseguir com o processamento adicional. Calcule a quantidade total de proteína nesta fase utilizando o coeficiente de extinção teórico da proteína, medindo a absorbância UV a 280 nanômetros e considerando o volume total das frações reunidas.

Guarde uma pequena amostra para análise. O gene para a proteína-alvo foi codificado com uma sequência específica, que é reconhecida pela ULP uma como um sítio de clivagem, de modo que a adição da ULP uma resulta na clivagem entre a marcação de histidina e a proteína de interesse. Para iniciar este procedimento, adicione um microlitro de protease semelhante à ubiquitina, um por cada cinco miligramas de proteína presentes nas frações agrupadas.

Neste ponto, a proteína clivada é transferida do tampão B para o tampão A para processamento adicional usando tubo de diálise, diализando a proteína contra dois litros do tampão A por quatro horas a quatro graus Celsius com agitação. Utilize um corte de peso molecular de 10 quilodaltons para PB dois após a diálise. Execute outra eletroforese em gel SDS-PAGE da proteína alvo com e sem ULP um presente.

Isso determinará se a clivagem pela ULP uma foi bem-sucedida e permitirá a seleção das melhores frações para prosseguir com o processamento adicional. São mostrados aqui os resultados representativos de eletroforese SDS-PAGE para três construtos da polimerase pb. Dois marcadores de peso molecular de subunidades estão na fileira um.

As alíquotas dois, seis e dez são proteínas agrupadas de colunas de níquel um. As alíquotas três, sete e onze contêm o fluxo do eluato da proteína clivada no tampão A do níquel dois, e as alíquotas quatro, oito e doze mostram a remoção da marcação de histidina no tampão B do níquel dois.

Após a remoção da histamina, as frações reunidas do níquel dois são concentradas. Para iniciar a CLS, a resina apropriada deve ser escolhida novamente com base no peso molecular do alvo. Neste caso, utiliza-se uma coluna acere S 110 over 30 GL, que é equilibrada com 200 mililitros de tampão CLS a uma vazão de 0,5 mililitro por minuto. Usando uma seringa de cinco mililitros, carrega-se a amostra no loop de amostra de 10 mililitros e inicia-se a corrida na coluna de CLS. Monitore o cromatograma de absorção UV a 280 nanômetros enquanto coleta frações de pequeno volume.

Execute todas as frações relevantes de CEF por meio de SDS-PAGE. A abordagem padrão para ensaios de cristalização de proteínas é realizada pelo método da gota sentada, envolvendo difusão por vapor. Não é incomum montar duas ou mais telas de matriz esparsa logo no início para cada proteína alvo.

Para iniciar este processo, preencha previamente cada reservatório de uma placa de cristalização compacta de 96 poços com 80 microlitros de cada condição da tela de cristalização selecionada; dispense 0,4 microlitro de proteína no tampão SEC em cada um dos 96 poços. Em seguida, adicione 0,4 microlitro da tela de cristalização, garantindo a mistura completa da gota em cada poço. Cubra toda a placa com fita transparente cristalina, assegurando um selamento completo em todos os poços, e armazene a placa a 16 graus Celsius em local protegido e livre de vibrações ambientais.

Verifique periodicamente a cristalização da proteína nas próximas semanas sob um microscópio estereoscópico. Se os cristais de proteína não aparecerem, prepare novas placas com diferentes condições e varie a concentração da proteína na gota final para aumentar a probabilidade de sucesso antes da colheita. Resfrie um puck no estilo A LS em um dewar cheio com nitrogênio líquido e cubra com uma tampa para iniciar a colheita.

Corte a fita transparente que cobre o poço com o cristal de proteína-alvo até um poço vazio próximo. Adicione 1,6 microlitros da condição de cristalização correspondente e combine com 0,4 microlitros de etileno glicol. Uma solução contendo 20% de etileno glicol na condição de cristalização protege o cristal de proteína.

Durante o congelamento criogênico, analise o cristal ao microscópio e selecione um loop criogênico adequado para colheita, ajustando o diâmetro interno do loop à largura máxima do cristal. Fixe o loop criogênico a uma haste magnética para cristais e colete o cristal diretamente da solução do poço. Mergulhe imediatamente o loop criogênico com o cristal colhido em um crioprotetor e, em seguida, submerja-o em um puck do tipo LS.

Para congelar rapidamente, repita o congelamento rápido por um número desejado de cristais. Após a colheita ser concluída, utilize uma haste com suporte para posicionar uma tampa magnética sobre o suporte contendo os cristais congelados rapidamente com linguetas dobradas. Vire o suporte de cabeça para baixo para a próxima etapa.

Parafuse um empurrador de puck ao puck, em seguida transfira o puck para o KU actor doer e use-o para destacar a tampa. Os cristais no puck permanecem congelados em um banho de nitrogênio líquido até o momento das análises de difração de raios X utilizando o software de aquisição de imagens J Director. Configure os seguintes parâmetros para a fenda do feixe de triagem de cristais: ângulo de 0,5 graus, distância do detector de 50 milímetros, passo da imagem de 70 graus e tempo de exposição de 30 segundos.

Aqui está um exemplo de captura de tela do software de aquisição de imagens durante a triagem de um cristal; o painel central mostra a difração de raios X observada a partir de um cristal representativo, coletando imagens suficientes em alta resolução para um conjunto completo de dados necessário à determinação da estrutura tridimensional. As estratégias de clonagem e purificação da proteína demonstradas neste vídeo resultaram em 14 amostras purificadas de PB dois, das quais nove produziram cristais adequados para estudos de difração. O conjunto de dados de difração de raios X obtido internamente foi coletado em cinco dos nove construtos com radiação QK alfa, utilizando um gerador de raios X com ânodo rotativo Rigaku Super Bright FRE Plus, equipado com óptica Ossec VariMax HF e um detector CCD Saturn 944 Plus.

Uma imagem de difração de raios X da subunidade PB dois da polimerase é mostrada aqui. Cada conjunto de dados foi processado e um total de quatro estruturas da subunidade PB dois foi determinado. Cada estrutura foi revisada por pares e disponibilizada no banco de dados de proteínas para acesso público.

Esta figura mostra diagramas em fita das moléculas na unidade assimétrica cristalográfica. Das quatro estruturas da PB dois, as estruturas secundárias são coloridas em um padrão arco-íris com os códigos PDB correspondentes. Apresentado nesta tabela está a análise dos resultados para os alvos da PB dois da influenza pelos métodos descritos neste artigo em vídeo.

O pipeline de processamento paralelo com múltiplos alvos para a determinação da estrutura a partir do gene é ilustrado em cinco etapas: clonagem, solubilidade, purificação, cristalização e determinação da estrutura. A saída do nosso pipeline de biologia estrutural não apenas fornece a base para pesquisas baseadas em estrutura, mas também alimenta estudos adicionais, como ensaios funcionais para confirmar a função da proteína ou triagens biofísicas de compostos novos por MAR ou SPR para identificar pontos iniciais inovadores para o desenvolvimento de fármacos. Essa técnica e as ferramentas inventadas junto com ela ajudaram a abrir caminho para que biólogos estruturais realizassem diversos tipos de investigações baseadas em descobertas, incluindo o design de fármacos baseado em estrutura, o que teve um grande impacto na saúde humana e nas doenças.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como o processamento paralelo multialvo pode aumentar significativamente o sucesso da determinação de estruturas. Não se esqueça de que trabalhar em um laboratório de biologia estrutural pode ser extremamente perigoso e que as devidas precauções, como o uso de EPIs, devem sempre ser tomadas ao realizar atividades laboratoriais.