Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

O objetivo geral deste procedimento é utilizar o ensaio DTH trans vivo para monitorar respostas específicas a antígenos pró e anti-inflamatórias em seres humanos. Primeiro, isole as células mononucleares do sangue periférico do sangue periférico do ser humano. Em seguida, misture a preparação de PBMC com PBS.

Antígeno de teste de lembrança e antígeno de teste mais antígeno de lembrança. Prossiga com as medições prévias na almofada plantar e injete as misturas preparadas em camundongos. Repita as medições nas almofadas plantares 24 horas depois. Três.

Padrões definitivos de respostas de hipersensibilidade tardia podem ser regulatórias, não regulatórias e sensibilizadas. O ensaio de hipersensibilidade tardia trans vivo pode ser aplicado para determinar parâmetros clínicos, como respostas aloreativas, em que a fonte do antígeno são as células do doador do transplante. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos in vitro existentes é que é possível detectar facilmente tanto respostas pró-inflamatórias quanto regulatórias a antígenos alo, autoantígenos ou antígenos tumorais utilizando um único sistema de ensaio.

Egon, um pesquisador do meu laboratório, demonstrará agora o procedimento utilizando sangue periférico humano fresco coletado em tubos com citrato de dextrose ácido para evitar a ativação das plaquetas. Isole os PBMCs usando meio de separação de linfócitos de acordo com métodos padrão. Lave a preparação de PBMCs com PBS para remover plaquetas contaminantes.

Se houver uma contaminação visível por hemácias, realize a lise das células vermelhas utilizando um tampão de lise CK. Em seguida, realize mais duas lavagens com PBS Resus. Suspenda os PBMCs em PBS numa concentração de 10 milhões de PBMCs por mililitro para o antígeno alo.

Inicie com as BMCs de P, isoladas do sangue periférico do doador usando o procedimento mostrado anteriormente. Em seguida, ressuspenda as células doadoras em PBS numa concentração de 120 milhões de células por mililitro e adicione um micromolar de PMSF para prevenir a degradação proteica.

Agora, sonique a suspensão celular utilizando sete pulsos de um segundo com uma sondasônica de dois milímetros. Usando um hemocitômetro, verifique a ruptura de mais de 90% das células.

Em seguida, centrifugue a mistura a 14.000 RPM a quatro graus Celsius por 20 minutos. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um tubo safe lock de dois mililitros e determine a concentração de proteína por métodos padrão para cada injeção. Aliquote sete vezes 10 à sexta P BMCs em dois mililitros.

Tubos com fechamento seguro pelotizam as células por centrifugação. Primeiro, prepare a suspensão controle negativo de PBMC em 35 microlitros de PBS. Em seguida, para o controle positivo, adicione 25 microlitros de um antígeno de memória, toxoide do tétano, toxoide da difteria, e ajuste o volume de injeção para 35 microlitros com PBS.

Conforme o delineamento experimental para avaliar a resposta específica ao doador, ressuspenda o pellet celular em 10 microlitros de antígeno doador mais 25 microlitros de PBS, obtendo um volume total de 35 microlitros. Para avaliar a regulação específica ao antígeno doador experimental, ressuspenda o pellet celular em 35 microlitros, adicionando 10 microlitros de antígeno doador e 25 microlitros de antígeno TT DT de memória. Após anestesiar, com isoflurano, o camundongo, posicione um paquímetro com mola no centro da almofada plantar, com uma das extremidades tocando a última almofada de apoio do pé, para fornecer um ponto de referência que mantenha o local de medição consistente quando a leitura do paquímetro estiver estável.

Registre a espessura basal da almofada plantar para a injeção na almofada. Posicione a seringa com a agulha voltada para os dedos dos pés e o bisel voltado para cima. Inicie então as injeções subcutâneas de cada suspensão celular nas almofadas plantares traseiras do camundongo.

Primeiro, injete lentamente a almofada direita do pé com a preparação do controle negativo. Em seguida, injete a almofada esquerda do pé com o controle positivo de PBMC mais TT dt. Agora, devolva o camundongo à sua gaiola.

Número dois, injete a pata traseira direita com PBMC mais antígeno alo e a pata traseira esquerda com PBMC mais antígeno alo mais TT dt. Certifique-se de que não haja vazamento ao redor de 18 a 24 horas após a injeção. Anestesie cada camundongo com isoflurano e repita a medição do inchaço da pata.

Subtraia a espessura de cada pata antes da injeção do valor pós-injeção para obter o valor de inchaço da pata. Em seguida, calcule o inchaço líquido específico ao antígeno subtraindo o valor de inchaço da pata controle dos valores de inchaço da pata obtidos nos tratamentos. Verifique a leitura do controle positivo com uma resposta do controle positivo ao antígeno de recordação TT DT maior ou igual a 25 vezes 10 elevado à menos quatro polegadas acima.

É necessário um resposta de fundo ao PBS para que o teste seja considerado válido. Em seguida, determine a inibição das respostas de recordação na presença de antígenos do doador. Este experimento avalia receptores de transplante renal quanto à resposta específica a antígenos do doador e à regulação.

Existem três padrões principais de hipersensibilidade tardia em receptores de transplante: regulatório, não regulatório e sensibilizado. Todos os pacientes responderam fortemente ao controle positivo do antígeno de lembrança tt. O paciente número 62 apresenta o padrão regulatório, caracterizado por uma resposta fraca ao antígeno do doador e uma acentuada supressão vinculada à resposta ao antígeno de lembrança na presença do antígeno do doador.

Este é o padrão que tem sido associado à tolerância ao aloenxerto de órgãos. O paciente número 48 exibe um padrão não regulatório, que se caracteriza por uma resposta fraca ao doador, mas sem supressão vinculada. Esse padrão tem sido frequentemente observado em pacientes que fazem uso de medicamentos imunossupressores.

O paciente número oito exibe o padrão sensibilizado ao doador, caracterizado por uma alta resposta ao antígeno do doador e ausência de supressão vinculada. Essa resposta está associada à rejeição do enxerto. Em estudos clínicos de caso, PBMCs de indivíduos inscritos em um ensaio observacional foram analisados quanto às vias indiretas específicas para o doador, bem como às respostas de linfócitos T efetores e T reguladores, para avaliar o papel da regulação específica para o doador na tolerância clínica.

As respostas indiretas dos linfócitos T a antígenos do doador revelam um espectro distinto entre os grupos de inclusão. O inchaço da pata aumenta à medida que o estado clínico do paciente evolui daqueles que são tolerantes para aqueles que estão rejeitando cronicamente. Aqui, o ensaio de supressão ligada mede a via indireta anti-doador da resposta de linfócitos T reguladores.

Esses dados mostram uma diminuição nas respostas regulatórias ao longo do espectro que vai dos pacientes mais tolerantes aos intermediários e, por fim, aos menos tolerantes, com rejeição crônica. Em conjunto, a regulação imune medida pelo ensaio de DTH trans vivo parece ser um mecanismo importante para a aceitação de aloenxertos renais.

Uma área promissora é a aplicação do ensaio TDTH no monitoramento da autoimunidade. Nosso estudo sobre o papel do colágeno tipo cinco no processo patológico da síndrome de bronquiolite obliterante revelou que o maior risco relativo de desenvolvimento de BOS foi observado em pacientes com resposta positiva ao colágeno. Células mononucleares do sangue periférico (pbmc) de receptores de transplante pulmonar, mas não de controles saudáveis ou do colágeno.

Quatro pacientes com síndrome do bom pastor reativos após transplante renal foram frequentemente reativos ao colágeno V. O ensaio TDTH também pode ser usado para testar a reatividade de pbmc de pacientes com câncer frente a antígenos específicos de tumor. Por exemplo, a presença de células T reguladoras específicas do PAP em pacientes com câncer de próstata pode limitar a resposta à vacinação com o antígeno PAP.

O ensaio TRANSVAAL DTH é um teste diagnóstico inovador com aplicação clínica na avaliação de respostas imunes mediadas por células em pacientes transplantados, com câncer e autoimunes. Ele é valioso porque não apenas é útil no monitoramento de respostas de memória de linfócitos T efetores, mas também pode ser usado para detectar respostas de células T reguladoras, pois não depende da medição de uma citocina específica para identificar células T efetoras ou reguladoras. É muito flexível e amplamente aplicável.