Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

O objetivo geral deste procedimento é usar o ensaio DTH trans vivo para monitorar as respostas específicas do antígeno pró e anti-inflamatório em seres humanos. Primeiro, isole as células mononucleares do sangue periférico do sangue periférico do sujeito humano. Em seguida, misture a preparação PBMC com PBS.

Antígeno de recall de antígeno de teste e antígeno de teste mais antígeno de recall. Prossiga com as medições do pata e injete as misturas preparadas em camundongos deslizantes. As almofadas dos pés repetem as medições 24 horas depois. Três.

Padrões definitivos de respostas DTH são possíveis regulatórios, não regulatórios e sensibilizados. O ensaio de hipersensibilidade do tipo retardado trans vivo pode ser aplicado para determinar parâmetros clínicos como respostas de reação alo, onde a fonte do antígeno são as células do doador de transplante. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos in vitro existentes é que é possível detectar facilmente respostas pró-inflamatórias e regulatórias a antígenos alo, autoantígenos ou antígenos tumorais usando um único sistema de ensaio.

Egon, um pesquisador do meu laboratório, agora demonstrará o procedimento Usando sangue periférico humano fresco coletado em tubos de dextrose de citrato ácido para evitar a ativação plaquetária. Isolar PBMC utilizando meio de separação de linfócitos de acordo com métodos normalizados. Lave a preparação PBMC com PBS para remover plaquetas contaminantes.

Se houver uma contaminação perceptível dos glóbulos vermelhos, realize a lise dos glóbulos vermelhos usando um tampão de lise CK. Em seguida, faça mais duas lavagens com PBS Resus. Suspender o PBMC em PBS a uma concentração de 10 milhões de PBMC por mililitro para o aloantígeno.

Comece com P BMCs, isolados do sangue periférico do doador usando o procedimento mostrado anteriormente. Então resus. Suspenda as células doadoras em PBS a uma concentração de 120 milhões de células por mililitro e adicione um micromolar de PMSF para evitar a degradação de proteínas.

Agora sonicar a suspensão celular usando sete pulsos de um segundo com uma sonica de sonda de dois milímetros. Usando um hemocitômetro. Verifique a ruptura de mais de 90% das células.

Em seguida, centrifugue a mistura a 14.000 rpm a quatro graus Celsius por 20 minutos. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de trava de dois cofres e determine a concentração de proteína por métodos padrão para cada injeção. Alíquota sete vezes 10 elevado ao sexto P BMCs em dois mililitros.

Os tubos de trava segura pellet as células por centrifugação. Primeiro, prepare a suspensão de controle negativo do PBMC em 35 microlitros de PBS. Em seguida, para o controle positivo, adicione 25 microlitros de um antígeno recordatório, tétano, toxóide, difteria, toxóide e ajuste o volume de injeção para 35 microlitros com PBS.

De acordo com o projeto experimental para avaliar a resposta específica do doador, ressuspenda o pellet celular em 10 microlitros de antígeno do doador mais 25 microlitros de PBS para um volume total de 35 microlitros. Para avaliar a regulação específica do antígeno do doador experimental, resus suspende o pellet celular em 35 microlitros adicionando 10 microlitros de antígeno do doador e 25 microlitros de antígeno TT DT de recordação. Após a anestesia, o mouse deslizante com flúor isof coloca uma pinça com mola no centro de uma almofada de pé com uma borda tocando a última almofada de caminhada do pé para fornecer uma referência para manter o local de medição consistente quando a leitura do medidor se estabilizar.

Registre a espessura da almofada do pé da linha de base para a injeção do suporte. Coloque a seringa com a agulha apontando para os dedos dos pés e o chanfro voltado para cima. Agora comece as injeções subcutâneas de cada suspensão celular nas almofadas traseiras dos pés para o mouse.

Número um, injete lentamente a almofada do pé direito com preparação de controle negativo. Em seguida, injete a almofada do pé esquerdo com o controle positivo de PBMC mais TT dt. Agora retorne o mouse para sua gaiola para o mouse.

Número dois, injete a almofada do pé direito com PBMC mais antígeno alo, e a almofada do pé esquerdo com PBMC mais antígeno alo, mais TT dt. Certifique-se de que não há fugas cerca de 18 a 24 horas após a injeção. Anestesiar cada rato com flúor isof e repetir a medição do inchaço da pata.

Subtraia a espessura de cada almofada do pé antes da injeção do valor pós-injeção para obter o valor do inchaço da almofada do pé. Em seguida, calcule o inchaço líquido específico do antígeno subtraindo o valor do inchaço da almofada de controle dos valores de inchaço da pata obtidos nos tratamentos. Verifique o controle positivo lendo uma resposta de controle positivo para recordar o antígeno TT DT maior ou igual a 25 vezes 10 elevado a menos quatro polegadas de distância.

A resposta de fundo ao PBS é necessária para que o teste seja considerado válido. Em seguida, determine a inibição das respostas de recordação na presença de antígenos do doador. Este experimento avalia receptores de transplante renal quanto à resposta específica do antígeno do doador e quanto à regulação.

Existem três padrões principais de hipersensibilidade do tipo tardio em receptores de transplante, regulatório, não regulatório e sensibilizado. Todos os pacientes responderam fortemente ao controle positivo do antígeno recordatório tt. O paciente número 62 mostra o padrão regulatório caracterizado por uma resposta fraca ao antígeno do doador e uma supressão acentuada ligada à resposta do antígeno recordado na presença do antígeno do doador.

Este é o padrão que se mostrou associado à tolerância ao aloenxerto de órgãos. O paciente número 48 exibe um padrão não regulatório, que tem a característica de uma resposta fraca ao doador, mas sem supressão vinculada. Esse padrão tem sido frequentemente observado em pacientes em uso de drogas imunossupressoras.

O paciente número oito exibe o padrão sensibilizado do doador caracterizado por uma alta resposta ao antígeno do doador e nenhuma supressão associada. Essa resposta está associada à rejeição do enxerto. Em estudos de caso clínico, os BMCs P de indivíduos inscritos em um ensaio observacional foram testados quanto à via indireta específica do doador, efetor T e respostas regulatórias T para avaliar o papel da regulação específica do doador na tolerância clínica.

As respostas indiretas do tector aos antígenos do doador revelam um espectro distinto entre os grupos de inscrição. O inchaço da pata aumenta à medida que o estado clínico do paciente passa daqueles que são tolerantes para aqueles que são cronicamente rejeitados. Aqui, o ensaio de supressão vinculado mede a via indireta antidoadora da resposta regulatória T.

Esses dados mostram uma diminuição nas respostas regulatórias ao longo da faixa de pacientes mais tolerantes a pacientes de rejeição crônica intermediários a menos tolerantes. Tomados em conjunto. A regulação imunológica, medida pelo ensaio DTH trans vivo, parece ser um mecanismo importante para a aceitação do aloenxerto renal.

Uma área promissora é a aplicação do ensaio TDTH no monitoramento da autoimunidade. Nosso estudo do papel do colágeno tipo cinco no processo patológico da síndrome de bronquiolite OBL revelou que o maior risco relativo de desenvolvimento de BOS foi observado em pacientes com resposta positiva ao colágeno. Cinco pbmc de receptores de transplante de pulmão, mas não de controles saudáveis ou colágeno.

Quatro pacientes reativos da síndrome do bom pasto após transplante renal foram frequentemente colágeno cinco reagentes. O ensaio TDTH também pode ser usado para testar a reatividade do pbmc de pacientes com câncer para antígenos específicos do tumor. Por exemplo, a presença de células T reguladoras de PAP específicas em pacientes com câncer de próstata pode limitar a resposta à vacinação com o antígeno PAP.

O ensaio TRANSVAAL DTH é um novo teste diagnóstico com aplicação clínica na avaliação de respostas imunes mediadas por células em pacientes transplantados com câncer e autoimunes. É valioso porque não é apenas útil no monitoramento das respostas de recordação do efetor t, mas também pode ser usado para detectar respostas regulatórias T porque não depende de uma medição específica de citocinas para detectar células T de efeito ou reguladoras. É muito flexível e amplamente aplicável.