Avaliação Geração isométrica e excêntrica Força dos músculos esqueléticos Isolado de modelos murinos de Distrofias Musculares

O objetivo geral deste procedimento é medir as propriedades mecânicas dos músculos esqueléticos isolados de camundongos. Isso é feito dissecando primeiro o músculo extensor longo dos dedos ou EDL, bem como o músculo diafragma do animal. Depois de preparar uma tira de diafragma, prenda o EDL e a tira de diafragma em um prato de solução de ringer oxigenada e, em seguida, amarre as alças de sutura em ambas as extremidades dos músculos.

Em seguida, o EDL ou tira de diafragma é preso em um banho de órgão entre dois eletrodos conectados a um transdutor de força ou alavanca em uma extremidade e ajustado ao seu comprimento ideal com base na força de contração. A etapa final é estimular o músculo usando uma série de protocolos mecânicos e medir a produção de força. Em última análise, o cálculo da produção de força, a relação de frequência de força de resistência a danos e outras propriedades são usadas para mostrar a força e integridade e outras propriedades do músculo e, se aplicável, os efeitos de um tratamento ou modificação genética.

Essa técnica pode ser usada para testar possíveis terapias para as distrofias musculares, pois a maioria dessas terapias visa recuperar a força muscular e reduzir a fragilidade muscular. Embora não sejamos os primeiros a utilizar essa técnica, usamos rotineiramente para estudar vários modelos diferentes de camundongos e avaliar sua função muscular, e também para caracterizar e avaliar várias terapias para as distrofias musculares. Além da Dra. Catherine Morewood, demonstraremos esse procedimento usando dois membros de nosso núcleo de avaliação fisiológica, Dr. Min Liu, um pesquisador associado, e o Sr. Ian, um especialista em pesquisa.

Os camundongos usados neste procedimento são anestesiados com cetamina e xilazina para garantir que não sintam dor ou angústia, mas os músculos permanecem bem oxigenados pela circulação. Após confirmar por uma pinça do dedo do pé que o animal está suficientemente anestesiado, imobilizar seus membros superiores com fita adesiva e remover a pele do membro posterior anterior inferior para expor os músculos dessa área, manter os músculos úmidos com a aplicação de PBS em intervalos regulares. Sob um escopo de dissecação, faça uma pequena incisão lateral ao joelho para expor o tendão proximal do extensor longo dos dedos ou músculo EDL.

Existem dois tendões nesta região e ambos devem ser cortados para permitir a remoção do EDL no tornozelo medial. Corte o tendão do músculo tibial anterior ou TA para expor os tendões distais do EDL, que se estendem ao longo dos metatarsos. Levante o músculo TA para fora do caminho.

Tomando cuidado para não cortar ou tocar no EDL por baixo. Retorne aos tendões distais do EDL e corte cada um. Em seguida, segure os tendões e puxe suavemente o EDL para longe do resto do membro.

Deve ser liberado livremente da extremidade proximal. Remova o músculo EDL e coloque em um prato de dissecação cheio de espremedores oxigenados resfriados. Prenda o músculo através dos tendões aproximadamente no comprimento de repouso, que é o comprimento encontrado in vivo.

O comprimento é muito curto quando o músculo está inflamado no prato e muito longo se o músculo estiver puxando os pinos de dissecação. Amarre as suturas aos tendões o mais próximo possível do músculo, mas sem tocar o músculo. Prenda o músculo aproximadamente no comprimento de repouso usando as suturas.

Para iniciar este procedimento. Faça uma incisão na pele do animal sacrificado. Para expor a cavidade abdominal e torácica.

Abra a cavidade abdominal e corte a parede do corpo logo abaixo das costelas usando uma tesoura de osso e começando acima da inserção do diafragma. Corte ao redor de toda a caixa torácica seguindo a linha das costelas e corte a lombada. Corte os vasos sanguíneos que passam pelo centro do diafragma para que o diafragma possa ser removido facilmente.

Remova o diafragma do mouse e coloque em uma placa de dissecação cheia de anéis oxigenados. Agite suavemente o diafragma no prato para lavar o sangue. Atualize a solução de campainha conforme necessário.

Em seguida, corte uma pequena tira do diafragma do tendão central até as costelas ao longo da orientação das fibras na porção central dos hemidiafragmas laterais. A tira deve ter entre dois a quatro milímetros de largura. Amarre as suturas no tendão central, amarre as suturas em cada uma das extremidades das costelas salientes lateralmente e, em seguida, amarre-as para fazer um grande laço usando uma tesoura de osso.

Corte a nervura em ambos os lados da tira, deixando aproximadamente um a dois milímetros, saliência da nervura em ambos os lados do diafragma. A avaliação da geração de força de tira dos músculos esqueléticos isolados é realizada por um sistema de teste muscular in vitro para montar os músculos no banho do mecânico, agarrar as suturas e usá-las para prender o músculo a um poste rígido em uma extremidade e a um transdutor de força na outra extremidade. Uma boa aproximação é o comprimento do músculo em repouso.

Como mostrado anteriormente, o banho é preenchido com solução de ringer oxigenada mantida a 22 graus Celsius. Para prolongar a estabilidade muscular para testar os músculos deve-se descansar por cinco minutos neste banho antes do teste funcional, de modo que a temperatura muscular seja equiparada a 22 graus Celsius para estabelecer condições de estimulação supramáximas. Depois que um músculo é colocado no banho, use pulsos de estimulação únicos de 0,5 milissegundo para gerar uma contração e monitorar a saída de força.

Aumente gradualmente a corrente até que a força atinja um nível máximo, mas constante, aumente a corrente para 10% a mais do que esse nível para os experimentos restantes para estabelecer o comprimento ideal, primeiro, certifique-se de que o músculo não esteja frouxo, mas também não seja ensinado. Uma boa aproximação é o comprimento do músculo em repouso, conforme mostrado anteriormente. Usando estímulos de contração isométrica, ajuste o comprimento do músculo gradualmente até que uma força máxima seja obtida.

Descanse o músculo cerca de 10 segundos entre cada contração. O comprimento muscular ideal é alcançado quando a força de contração é o comprimento muscular máximo do registro usando paquímetros. Para o EDL, é o comprimento entre as junções miotendinosas.

Para o diafragma, é o comprimento entre a junção miotendonosa do tendão central e a inserção muscular na costela. Para determinar a força isométrica máxima do Titanic, estimule o músculo ajustado no comprimento ideal do músculo por um período de 500 milissegundos com uma série de pulsos de 0,5 milissegundos na estimulação super máxima e na frequência de fusão. O platô para os músculos EDL é normalmente alcançado com 120 hertz e para os músculos do diafragma com 100 hertz estimulam três vezes na respectiva frequência com períodos de descanso de cinco minutos entre as sessões de estimulação para cada músculo após um descanso de cinco minutos.

Depois de realizar as contrações isométricas, inicie o procedimento para contrações excêntricas. Estimule o músculo a 80 hertz isometricamente durante os 500 milissegundos iniciais, seguido por um alongamento de 10% do comprimento muscular ideal na estimulação final de 200 milissegundos. Repita o padrão de estimulação com cinco minutos de descanso entre eles.

Para o número desejado de contrações excêntricas, meça a força para cada contração no período de tempo anterior ao alongamento. Calcule a queda de força entre a primeira e a última contração na conclusão do teste funcional. Encurte o comprimento do músculo e remova suavemente o músculo do transdutor e do poste.

Retorne o músculo para um prato de dissecação com toques. Remova as suturas dos músculos para o músculo EDL. Bloqueie o músculo duas vezes e pese-o antes do processamento subsequente.

Isso será importante para calcular a área da seção transversal e a força específica para o músculo diafragma mergulhar em 0,1% pros e laranja, uma membrana e corante permeável por 15 a 20 minutos. Isso fornecerá um índice de dano de dissecção, dissecará o músculo diafragma longe da inserção óssea, bem como do tendão central. Isso é necessário para fornecer um peso preciso do músculo antes da pesagem e preparação subsequente.

A área da seção transversal ou CSA é calculada usando a seguinte fórmula, onde L sobre LO é a relação fibra/comprimento muscular e 1,06 é a densidade dos valores esperados do músculo para as forças isométricas no tipo selvagem C 57 e distrofia muscular ou músculos M-D-X-E-D-L de animais de 12 semanas de idade são mostrados nesta figura. Como os músculos MDX exibem hipertrofia compensatória, a força total a titânica pode ser maior no músculo MDX em comparação com os controles do tipo selvagem da mesma idade. Uma medida mais apropriada da saída funcional é a força específica onde a força é normalizada para a área da seção transversal.

Para calcular esse valor, a força específica depende da capacidade funcional inerente do músculo, onde a fraqueza nos músculos distróficos é mais aparente quando a força absoluta e a área da seção transversal são contabilizadas. Observou-se neste estudo que os músculos EDL de camundongos MDX geram forças específicas aproximadamente 20 a 25% menores do que aqueles de camundongos do tipo selvagem pareados com a idade de 10 a 26 semanas de idade. Para o diafragma, apenas a força específica é relevante para comparações, pois a preparação é uma parte do músculo dependente da dissecção.

Uma comparação da força específica entre o músculo C 57 do tipo selvagem indicado pela linha azul e o músculo diafragma MDX indicado pelas barras vermelhas reflete a patologia progressiva neste tecido. A produção de força isométrica diminui com a idade, de modo que, aos seis meses de idade, os músculos do diafragma de camundongos MDX não produzem mais do que metade da produção funcional das tiras de diafragma de controles de tipo selvagem pareados por idade. Um exemplo de contrações excêntricas do teste do diafragma é mostrado nesta figura.

Com cada contração excêntrica subsequente, a saída da força diminui nas tiras de diafragma do tipo C 57 selvagem mostrado em azul e MDX No entanto, a perda de força é mais dramática em amostras de músculo do camundongo MDX, presumivelmente pela ausência de distrofina e suas proteínas associadas, uma vez dominadas. Esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora para um único músculo se for realizada corretamente seguindo esta técnica.

Outros métodos, como western blotting ou outras medições bioquímicas, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como se o tratamento alterou os níveis de proteína ou normalizou a integridade muscular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar o EDL e o diafragma do mouse e como medir e analisar a produção de força antes e depois das contrações excêntricas.