Name: Avaliação Geração isométrica e excêntrica Força dos músculos esqueléticos Isolado de modelos murinos de Distrofias Musculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Aprenda a avaliar propriedades mecânicas de músculos esqueléticos isolados de camundongos usando contrações isométricas e excêntricas. Este método padronizado permite comparar músculos distroficos e saudáveis em pesquisas de fisiologia muscular.

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Este trabalho foi financiado pela D. Paulo Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).

Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pela Universidade da Pensilvânia IACUC. 1. Dissecção EDL e Preparação (cerca de 30 min) <ol><li> Anestesiar ratos para garantir que eles não sentem dor ou desconforto durante o procedimento, mas que os músculos permanecem bem oxigenado pela circulação. Nós rotineiramente um cocktail ketamina / xilazina (100/10 mg / kg), injectada via IP. Plano cirúrgico de anestesia é determinada pela completa ausência de pedal ou reflexos de retirada palpedral, ou a falta de resposta de contracção da orelha. </li><li> Imobilizar os membros posteriores, utilizando fita adesiva médica, e retirar a pele da parte inferior do membro posterior anterior para expor a musculatura da área. Manter os músculos húmido com a aplicação de PBS, a intervalos regulares. </li><li> Sob um escopo de dissecação, fazer uma pequena incisão lateral ao joelho, a fim de expor o tendão proximal do músculo EDL. Há dois tendões nesta região, e ambos devem ser cortadas para permitir o regressoMoval da EDL. </li><li> No tornozelo medial, cortou o tendão do músculo TA para expor os tendões distais do EDL, que se estendem ao longo dos tarsos meta. Levante o músculo TA fora do caminho, tomando cuidado para não cortar ou tocar os debaixo EDL. Retornar para os tendões distais do EDL, snip cada um e atraí-los através do tornozelo, então segurando os tendões, puxe o EDL longe do resto do membro. Deve libertar a partir da extremidade proximal livremente, mas se não for, volte para a incisão lateral para assegurar que o tendão é cortado. Retire o músculo e coloque em um prato cheio de dissecar refrigerados Ringers oxigenados. Pin do músculo através dos tendões no comprimento aproximadamente de repouso, que é o comprimento encontrado in vivo. O comprimento é curto demais quando o músculo está flácido no prato, e por muito tempo se o músculo está puxando os pinos de dissecação. </li><li> Euthanize o mouse imediatamente após a remoção do músculo por deslocamento cervical. </li><li> Atar suturas para o 10dons, o mais próximo possível do músculo, mas não tocando o músculo. Pin o músculo em comprimento aproximadamente repouso usando as suturas. </li></ol> 2. Dissecção diafragma e Preparação (aproximadamente 30 minutos) <ol><li> Eutanásia dos ratos antes deste procedimento por deslocamento cervical, sob anestesia, mesmo se o rato é submetido a dois esvaziamentos, ou CO 2, seguido de confirmação com deslocamento cervical. </li><li> Fazer uma incisão na pele para expor a cavidade abdominal e torácica. Abra a cavidade abdominal, e cortar a parede do corpo, logo abaixo das costelas. Com uma tesoura de ossos, e de partida acima da inserção do diafragma, corte em torno de toda a caixa torácica, seguindo a linha das nervuras, e cortar através da coluna. Cortar os vasos sanguíneos que atravessam o centro do diafragma de modo que o diafragma pode ser removido facilmente. </li><li> Retire o diafragma do rato, e coloque em um prato cheio de dissecar Ringers oxigenados. Agite suavemente o DIAPhragm no prato para lavar o sangue. Refrescar solução de Ringer, conforme necessário. </li><li> Cortar uma tira pequena do diafragma do tendão no centro das nervuras ao longo da orientação das fibras na porção central das hemidiafragmas laterais. A tira deve ser entre 2-4 mm de largura. Com uma tesoura de ossos, corte a nervura em ambos os lados da tira, deixando aproximadamente 1-2 mm de saliência nervura em ambos os lados da tira de membrana. </li><li> Atar suturas ao tendão central. Laço de sutura para cada uma das extremidades das costelas lateralmente salientes e, em seguida amarrar estes em conjunto para fazer um laço grande. </li><li> Duas tiras podem ser obtidas a partir de qualquer dada diafragma (um de cada lado). </li></ol> 3. Músculos de montagem em Bath Mecânica <ol><li> Agarrar as suturas e usá-las para ligar o músculo a um poste rígida em uma extremidade, e a um transdutor de força, na outra extremidade. </li><li> Ajustar o comprimento para assegurar que o músculo não é folga, mas não está esticado. Uma boa aproximação é a musc repousole comprimento como em 1,4-1,5. </li><li> Banho deve ser cheio com solução de Ringer oxigenado mantida a 22 ° C para prolongar a estabilidade do músculo para teste. Músculos deve repousar durante 5 minutos neste banho, antes do teste funcional de modo que a temperatura do músculo é equilibrada a 22 ° C. </li></ol> 4. Contrações isométricas <ol><li> Estabelecer condições de estimulação supramáxima. Depois de um músculo é colocado no banho, usa pulsos de estimulação únicos 0,5 ms para gerar um tique, e monitorar a saída de força. Gradualmente aumentar a corrente até que a força atinge um nível máximo, mas constante. Aumentar a corrente a 10% mais do que este nível para os demais experimentos. </li><li> Estabelecer comprimento ideal. Usando estímulos contração isométrica, ajustar o comprimento do músculo gradualmente até que uma força máxima é obtida. Descansar o músculo ~ 10 segundos entre cada contração. Comprimento do músculo óptima (L o) é obtida quando a força é máxima contração. Comprimento de registro muscular (o comprimento sertre as junções miotendínea para EDL e entre a junção miotendínea tendão central e a inserção do músculo para a nervura), utilizando compassos de calibre de Vernier. </li><li> Força isométrica máxima tetânica. Estimular o músculo fixado em L o por um período de 500 ms, com uma série de pulsos de 0,5 ms a estimulação supramáxima e na freqüência de fusão (a partir do planalto da relação freqüência-força (por exemplo, Ref:. 8) O planalto para os músculos EDL é tipicamente alcançado com 120 Hz, e para os músculos do diafragma com 100 Hz. Estimular a 3 vezes na freqüência correspondente com períodos de descanso de 5 minutos entre as sessões de estimulação para cada músculo. </li></ol> 5. Contrações excêntricas <ol><li> Permitir muscular para descansar 5 minutos entre a realização de contrações isométricas e excêntricas. </li><li> Estimular os músculos a 80 Hz para o isometricamente inicial de 500 ms, seguido de um estiramento de 10% L o na final estimulação msec 200 (uma taxa de estiramento de 0,5 L o/ Seg.) </li><li> Repita padrão de estimulação com 5 min entre descansos para o número desejado de contrações excêntricas. </li><li> Medir a força de cada contracção no período de tempo antes do estiramento. Calcule a queda na força de contração entre o primeiro eo último. </li></ol> 6. Remoção do músculo do Aparelho <ol><li> Encurtar o comprimento do músculo para permitir a remoção suave do músculo do transdutor e postar e devolvê-lo a um prato de dissecação com Ringer. </li><li> Remover as suturas dos músculos. </li><li> Para o músculo EDL, limpar o músculo, duas vezes, em seguida, pesar, antes de um processamento subsequente (por exemplo, congelamento de fixação, etc.) Isto será importante para o cálculo da área da secção transversal, e uma força específica. </li><li> Para o músculo do diafragma, embeber em 0,1% Procion laranja, um corante impermeante de membrana para 15-20 min. Isto irá proporcionar um índice de dano dissecção. </li><li> Dissecar a distância do músculo esquelético de inserção, bem como o centtendão ral. Isto é necessário para proporcionar um peso preciso do músculo. Blot como acima antes da pesagem e posterior preparação. </li><li> Calcular a área transversal (CSA): CSA (mm 2) = massa (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)], onde L / L o é a fibra de músculo relação comprimento (0,45 para EDL, 1,0 para o diafragma) 5 e 1,06 é a densidade do músculo. </li></ol>

<ol><li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TREAT-NMD%22%5BJournal%5D)">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li>
<li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li>
<li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young%2C+adult+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li>
<li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li>
<li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582(2011).</li>
<li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li>
<li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li>
<li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li>
<li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li>
</ol>

Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Aurora Científica.

O objetivo deste artigo é fornecer orientação para a execução da função muscular isolado em dois músculos de camundongos - a EDL e do diafragma. A avaliação destes músculos pode fornecer informações sobre se deve ou não candidatos terapêuticos para a doença muscular são benéficas. Para ambos os músculos, o principal fator na obtenção de dados consistentes que uma dissecação limpa. Portanto, praticando e aperfeiçoando o passo isolamento inicial é essencial antes de passar para testes funcionais. Além disso, o estabelecimento de parâmetros funcionais para muscular normal é fundamental antes de fazer comparações com o músculo distrófico, ou entre os tratamentos. Isto irá assegurar que os resultados do estudo não estão sujeitos a variabilidade conferida pela capacidade da pessoa que realiza as experiências. O uso de um corante impermeante de membrana podem ajudar com a optimização da preparação de dissecação, para a incubação de qualquer músculo, em uma solução que contém um tal corante irá marcar a maioria das fibras danificadas, e pode servir como um indicador de dissection sucesso. Minimizar o número de fibras danificadas no músculo irá ajudar a otimizar a medição. As fibras danificadas por dissecção fluorescência muito mais intensamente do que os danos por contracção excêntrica, e por isso, se o corante é também usado durante o processo de mecânica, pode-se usar a intensidade do corante para distinguir entre os dois tipos de danos. Dissecação de tiras de membrana terá sempre os danos nas fibras, simplesmente porque, cortando ao longo do comprimento das fibras, inevitavelmente algumas são destruídas. A absorção do corante é forte em que essas fibras danificadas, e estas são normalmente restringida às arestas exteriores da preparação. Em média, observa-se uma banda de fibras danificadas isto é ~ 3 fibras de largura (~ 120 mm) de cada lado da tira de músculo. Se a faixa danificada compreende mais de 15% do músculo, em seguida, os dados são descartados. A preparação diafragma também tem restrições sobre o tamanho ideal para as medidas funcionais. Encontraram-se que os pedaços de diaphragm que são maiores do que 5 mm começam a dobrar-se sobre si mesmos, porque o empate tendão central é apenas em um ponto. Isto resulta numa diminuição da força específica na preparação. Verificámos também que as tiras mais estreitas também têm menor força específica, que acreditamos ser visto que o número de fibras que foram danificados durante a dissecção compreendem uma maior proporção do número total de fibras. Por exemplo, se 0,1 milímetros de cada lado está danificado e, em seguida, que é de 5% (2x0.1 mm / 4 tira mm) da preparação de músculo que não contribui para a força, enquanto que, se a tira é apenas 1 mm, em seguida, 20 % da preparação de músculo está danificado. Assim, tanto a largura da região danificada, bem como a largura de toda a preparação são factores importantes para controlar. As medições de tensão isométrica máxima requerem que todas as fibras musculares em um músculo é estimulado. Uma vez que há uma grande variedade na dos componentes de um aparelho de funcionamento, isto deve ser determinado para cada conjunto individual-se. Por exemplo, o tamanho do banho ou do tipo de estimulador pode afectar a intensidade da estimulação. Estimulação Twitch é uma forma razoável para determinar as condições de estimulação supramáximos. Uma vez que esta é estabelecida por uma configuração específica e muscular, ele pode ser utilizado para estudos posteriores. Em contrapartida, o comprimento óptimo de qualquer músculo dado tem de ser medida para cada preparação utilizando o processo iterativo descrito acima. Isto assegura que não há sobreposição de filamentos grossos e finos são ideais e a capacidade de produção máxima potencial força é medida. Os processos alternativos podem contar com os padrões de difracção associados com as estrias do músculo, mas isso requer equipamento adicional não descrito aqui. Rotineiramente usar 500 durações estimulação ms, que cai na faixa média deste parâmetro utilizado por outros investigadores nesta área. Embora isto possa causar alguma fadiga do músculo durante a contracção, o que é evidentepor um &quot;sag&quot; na produção de força máxima, isso por si só pode ser informativo. Por exemplo, uma diferença de fadiga pode ser obtida por diferentes tipos de terapias, incluindo aqueles manuseamento de cálcio que, portanto, o objectivo de sag em vigor durante a contracção activo pode servir como um indicador de melhoria. Em alternativa, a perda de força pode indicar que as suturas nos tendões não são suficientemente apertado, e que são o escorregamento durante a contracção. O músculo devem ser removidos a partir do banho e as suturas devem ser re-ligada se isto ocorre. Nós também utilizar uma série de 3 contracções tetânica, o que ajuda a estimar a estabilidade da preparação. Mais uma vez, deslizamentos de sutura levaria à perda de força entre as contrações, requerendo sutura re-subordinação. Grandes músculos também pode gerar núcleos anóxicas, que levam a perdas de força durante o protocolo. Tamanho muscular é um fator limitante para a realização de testes de função muscular isolado, onde os músculos EDL com massas superiores a 20 mg perder força a cada contraçãoção, e não pode ser suportado por superfusão de um banho. Tiras de membrana não sofrem as mesmas complicações porque são suficientemente fina para que a viabilidade prolongada no banho. Outros músculos podem ser utilizados para a função do músculo cardíaco isolado, incluindo o músculo sóleo, que é comumente utilizada, mas não descritas aqui. Muitos dos mesmos procedimentos podem ser adoptados para o sóleo, em termos de preparação e os testes funcionais. No entanto, as principais diferenças estão na freqüência de estimulação, e os parâmetros para contrações excêntricas. Utilização dos sóleo de função complementa a dos outros dois músculos, e por isso deve ser considerado como parte de um &quot;pacote&quot; de avaliação camundongos distróficos 4, 7. Contração excêntrica proporciona um índice de fragilidade contráctil, e é importante o uso de um protocolo que resulta em perda de força modesta em músculos de animais de tipo selvagem e de uma perda significativa da força nasnão tratados músculos distróficos para que haja uma ampla faixa dinâmica para comparações. A falta de qualquer perda de força nos músculos normais sugerem que a contração excêntrica é muito leve, e não será suficiente para distinguir entre as terapias que não são eficazes e as que são realmente benéfica. No entanto, uma perda dramática de força nos músculos normais submetidos a contração excêntrica pode ser muito grande para trazer à tona diferenças associadas com a doença. O protocolo para o EDL e diafragma utiliza uma taxa de estiramento 0,5 Lo / sec para produzir uma alteração de comprimento de 10%. Nós normalmente executam 5 contrações excêntricas, que resultam em uma pequena perda de força nos músculos normais e uma significativa perda de força nos músculos distróficos. Certamente, todos estes parâmetros podem ser variados para aumentar o comprimento global mudança, a taxa de estiramento, ou o número de contracções excêntricas para distinguir diferenças entre músculo doente e saudável, bem como sobre os efeitos de um tipo específico de mutação ou tratamento um está estudando. Enquanto não existe uma diferença marcada entre os músculos normais e doentes, então existe um padrão de ouro para alcançar em termos de tratamentos. Em resumo, este protocolo estabelece as diretrizes para a realização de contrações isométricas e excêntricas, e espero que identifica os potenciais armadilhas a evitar quando definir esta técnica em seu laboratório.

As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais tratamentos para patologias do músculo, assim como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Para doença muscular, o uso de modelos de ratos se tornaram um componente central para a compreensão das ligações entre genótipo e fenótipo, e para estender esse conhecimento para o desenvolvimento e teste de terapêuticas potenciais. As distrofias musculares, em particular, basearam-se em ratos, para avaliar estes agentes e estabelecer dados pré-clínicos necessários para avançar para ensaios clínicos em doentes. A medida do resultado frequente usa a função do músculo cardíaco isolado para determinar a força, a qual é aplicável a uma ampla gama de estudos. Outra medida é a utilização de excêntricos, ou alongamento, contracções para determinar as alterações na integridade da membrana muscular, o que é deficiente na distrofia muscular de Duchenne, eo modelo de rato desta doença (mdx). Portanto, é essencial para estes tipos de measurementos para ser sensível e reprodutível. O rato extensor digitorum longus (EDL) do músculo tem sido amplamente utilizado para a função do músculo cardíaco isolado, devido à sua geometria e tamanho ideal, incluindo a orientação das fibras uniforme e tendões definitivas 2, 5, 6, 10, 12. Métodos para músculos EDL medições isométricas funcionais foram descritos numa publicação anterior JoVE 8, bem como na SOP Treat-NMD 1. Nós estendemos a descrição destes métodos para incluir tanto contrações isométricas e excêntricas. Características da doença são evidentes no EDL, incluindo os ciclos heighted de degeneração / regeneração e produção de força diminuída. O diafragma de rato apresenta a progressão mais rápida patológica de distrofia muscular em comparação com outros músculos do rato 11. Aos 6 meses de idade, fibrose cumulativa compreende aproximadamente 50% do músculo. Isto resulta em significativamente diminuissed produção de força 11. Portanto, agentes terapêuticos que podem impedir a infiltração fibrótica pode ser avaliada de forma eficiente no diafragma. A perda da distrofina no músculo leva ao aumento da fragilidade e danos contráctil aumentada em todos os 9 músculos. Portanto, muitas terapias para a distrofia muscular de Duchenne são voltadas para a substituição da distrofina. Como tal, um ensaio que se tornou essencial para a avaliação destas estratégias é a contração excêntrica, que podem distinguir entre o músculo normal e distrófica, bem como determinar o que beneficiem de uma estratégia particular, para proteger um músculo distrófico de danos contrátil 2, 3, 4, 12. Este procedimento requer um duplo modo de servo-motor, que é capaz de modular / registo de tamanho e força, ou por um método de ajustar o comprimento rapidamente separado a partir de um transdutor de força.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sistema de teste in vitro do músculo </td><td> Aurora Científico </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE fonte de luz </td><td> Schott-FOSTEC </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Tesouras de dissecação </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Angulares tesoura de dissecção </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Cabo de bisturi </td><td> Belas Science Tools </td><td> 10003-12 </td><td> ferramenta de dissecação alternativo </td></tr><tr><td> Curvadas lâminas de bisturi # 12 </td><td> Ciência finaFerramentas </td><td> 10012-00 </td><td> ferramenta de dissecação alternativo </td></tr><tr><td> Tesoura osso </td><td> Belas Science Tools </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T sutura subordinação fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont SS fórceps - angular </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Tamanho sutura trançada de seda 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> Fita médica </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de cetamina 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Dose final é de 80 mg / kg </td></tr><tr><td> Injecção TranquiVed (xilazina 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Dose final é de 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reativo laranja 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Componentes da solução Ringers </td><td></td><td></td><td> Solução é equilibrada com o gás de 95% de O2 e 5% de CO 2, pH final 7,4 </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Concentração Final: 118 mM </td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> A concentração final: 4,7 mM </td></tr><tr><td> Di-hidrato de cloreto de cálcio </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> A concentração final: 2,5 mM </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> A concentração final: 1,2 mM </td></tr><tr><td> O sulfato de magnésio </td><td> JT Baker </td><td> 2500-01 </td><td> Concentração final: 0,57 mM </td></tr><tr><td> 4 - (2-hidroxietil) tuborazine-1-etanossulfónico (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Concentração final: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> A concentração final: 5,5 mM </td></tr></tbody></table>

avaliação geração isométrica e excêntrica força dos músculos esqueléticos isolado de modelos murinos de distrofias musculares

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Crítico para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para a doença muscular são sensíveis e reprodutíveis avaliações fisiológicas da função muscular. Porque muitos ensaios pré-clínicos confiam em modelos de mouse para estas doenças, a função muscular isolado tornou-se um dos padrões para Go / NoGo decisões em movimento candidatos da droga para a frente em pacientes. Iremos demonstrar a preparação do extensor digitorum longus (EDL) e músculos do diafragma para testes funcionais, que são os músculos predominantes utilizados para estes estudos. A geometria do músculo EDL é ideal para preparações de músculo isolado, com dois tendões facilmente acessíveis, e um tamanho pequeno, que pode ser suportado por superfusão de um banho. O diafragma apresenta profunda patologia progressiva em animais distróficos, e pode servir como uma plataforma para avaliar muitas terapias potenciais contrariando fibrose, e promover a estabilidade fibromuscular. Protocolos para testes de rotina, incluindo isométrica e excêntricacontrações TRIC, será mostrado. Força isométrica fornece a avaliação da resistência, e as contracções excêntricas ajudar a avaliar a estabilidade do sarcolema, que é interrompida em diversos tipos de distrofias musculares. As comparações dos resultados esperados entre os músculos de tipo selvagem e os músculos distróficos também será fornecida. Estas medidas podem complementar as medições morfológicas e bioquímicas da homeostase do tecido, bem como a avaliação de animais inteiros da função muscular.

Os valores esperados para as forças isométricas do músculo EDL a partir de 12 semanas de idade, os animais são mostrados na Figura 1. Como os músculos mdx apresentam hipertrofia compensatória, força tetânica total pode ser maior em comparação com o músculo mdx idade controlos de tipo selvagem correspondentes. No entanto, uma medida mais apropriada da saída funcional é a força específica (Figura 2), em que a força é normalizado para a área da secção transversal para calcular este valor. Força específica depende da capacidade inerente funcional do músculo, em que a fraqueza nos músculos distróficos é mais aparente quando tanto a força absoluta e área da secção transversal são contabilizados. Em nossas mãos, músculos EDL de camundongos mdx gerar aproximadamente 20 - 25% mais baixas do que aquelas forças específicas de idade foram camundongos tipo selvagem 10-26 semanas de idade. Para o diafragma, apenas a força específica é relevante para comparações, porque a preparação é uma parte do músculo dependente da Dissection. Comparação da força específica entre o tipo selvagem e os músculos do diafragma mdx reflecte a patologia progressiva neste tecido. Saída de força isométrica diminui com a idade (Figura 3), de modo que aos 6 meses de idade, os músculos do diafragma de ratos mdx produzir mais do que metade do produto funcional do diafragma a partir de tiras de controles pareados por idade de tipo selvagem. Um exemplo de contracções excêntricas dos testes diafragma é mostrado na Figura 4. Com cada contracção subsequente excêntrico, produção de força diminui em tiras de membrana de ambos tipo selvagem (C57) e ratos mdx. No entanto, a perda de força é mais dramática em amostras de músculo do rato mdx, presumivelmente a partir da ausência de distrofina e suas proteínas associadas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Figura 1. Força tetânica isométrica no tipo selvagem e EDL mdx f músculos<html> camundongos rom 12 semanas de idade. Força absoluta pode ser maior em pareados por idade músculos mdx EDL devido à hipertrofia compensatória. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Figura 2. Força isométrica tetânica normalizados por área seccional muscular é Força específico, e revela pressionada a capacidade funcional do músculo EDL a partir de ratos mdx em comparação com aqueles dos ratinhos de tipo selvagem. Traços são dos mesmos ratinhos como mostrado na Figura 1. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Figura 3. A perda progressiva da capacidade de geração de força avaliada por força específica é mais aparente no diafragma de ratos mdx (barras vermelhas) em comparação com o tipo selvagem (C57 na linha azul). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. A perda de força em função do número de contração excêntrica para os músculos do diafragma a partir de 12 semanas de idade e C57 ratos mdx. Os dados são médias ± SEM para N = 4 músculos por genótipo.

As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para o músculo patologia, bem como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Vamos demonstrar a preparação do extensor longo dos dedos e músculos do diafragma para testes funcionais. Protocolos para contrações isométricas e excêntricas será mostrado, bem como as diferenças de resultados entre os músculos distróficos, representando um estado patológico, e os músculos de tipo selvagem.

Avaliação Geração isométrica e excêntrica Força dos músculos esqueléticos Isolado de modelos murinos de Distrofias Musculares

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

O objetivo geral deste procedimento é medir as propriedades mecânicas dos músculos esqueléticos isolados de camundongos. Isso é feito dissecando primeiro o músculo extensor longo dos dedos ou EDL, bem como o músculo diafragma do animal. Depois de preparar uma tira de diafragma, prenda o EDL e a tira de diafragma em um prato de solução de ringer oxigenada e, em seguida, amarre as alças de sutura em ambas as extremidades dos músculos.Em seguida, o EDL ou tira de diafragma é preso em um banho de órgão entre dois eletrodos conectados a um transdutor de força ou alavanca em uma extremidade e ajustado ao seu comprimento ideal com base na força de contração. A etapa final é estimular o músculo usando uma série de protocolos mecânicos e medir a produção de força. Em última análise, o cálculo da produção de força, a relação de frequência de força de resistência a danos e outras propriedades são usadas para mostrar a força e integridade e outras propriedades do músculo e, se aplicável, os efeitos de um tratamento ou modificação genética.Essa técnica pode ser usada para testar possíveis terapias para as distrofias musculares, pois a maioria dessas terapias visa recuperar a força muscular e reduzir a fragilidade muscular. Embora não sejamos os primeiros a utilizar essa técnica, usamos rotineiramente para estudar vários modelos diferentes de camundongos e avaliar sua função muscular, e também para caracterizar e avaliar várias terapias para as distrofias musculares. Além da Dra. Catherine Morewood, demonstraremos esse procedimento usando dois membros de nosso núcleo de avaliação fisiológica, Dr. Min Liu, um pesquisador associado, e o Sr. Ian, um especialista em pesquisa.Os camundongos usados neste procedimento são anestesiados com cetamina e xilazina para garantir que não sintam dor ou angústia, mas os músculos permanecem bem oxigenados pela circulação. Após confirmar por uma pinça do dedo do pé que o animal está suficientemente anestesiado, imobilizar seus membros superiores com fita adesiva e remover a pele do membro posterior anterior inferior para expor os músculos dessa área, manter os músculos úmidos com a aplicação de PBS em intervalos regulares. Sob um escopo de dissecação, faça uma pequena incisão lateral ao joelho para expor o tendão proximal do extensor longo dos dedos ou músculo EDL.Existem dois tendões nesta região e ambos devem ser cortados para permitir a remoção do EDL no tornozelo medial. Corte o tendão do músculo tibial anterior ou TA para expor os tendões distais do EDL, que se estendem ao longo dos metatarsos. Levante o músculo TA para fora do caminho.Tomando cuidado para não cortar ou tocar no EDL por baixo. Retorne aos tendões distais do EDL e corte cada um. Em seguida, segure os tendões e puxe suavemente o EDL para longe do resto do membro.Deve ser liberado livremente da extremidade proximal. Remova o músculo EDL e coloque em um prato de dissecação cheio de espremedores oxigenados resfriados. Prenda o músculo através dos tendões aproximadamente no comprimento de repouso, que é o comprimento encontrado in vivo.O comprimento é muito curto quando o músculo está inflamado no prato e muito longo se o músculo estiver puxando os pinos de dissecação. Amarre as suturas aos tendões o mais próximo possível do músculo, mas sem tocar o músculo. Prenda o músculo aproximadamente no comprimento de repouso usando as suturas.Para iniciar este procedimento. Faça uma incisão na pele do animal sacrificado. Para expor a cavidade abdominal e torácica.Abra a cavidade abdominal e corte a parede do corpo logo abaixo das costelas usando uma tesoura de osso e começando acima da inserção do diafragma. Corte ao redor de toda a caixa torácica seguindo a linha das costelas e corte a lombada. Corte os vasos sanguíneos que passam pelo centro do diafragma para que o diafragma possa ser removido facilmente.Remova o diafragma do mouse e coloque em uma placa de dissecação cheia de anéis oxigenados. Agite suavemente o diafragma no prato para lavar o sangue. Atualize a solução de campainha conforme necessário.Em seguida, corte uma pequena tira do diafragma do tendão central até as costelas ao longo da orientação das fibras na porção central dos hemidiafragmas laterais. A tira deve ter entre dois a quatro milímetros de largura. Amarre as suturas no tendão central, amarre as suturas em cada uma das extremidades das costelas salientes lateralmente e, em seguida, amarre-as para fazer um grande laço usando uma tesoura de osso.Corte a nervura em ambos os lados da tira, deixando aproximadamente um a dois milímetros, saliência da nervura em ambos os lados do diafragma. A avaliação da geração de força de tira dos músculos esqueléticos isolados é realizada por um sistema de teste muscular in vitro para montar os músculos no banho do mecânico, agarrar as suturas e usá-las para prender o músculo a um poste rígido em uma extremidade e a um transdutor de força na outra extremidade. Uma boa aproximação é o comprimento do músculo em repouso.Como mostrado anteriormente, o banho é preenchido com solução de ringer oxigenada mantida a 22 graus Celsius. Para prolongar a estabilidade muscular para testar os músculos deve-se descansar por cinco minutos neste banho antes do teste funcional, de modo que a temperatura muscular seja equiparada a 22 graus Celsius para estabelecer condições de estimulação supramáximas. Depois que um músculo é colocado no banho, use pulsos de estimulação únicos de 0,5 milissegundo para gerar uma contração e monitorar a saída de força.Aumente gradualmente a corrente até que a força atinja um nível máximo, mas constante, aumente a corrente para 10% a mais do que esse nível para os experimentos restantes para estabelecer o comprimento ideal, primeiro, certifique-se de que o músculo não esteja frouxo, mas também não seja ensinado. Uma boa aproximação é o comprimento do músculo em repouso, conforme mostrado anteriormente. Usando estímulos de contração isométrica, ajuste o comprimento do músculo gradualmente até que uma força máxima seja obtida.Descanse o músculo cerca de 10 segundos entre cada contração. O comprimento muscular ideal é alcançado quando a força de contração é o comprimento muscular máximo do registro usando paquímetros. Para o EDL, é o comprimento entre as junções miotendinosas.Para o diafragma, é o comprimento entre a junção miotendonosa do tendão central e a inserção muscular na costela. Para determinar a força isométrica máxima do Titanic, estimule o músculo ajustado no comprimento ideal do músculo por um período de 500 milissegundos com uma série de pulsos de 0,5 milissegundos na estimulação super máxima e na frequência de fusão. O platô para os músculos EDL é normalmente alcançado com 120 hertz e para os músculos do diafragma com 100 hertz estimulam três vezes na respectiva frequência com períodos de descanso de cinco minutos entre as sessões de estimulação para cada músculo após um descanso de cinco minutos.Depois de realizar as contrações isométricas, inicie o procedimento para contrações excêntricas. Estimule o músculo a 80 hertz isometricamente durante os 500 milissegundos iniciais, seguido por um alongamento de 10% do comprimento muscular ideal na estimulação final de 200 milissegundos. Repita o padrão de estimulação com cinco minutos de descanso entre eles.Para o número desejado de contrações excêntricas, meça a força para cada contração no período de tempo anterior ao alongamento. Calcule a queda de força entre a primeira e a última contração na conclusão do teste funcional. Encurte o comprimento do músculo e remova suavemente o músculo do transdutor e do poste.Retorne o músculo para um prato de dissecação com toques. Remova as suturas dos músculos para o músculo EDL. Bloqueie o músculo duas vezes e pese-o antes do processamento subsequente.Isso será importante para calcular a área da seção transversal e a força específica para o músculo diafragma mergulhar em 0,1% pros e laranja, uma membrana e corante permeável por 15 a 20 minutos. Isso fornecerá um índice de dano de dissecção, dissecará o músculo diafragma longe da inserção óssea, bem como do tendão central. Isso é necessário para fornecer um peso preciso do músculo antes da pesagem e preparação subsequente.A área da seção transversal ou CSA é calculada usando a seguinte fórmula, onde L sobre LO é a relação fibra/comprimento muscular e 1,06 é a densidade dos valores esperados do músculo para as forças isométricas no tipo selvagem C 57 e distrofia muscular ou músculos M-D-X-E-D-L de animais de 12 semanas de idade são mostrados nesta figura. Como os músculos MDX exibem hipertrofia compensatória, a força total a titânica pode ser maior no músculo MDX em comparação com os controles do tipo selvagem da mesma idade. Uma medida mais apropriada da saída funcional é a força específica onde a força é normalizada para a área da seção transversal.Para calcular esse valor, a força específica depende da capacidade funcional inerente do músculo, onde a fraqueza nos músculos distróficos é mais aparente quando a força absoluta e a área da seção transversal são contabilizadas. Observou-se neste estudo que os músculos EDL de camundongos MDX geram forças específicas aproximadamente 20 a 25% menores do que aqueles de camundongos do tipo selvagem pareados com a idade de 10 a 26 semanas de idade. Para o diafragma, apenas a força específica é relevante para comparações, pois a preparação é uma parte do músculo dependente da dissecção.Uma comparação da força específica entre o músculo C 57 do tipo selvagem indicado pela linha azul e o músculo diafragma MDX indicado pelas barras vermelhas reflete a patologia progressiva neste tecido. A produção de força isométrica diminui com a idade, de modo que, aos seis meses de idade, os músculos do diafragma de camundongos MDX não produzem mais do que metade da produção funcional das tiras de diafragma de controles de tipo selvagem pareados por idade. Um exemplo de contrações excêntricas do teste do diafragma é mostrado nesta figura.Com cada contração excêntrica subsequente, a saída da força diminui nas tiras de diafragma do tipo C 57 selvagem mostrado em azul e MDX No entanto, a perda de força é mais dramática em amostras de músculo do camundongo MDX, presumivelmente pela ausência de distrofina e suas proteínas associadas, uma vez dominadas. Esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora para um único músculo se for realizada corretamente seguindo esta técnica.Outros métodos, como western blotting ou outras medições bioquímicas, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como se o tratamento alterou os níveis de proteína ou normalizou a integridade muscular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar o EDL e o diafragma do mouse e como medir e analisar a produção de força antes e depois das contrações excêntricas.

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