Análise da função do gene e Visualização de Cilia-Generated fluxo de fluidos em vesículas de Kupffer

O objetivo deste procedimento é modular os genes de função na vesícula de Kavas ou no KV no embrião de peixe-zebra que é responsável pela padronização esquerda direita e analisar o fluxo de fluido assimétrico gerado por motil clia entregando esferas fluorescentes no kv. Isso é feito pela primeira injeção de oligonucleotídeos morfológicos fluorescentes que reprimem a expressão de um gene específico de interesse na célula vitelina de um embrião em estágio médio de Dilla, de modo que eles sejam carregados nas células precursoras dorsais que dão origem ao kv. Em seguida, embriões injetados que possuem morfos fluorescentes apenas na célula vitelina e no kv são selecionados para análise posterior.

Em seguida, os embriões são montados em lâminas de depressão e esferas fluorescentes são injetadas no lúmen da vesícula cheia de líquido do kv. Finalmente, a microscopia de vídeo é usada para registrar os grânulos que fluem dentro do kv. Em última análise, podem ser obtidos resultados que determinam se a depleção específica do tecido de um gene candidato no KV altera o fluxo assimétrico de fluido por meio da análise quantitativa dos movimentos do grânulo.

A demonstração viral deste semestre é crítica, pois as injeções de molino específicas do estágio e as injeções de esferas de fluorescência são difíceis de aprender porque ambas dependem da proposição do embrião e do tempo de desenvolvimento do experimento. Para realizar injeções de morfologia global ou MO, colete os embriões imediatamente após a fertilização e carregue-os em uma placa de injeção. Use um fogo polido em nossa pipeta para colocar os embriões na placa de injeção para imobilizar os embriões.

Quebre a ponta de uma agulha de injeção e ajuste as configurações de injeção para criar uma gota de injeção com um volume de um nanolitro. Usando um microscópio de dissecação, injete um nanolitro de MO no jugo de pelo menos 50 embriões entre os estágios de uma e quatro células. Para injeção direcionada de M mo DFC, colete embriões imediatamente após a fertilização e incube a 28,5 graus Celsius.

Quando os embriões atingirem o estágio de 256 células, carregue-os rapidamente em uma placa de injeção e injete um nanolitro de MO fluorescente na gema. Injete pelo menos 100 embriões entre os estágios 256 e 1000 células para realizar a injeção direcionada à gema. Depois de incubar os ovos fertilizados até o estágio de cúpula, injete um nanolitro de MO fluorescente no jugo de pelo menos 100 embriões entre os estágios de cúpula e 30% da camada.

Quando os embriões injetados em M mo atingem 75% do estágio de dobra. Remova embriões não fertilizados e mortos sob um microscópio de dissecação para injeções globais de MO. Escolha embriões vivos para fluorescência uniformemente distribuídos por todas as células.

Para injeções de M mo direcionadas a DFC, selecione embriões com fluorescência difundida por toda a gema e concentrada na margem dérmica dorsal explodida. Para injeções de MO direcionadas à gema. Escolha embriões nos quais a fluorescência seja distribuída uniformemente por toda a gema e não observada em nenhuma célula embrionária entre os dois a quatro.

Então, estágios de ácaros. Selecione embriões direcionados a DFC que exibem fluorescência apenas nas células KV e na gema e descarte o restante para injeções direcionadas à gema. Selecione embriões com fluorescência exclusivamente na gema para analisar o fluxo assimétrico no KV de embriões injetados com MO comece usando uma pinça afiada para revestir cuidadosamente cerca de 20 embriões entre quatro a seis.

O mesmo pode acontecer com os estágios transferir um embrião para uma lâmina de depressão de vidro e remover o máximo de água possível. Imobilize o embrião adicionando aerodinâmica de ponto de fusão quente suficiente de 1% para cobri-lo apenas à medida que a aerodinâmica se solidifica. Use uma pinça para posicioná-lo de forma que o KV fique voltado para cima, monte 10 embriões, trabalhando rapidamente para garantir que todas as injeções sejam concluídas até os 10.

Então, estágio de ácaro. Depois de diluir microesferas fluorescentes de 0,5 mícron de diâmetro para uma a 50 em água estéril. Misture bem as esferas e carregue três microlitros em uma agulha capilar usando o mesmo microinjetor usado para injeções de MO.

Use uma pinça para quebrar a ponta da agulha e ajuste as configurações de injeção para gerar a menor injeção possível. Deixar cair. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, alinhe a agulha com o lúmen KV do primeiro embrião montado. Em seguida, insira a agulha no lúmen e injete menos de 0,5 nanolitros de contas.

Adicione uma gota de água estéril no aros para evitar que o embrião seque sob um microscópio fluorescente vertical. Usando uma tela objetiva de 20 x, os embriões injetados para entrega bem-sucedida de contas para cada embrião selecionado com contas dentro do KV em uma gota de água estéril para cobrir o aros. Em seguida, observe usando um microscópio composto fluorescente com uma objetiva de imersão em água de 63 x.

Usando uma câmera de alta velocidade montada no microscópio, grave um filme de dez segundos. Use o canal fluorescente para gravar as contas em aproximadamente 70 quadros por segundo e contraste de campo claro ou interferência diferencial para gravar o lúmen KV. Importe os filmes para a imagem J.Crie projeções máximas e use o software para rastrear os movimentos das contas individuais.

Esta figura mostra a distribuição de MO fluorescente em embriões vivos injetados específicos em estágio bem-sucedido. Uma injeção de MO malsucedida na qual a solução permanece agregada na célula vitelina é mostrada aqui. O fluxo de fluido em embriões injetados com sucesso pode ser medido qualitativa ou quantitativamente em um embrião de controle com esferas de fluxo normais.

Siga os caminhos no sentido anti-horário que podem ser visualizados fazendo uma projeção máxima das posições das esferas fluorescentes ao longo do tempo ou rastreando as esferas individuais ao longo do tempo. Para demonstrar a perda de embriões de fluxo coordenado foram injetados com MO para quebrar a quinase da linha dois B ou a rocha dois B, que interrompe o fluxo e, como resultado, os grânulos se movem aleatoriamente em kv, a velocidade média de cinco grânulos de controle e rocha dois embriões B mo é mostrada aqui Após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento explorarem genes e mecanismos no estabelecimento do acesso ao corpo esquerdo e direito no peixe-zebra.