Name: Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em C. elegans Como usar as ferramentas de código aberto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda a rastrear e quantificar processos de desenvolvimento em C. elegans usando ferramentas de código aberto como o IMOD. Este método permite reconstruir modelos 3D de células e analisar fenótipos mutantes de forma quantitativa.

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Os autores não têm nada a divulgar.

1. Preparação de C. elegans embriões para Lapso de tempo Microscopia usando Microbeads <ol><li> Transferência de vermes adultos grávidas usando uma picareta verme (fio de platina) em uma gota de tampão M9 e limpar as bactérias pela primeira vigorosamente agitando e, em seguida, transferindo cada worm para uma queda adjacente de M9 usando um chicote do olho montada em uma picareta do dente / ponteira ou use um capilar de vidro aguçado. </li><li> Dilui-se a dispersão contendo as 20 uM esferas de poliestireno diâmetro de 10-vezes em tampão M9 (1 tampão G M9 contém 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, e, depois de autoclavagem (20 min, 120 ° C), adicionar um adicional de 1 ml de uma solução 1 M 4 MgSO). </li><li> Adicione uma pipeta de boca a partir de qualquer tipo de capilar de vidro fina (por exemplo, ponto de fusão capilares pontuais ou capilares usados ​​para puxar as agulhas de injecção), cerca de um 0,5 m de comprimento pedaço de borracha, silicone ou material semelhante tubagem (de preferência transparente), A 200 ulponta da pipeta, a tampa de um tubo de PCR de 200 uL, de um filtro hidrofóbico de pequenas seringas (por exemplo., um 0,2-0,45 uM de tamanho de poro de 15-50 mm de diâmetro e de nylon, de PTFE ou material semelhante de filtro), e uma pipeta de 1000 ul ponta . Este tipo de boca pipeta garante que nenhum material biológico pode entrar em contacto com o experimentador. </li><li> Montar a pipeta através da inserção da ponta de uma pipeta de 200 uL com a ponta primeiro para o tubo e ligá-lo com a tampa de um tubo de PCR, que apresenta uma perfuração central que coincide com o diâmetro do capilar utilizado. Uma agulha furador ou preparação muito apontada pode ser usado para gerar a perfuração. </li><li> Desenhe um capilar fino e inseri-lo na perfuração. Inserir o filtro para a outra extremidade do tubo e inserir uma ponta de pipeta 1000 uL como peça de boca (Figura 1). </li><li> Dissecar adultos grávidas cortando transversalmente vermes na vulva com uma lâmina de barbear limpa ou bisturi. NOTA: Geralmente, muitos embriões e seráxpulsed após o corte. No entanto, se houver necessidade de embriões, às vezes eles têm que ser liberados a partir da carcaça usando um chicote do olho ou a agulha pontiaguda. </li><li> Pipetar uma gota da dispersão de bolhas de polistireno diluída (~ 4 mL) para uma tampa de vidro de 24x60 mm e em embriões de transferência de gota utilizando esta pipeta boca. </li><li> Com cuidado, coloque um pequeno (por exemplo, 18x18 ou 20x20 mm) tampa de vidro no topo da gota e certifique-se a queda foi totalmente se espalhar. NOTA: A queda também deve ser pequeno o suficiente para não tocar as bordas da tampa de vidro pequeno. </li><li> Selar a montagem com vaselina liquefeito. Adicionar uma gota de óleo de imersão no lado 24x60 lamínula mm e prossiga para a seção &quot;Lapso de tempo Microscopia &#39;. </li></ol> 2. Preparação de Adulto C. elegans Animais de Lapso de tempo Microscopia usando Nanobeads NOTA: Em geral, o protocolo para a montagem de animais adultos, é uma adaptação do protocolo de ref. 18.Com este protocolo, é possível a realização de microscopia confocal de lapso de tempo de longa duração de animais adultos. <ol><li> Prepara-se uma 1,5% (w / v) de solução de agarose em tampão M9, fervura (1 min, 100 ° C em banho de água ou de microondas). A utilização de maiores concentrações de agarose não é recomendado uma vez que isto pode levar a extrusão do intestino e / ou partes da gónada. </li><li> Atenha-se 2-3 camadas de fita em duas lâminas de microscópio cada. Coloque um slide sem fita entre os dois slides com fita. </li><li> Utilizar uma ponta de pipeta e colocar uma gota da solução de agarose quente no centro da lâmina secundária. Colocar rapidamente uma outra corrediça para a gota de modo que seja suportada pelas camadas de fita de cada lado. Isto irá criar uma almofada redonda e agar apartamento de cerca de 10 mm de diâmetro. </li><li> Colocar uma gota de solução de esferas 100 nm (não diluído, o qual é de 2,6% (w / v)) para a almofada. Transferir 1-10 vermes adultos limpas na gota com uma picareta worm. Selo com 18x18 mm e tampa de vidro de vaselina como explicado no ProtOCOL 1. </li></ol> Microscopia 3. Time-lapse <ol><li> Coloque uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina de microscópio ou o sanduíche tampa de vidro. Use campo claro a baixa ampliação (5x ou 10x lentes) para localizar a amostra. NOTA: Limite a exposição à luz azul, tanto quanto possível (em especial para C. elegans embriões), por exemplo, não use microscopia de epi-fluorescência para encontrar / concentrar a amostra, mas usar brightfield vez. </li><li> Mude a maior ampliação (40x ou 60x objetivos), levar a amostra em foco (ou plano central ou planos superiores / inferiores da amostra, dependendo do software de aquisição). </li><li> Defina os intervalos de amostragem para 30 aviões no 1 um espaçamento registrados a cada 1min. No caso de um palco xyz XY ou automatizada está disponível, vários pontos podem ser gravados em uma única sessão. Mudar para imagens de fluorescência e verifique o foco novamente. NOTA: Tente evitar o uso poderes alta de laser, em vez usar um pouco mais longos tempos de exposiçãoa muito baixas intensidades. Medida imagens adquiridas de imediato, quer no programa de aquisição de imagem ou em ImageJ para evitar a saturação, que corta a dinâmica variam e também significa a exposição à radiação excessiva. </li><li> Comece a gravar a série de lapso de tempo. NOTA: Para excluir análise de artefatos, comece com intervalos longos (3-10 min) Tempo entre a digitalização de amostra e aumentar gradualmente a amostragem temporal para os intervalos adequados. Tempo de desenvolvimento, bem como os pontos finais em ambos os casos deve ser semelhante ao realizar uma análise estatística. Além disso, é muitas vezes necessário para avaliar as taxas de sobrevivência e fototoxicidade. Portanto, recuperar espécime da montada após a microscopia de lapso de tempo a longo prazo e verificar se eles continuam a desenvolver / live. </li></ol> 4. Reconstruir um modelo celular Forma 3D com IMOD NOTA: O software IMOD está disponível a partir da página web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. A instalação do software é descreverd lá. Quando utilizar o Windows OS, um conjunto de ferramentas Unix tem de ser instalado, que também pode ser encontrado como um pacote na página IMOD. Além disso, há uma introdução 3dmod excelentemente compilado disponível na página IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html). <ol><li> Abra o shell do Unix e digite &quot;imod&quot;. A janela IMOD será aberta. Selecione o arquivo com os dados brutos (idealmente um tif empilhados ou semelhantes), de que para gerar um modelo 3D. </li><li> Localize a parte inferior e superior dos objetos na janela de Zap usando a janela de informações (up &amp; down ferramenta de rolagem). </li><li> Comece traçando os contornos celulares. Importante, garantir que cada célula é um objeto. Comece com o plano superior de cada célula e criar o primeiro contorno lá usando a janela de informações. Role para baixo na z e criar um novo contorno para cada plano z. </li><li> Faça o mesmo para o maior número de células conforme necessário para modelar em 3D. Não se esqueça de criar um novo objeto ao iniciar com uma nova célula. NOTA: Há muitas maneiras diferentes para o rastreamento de contorno e vários plugins votos. Por favor, visite o site IMOD e tutoriais on-line para obter detalhes. No caso mostrado, a configuração padrão foi usado. </li><li> Abra o &quot;Model View&quot; janela para inspecionar os objetos e seus contornos. </li><li> No &quot;Model View&quot; da barra de ferramentas escolher &quot;Editar&quot; - &quot;Objetos&quot;. A janela de edição respectivo será aberta. </li><li> Para modelar células como objectos cheios e fechados, escolha &quot;malha&quot; como &quot;Desenhar tipo de dados&quot; e &quot;Fill&quot; como &quot;estilo do desenho&quot;. Clique em &quot;engrenagens&quot; na seleção de rolagem no canto inferior esquerdo da janela. Marque a opção &quot;Cap&quot; na seleção no canto inferior direito. Confira como muitos objetos, conforme necessário e clique em &quot;Malha All&quot;. O programa irá gerar objetos sólidos das pilhas de contornos. O factor z-amostragem pode ser ajustado mudando &quot;Z-escala&quot; na janela &quot;Ver&quot;. </li><li> Move / girar o objec 3Dt (&quot;Edit&quot; - &quot;Ver&quot;) e salvar instantâneos ou filmes (&quot;File&quot; - &quot;Pressão Tiff como ...&quot; ou &quot;Movie / Montagem&quot;). </li></ol> 5. Rastreamento fluorescente Estruturas rotuladas com Endrov NOTA: De modo a rastrear restos de divisão celular, utilizar uma estirpe com um marcador de membrana nuclear ou plasma para a identificação de células (por exemplo, H2B, Ph-PLC-d1) e um marcador remanescente divisão celular (por exemplo, NMy-2, ZEN-4 ). O marcador nuclear ou de membrana de plasma é importante para determinar qual célula herda o remanescente a divisão celular. <ol><li> Para o carregamento rápido e facilidade de utilização, os dados em bruto tem que ser convertido para um ficheiro TIFF (por exemplo, em ImageJ). Em seguida, abra Endrov e carregar o arquivo a ser analisado, escolhendo a opção &quot;Carregar arquivo&quot; no menu arquivo. Clique no ícone &quot;visualizador 2D&quot; na barra de ferramentas. </li><li> Ajuste do histograma, clicando no ícone &quot;gama Fit&quot; (o ícone azul no canto inferior direitoda tela Endrov). Defina a resolução XYZ, indo para &quot;Data&quot; - &quot;filename&quot; - &quot;ImageSet&quot; - &quot;Channel&quot; - &quot;Definir XYZ-resolução&quot;. Tipo de valores para X, Y, e Z, por exemplo, 5, 5, 1 se resolução X e Y é de 0,2 uM e 1 uM cada amostra em Z. </li><li> Para anotar os núcleos, passar para o plano de interesse e clique em &quot;Visualizador 2D&quot;. Selecione &quot;Lineage&quot; no menu suspenso e escolha &quot;New linhagem&quot;. </li><li> Clicando e arrastando no núcleo, que pode ser marcado. Para nomear o núcleo, clique com botão direito e escolha &quot;Renomear partícula&quot; no menu suspenso. Para aumentar ou diminuir o diâmetro do círculo, arraste o ícone de seta que aparece no lado esquerdo do círculo marcado. Para marcar o plano central do núcleo, clique no ícone à direita. Quando se utiliza um marcador de membrana plasmática, uma grande esfera pode ser desenhada que vai cobrir a maior parte da célula. </li><li> Para continuar no tempo e no avião, escolher o &quot;Frame&quot; e &quot;Z&quot;opções na barra de ferramentas inferior. Depois de passar para o próximo ponto de tempo, ajustar a posição ou o tamanho do círculo que marca o núcleo em conformidade. Repita este procedimento até a célula se divide rastreados. </li><li> Quando há uma divisão celular, marque os núcleos filhos e mudar para &quot;viewer Lineage&quot;. Isso pode ser selecionado clicando no ícone &quot;Windows&quot; na barra de ferramentas superior. Marcar todos os três núcleos simultaneamente, ir até a opção &quot;Lineage&quot; na barra de ferramentas superior e selecione &quot;pai Associado&quot;. </li><li> Quando o rastreamento de pilha for concluído, mude para a marcação do remanescente divisão celular para rastreamento de canal. Para mudar de canal, clique no nome do arquivo no canto inferior esquerdo da barra de ferramentas. O remanescente da divisão celular (ou qualquer outra estrutura) pode ser controlada como acima descrito para o núcleo. </li><li> Ao retornar para o software depois de fechar, é necessário ir a &quot;2D Viewer&quot; - &quot;Lineage&quot; - &quot;Editar&quot; e clique sobre o número linhagem que será editada. </li&gt; </ol> 6. Analisando Cortical actomiosina fluxo com PIVlab NOTA: PIVlab é um software disponível gratuitamente a partir de: http://pivlab.blogspot.de/; ele pode ser chamado de dentro do ambiente de linha de comando Matlab digitando PIVlab_GUI. Ao trabalhar com PIVlab, recomenda-se para salvar a série de imagens em uma pasta separada. <ol><li> Inicie uma nova sessão do menu &quot;Arquivo&quot;. Coloque os arquivos de imagem clicando no botão &quot;Carregar imagens&quot;. </li><li> Selecione o estilo de seqüenciamento 1-2, 2-3, ... e navegue até o diretório que contém a sequência de imagens desejadas. Selecione as imagens e clique no botão &quot;Adicionar&quot; e importação. </li><li> Vá em &quot;configurações de Análises&quot; e selecione &quot;Exclusões (ROI), Máscara&quot;. Como alternativa, pressione &quot;Ctrl + E&quot;. Use o botão &quot;Empate máscara (s) para o quadro atual&quot; para inativar a parte indesejada da imagem / s (ou seja, fora da área do embrião). </li><li> Selecione &quot;Configurações PIV&quot; from o menu &quot;configurações Análises&quot;. Como alternativa, pressione &quot;Ctrl + S&quot;. Escolha &quot;FFT janela deformação&quot;, como o algoritmo PIV desejado. NOTA: transformação de Fourier rápida (FFT) reduz o custo computacional, mas é recomendado apenas o sinal é bem acima do ruído e se o deslocamento das partículas estudadas não excede metade da área de passagem analisado (ver 6.5). </li><li> Entre os seguintes valores para as três passagens, que são a área de interrogação para a correlação cruzada entre a intensidade de imagens subsequentes: Passe 1: Interrogação área de 64 pixels, com uma fase de passagem 32. 2: Interrogação área de 32 elementos de imagem com um passo de 16 . Selecione &quot;linear&quot; da deformação Janela menu suspenso. Escolha forma de 2 * 3 pontos Gaussian para sub-pixel estimativa deslocamento. </li><li> Selecione &quot;Analisar!&quot; a partir do menu Análise e use o botão &quot;Analisar todos os quadros&quot; para começar uma análise. </li><li> Para o processamento pós selecione &quot;Vector validação&quot; de &quot;; Menu de Pós-processamento &quot;e definir o limite de filtro de desvio padrão (Stdev) a 7 e se aplicam a todos os quadros. </li><li> Escolha &quot;derive parâmetros / modificar dados&quot; do menu &quot;Plot&quot;. Selecione &quot;Vectors [px / frame]&quot; do menu suspenso. Ajuste a suavidade de vetores e filtro passa alta e se aplicam a todos os quadros. </li><li> Para calcular vetores médios de todos os quadros, definir os quadros &quot;usado&quot; para 1: final e clique no botão &quot;Calcular vetores médios&quot;. </li></ol>

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<li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li>
<li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope%3A+variability+of+development+and+regional+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li>
</ol>

A pesquisa no laboratório da CP é financiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; PARA 1756) e o LOEWE Research Cluster Ubiquitin Networks. A PC é ainda apoiada pelo 7.º Programa-Quadro da União Europeia (Projeto de Ações Marie Curie 326632).

Através de rastreamento em desenvolvimento objecto, em particular de seguimento nuclear, tem sido possível para elucidar os mecanismos centrais de padronização de C. elegans embriogênese 1,23,24. Expandindo essa estratégia para um maior rendimento, tem sido recentemente possível descobrir regras de padronização adicionais e propor um método para deduzir como padronização regras de novo 10. Para muitos mutantes, no entanto, os defeitos de padrões precisos ainda são desconh...

Com as melhorias estáveis ​​de proteínas fluorescentes, engenharia de genoma, microscopia de luz, e soft e hardware de computador, agora é possível gravar desenvolvimento de muitos organismos modelo em sem precedentes resolução espácio-temporal. Isto permite aos investigadores fazer perguntas que não podem ser abordados anteriormente ou revisitar processos de desenvolvimento conhecidas, a fim de procurar os aspectos negligenciados. Este progresso tem suscitado o campo da biologia do desenvolvimento quantitativo, que visa transformar qualitativos, modelos informais em modelos quantitativos por meio de medições exaustivas e análises estatísticas. Células de rastreamento e estruturas subcelulares tornou possível derivar modelos quantitativos do desenvolvimento embrionário, atividade do sistema nervoso, ou a divisão celular 1-12. Ao rastrear restos de divisão celular durante o desenvolvimento precoce do C. elegans embrião, poderíamos recentemente revelam que eles seguem um aparelho de somdigitado caminho e constituem fatores de polarização importante 13,14. Aqui, os protocolos são apresentados que fazem biologia do desenvolvimento quantitativo aproxima acessível para os não-especialistas. O foco recai sobre três straight-forward, ferramentas livremente disponíveis, que são aplicáveis ​​em qualquer laboratório que tem acesso a microscopia confocal padrão e computadores. Estes incluem um protocolo para gerar formas celulares 3D, um protocolo para rastrear restos de divisão celular, e um protocolo para descrever quantitativamente dinâmica actomiosina corticais. O nemátodo C. elegans é usado como um caso exemplar, no entanto, os métodos e ferramentas discutidas aqui são adequadas para uma variedade de questões em outros modelos biológicos, por exemplo, as células cultivadas, explantes de tecido, Organóides ou esferóides, outros embriões, etc. Geralmente, algumas das análises mostrados aqui também pode ser realizada com a ferramenta aberta fonte populares ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; ou FIJI, os &quot;baterias incluídas&quot; versão do ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) para os quais muitos plugins para diferentes análises quantitativas estão disponíveis. No entanto, os programas aqui discutidos são projetados para resolver problemas específicos. Em primeiro lugar, IMOD, um processamento de imagem, modelagem e suite do display pode ser usado para as reconstruções 3D de cortes seriados de elétron ou microscopia de luz 15. IMOD também contém ferramentas para visualizar os dados 3D a partir de qualquer orientação. Em segundo lugar, Endrov, um programa Java projetado para executar análise de imagem, processamento de dados, e anotação de redes ou faixas (entre outros), com base em uma arquitetura de plugins extensa, com ImageJ compatibilidade de encaixe 16. Ele contém mais de 140 operações de processamento de imagem e uma interface de usuário extensível em que modelo e dados brutos são exibidos separadamente. Seu código fonte pode ser encontrada em https://github.com/mahogny/Endrov. Em terceiro lugar, PIVlab, um HAtlab ferramenta para partículas de imagem digital velocimetria que permite que o usuário quantitativa e qualitativamente analisar campos de fluxo de partícula 17. O uso deste programas requer uma licença MATLAB, que inclui a Imagem Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab é um programa desenhado para descrever quantitativamente o fluxo. Ele calcula a distribuição de velocidade, magnitude, vorticidade, divergência ou de cisalhamento dentro de pares de imagens ou séries. Para isso, cross-se correlaciona pequenas áreas de imagens (chamado de &quot;passes&quot; na seção de protocolo) de um par de imagens para derivar o deslocamento de partículas mais provável. Esta correlação cruzada produz uma matriz de correlação que pode ser analisada, no espaço de domínio de frequência ou utilizando qualquer correlação cruzada directa ou uma transformação rápida de Fourier (FFT), respectivamente. O equipamento utilizado é um microscópio invertido equipado com uma Nipkow (&#39;fiação&#39;) do disco, uma EMCCD, 488 e 561 nm padrão sólido-lasers de estado, e 20x ou 40x de ar ou 60x plano / Apochromat objectivos óleo ou água-de imersão. No entanto, é também possível realizar imagem de lapso de tempo com outras modalidades de imagiologia, por exemplo, ponto-, linha- ​​ou microscopia de varrimento de folha à base de laser, microscopia multi-fotão, bem como microscopia de epi-fluorescência combinado com desconvolução ou estruturada iluminação. A vantagem de utilizar um sistema de disco de Nipkow é a aquisição de imagem extremamente rápida, especialmente se um modo de fluxo contínuo (movimento contínuo e de varrimento do objecto na dimensão Z) está disponível. Além disso, para melhorar a resolução, um extensor de aumento de 1,5 vezes na parte dianteira do EMCCD pode ser usado.

<table><tbody><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td><td>Microscópio estéreo para dissecação e montagem</td></tr><tr><td>de microesferas de poliestireno Polybead,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>Montagem de embriões</td></tr><tr><td>20 &micro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de Poliestireno Polibead,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>Montagem de animais adultos</td></tr><tr><td>0.1 &micro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>Montagem de animais adultos</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura 18x18 mm</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>Montagem embrião/adulto</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1339</td><td>Bisturi de montagem de embriões</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>Dissecção de embriões</td></tr><tr><td>Tubo de silicone</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>Tubo para pipeta bucal</td></tr><tr><td>30 mm Filtro de membrana PTFE</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>Filtro para pipeta bucal</td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>Ponta de pipeta para pipeta bucal</td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Roth</td><td>E746.1</td><td>Montagem embrião/adulto</td></tr><tr><td></td><td>Ágar Roth</td><td>5210.5</td><td>Montagem de animais adultos</td></tr><tr><td>Potássio-di-hidrogenofosfato</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td>Tampão M9</td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de sódio</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td>Tampão M9</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>Tampão M9</td></tr><tr><td>Sistema confocal de disco giratório VisiScope</td><td>Sistemas de visita</td><td>n/a</td><td>Microscopia confocal</td></tr></tbody></table>

rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; c. elegans</em&gt; como usar as ferramentas de código aberto

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitativamente capturar processos de desenvolvimento é crucial para derivar modelos mecanicistas e chave para identificar e descrever os fenótipos mutantes. Aqui são apresentados os protocolos para a preparação de embriões e adultos C. elegans animais para microscopia de lapso de tempo curto e longo prazo e métodos de rastreamento e quantificação dos processos de desenvolvimento. Os métodos apresentados são todos baseados em C. cepas elegans disponíveis a partir do Centro de Genética Caenorhabditis e no software de código aberto que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório independentemente do sistema de microscopia usado. A reconstrução de um modelo de célula-forma 3D usando o IMOD software de modelagem, o rastreamento manual de estruturas subcelulares fluorescente-etiquetados usando o multi-purpose programa de análise de imagem Endrov, e uma análise de fluxo contrátil cortical usando PIVlab (resolvida no tempo Velocimetry Digital Imagem de Partículas Ferramenta para MATLAB) são mostrados. Discute-se como esses métodos também podem ser implantados to quantitativamente capturar outros processos de desenvolvimento em diferentes modelos, por exemplo, rastreamento de linhagem celular e rastreamento, monitoramento do fluxo de vesícula.

Usando protocolos 2, 3, e 4, com intervalo de tempo de imagem das gônadas em selvagem tipo C. elegans adultos é realizada (OD58 estirpe (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [PAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), expressando um marcador de membrana a partir de um promotor da linha germinal ). Centrando-se no turno da gônada, um modelo 3D das células germinativas é gerada a partir dos dados de microscopia (Figura 2). Este modelo permite analisar alterações no tamanho da célula, enquanto o ...

Aqui é mostrado como rastrear e quantificar os processos de desenvolvimento em C. elegans. Os métodos apresentados são baseados em ferramentas de código aberto que podem ser facilmente implementadas. É demonstrado como reconstruir modelos 3D de forma celular, como rastrear manualmente estruturas subcelulares e como analisar o fluxo contrátil cortical.

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

O objetivo geral do uso de software de análise de imagens e da biologia do desenvolvimento é obter dados quantitativos para modelos mecanicistas de processos biológicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como, por exemplo, como os fenótipos de mutantes podem ser analisados de forma quantitativa? A principal vantagem desta metodologia é que ela fornece aos pesquisadores a capacidade de identificar alterações em processos biológicos e fenômenos de desenvolvimento de maneira imparcial.Embora este método possa ser usado para obter informações sobre o desenvolvimento e a morfogênese de *sea elegance*, ele também pode ser aplicado a outros organismos modelo, como *josepha*. A reconstrução da forma celular com IOD será demonstrada por CINA Leman, estudante de doutorado no meu laboratório. Após instalar o programa IM MOD, abra o shell eunuch e digite Im mod na janela do IM mod. Selecione o arquivo com os dados brutos apropriados para gerar um modelo 3D e use a janela de informações para localizar a parte inferior e superior dos objetos na janela zap.No painel de informações, novamente, siga os contornos das células criando o primeiro contorno no plano superior de cada célula e tomando cuidado para criar um novo objeto para cada célula. Em seguida, role para baixo no eixo Z e crie um novo contorno para cada plano Z, criando posteriormente um novo objeto para cada célula. Após delinear tantas células quanto apropriado para o modelo, abra a janela de visualização do modelo para inspecionar os objetos e seus contornos.Em seguida, na barra de ferramentas da visualização do modelo, escolha editar e objetos. A janela de edição respectiva será aberta para modelar todas as células como objetos preenchidos e fechados. Escolha malha como o tipo de dado de desenho e preenchimento como o estilo de desenho.Clique em "meshing" e marque a opção "cap". Em seguida, marque quantos objetos forem necessários e clique em "mesh". O programa gerará objetos sólidos a partir das pilhas de contornos.Altere a escala Z na janela de visualização para ajustar o fator de amostragem Z conforme necessário. Em seguida, no menu editar, selecione a visualização para rotacionar os objetos tridimensionais, salvando imagens ou vídeos das células conforme apropriado para rastrear objetos a partir de gravações fluorescentes com lapso de tempo. Usando primeiro o NDR, converta os dados brutos em um arquivo TIFF.Em seguida, abra o arquivo. No final da gota, selecione o ícone do visualizador 2D e clique no ícone de ajuste de intervalo para ajustar o histograma no menu de dados.Selecione o arquivo, nome, imagem, conjunto, canal, e defina a resolução X, Y, Z e insira os valores de X, Y e Z. Para anotar os núcleos, vá até o plano de interesse e selecione novamente o visualizador 2D. Em seguida, selecione linhagem no menu suspenso e escolha nova linhagem.Clique e arraste sobre o núcleo de interesse para marcá-lo. Em seguida, clique com o botão direito sobre o núcleo e escolha renomear partícula. No menu suspenso, insira um nome para a partícula e depois arraste o ícone de seta para alterar o diâmetro do círculo.Em seguida, clique no ícone direito para marcar o plano central do núcleo. Depois, para avançar no tempo e no plano, escolha as opções de quadro e Z na barra de ferramentas inferior e ajuste a posição ou o tamanho do círculo que marca o núcleo conforme necessário, até que a célula rastreada se divida. Quando uma divisão celular for observada, marque os núcleos filhos e clique no ícone de janelas para alternar para a linhagem.O visualizador deve marcar simultaneamente os três núcleos e selecionar "associar pai" na opção de linhagem. Em seguida, quando todas as células tiverem sido rastreadas, clique no nome do arquivo e mude para o canal. Marque o remanescente da divisão celular para analisar quantitativamente o fluxo cortical utilizando o software de simetria de velocidade de imagem de partículas.Carregue os novos arquivos de imagem no pif lab e selecione o estilo de sequenciamento. 1, 2, 2, 3. Em seguida, navegue até o diretório que contém a sequência de imagens desejadas.Selecione as imagens e clique em adicionar para importar as imagens. Em seguida, nas configurações de análise, selecione exclusões. Máscara de ROI e use o botão.Desenhe máscaras para o quadro atual para inativar a parte indesejada das imagens nas configurações de análise. Novamente, selecione as configurações de PIF e escolha a deformação da janela de transformada rápida de Fourier como o algoritmo de PIF desejado. Para a primeira passagem, insira um valor de área de interrogatório de 64 pixels com um passo de 32 na segunda passagem.Insira um valor de área de interrogação de 32 pixels com um passo de 16. Em seguida, selecione linear no menu suspenso de deformação da janela e escolha o método gaussiano dois por três pontos para a estimativa de deslocamento subpixel. Agora, selecione analisar no menu de análise e selecione analisar todos os quadros no pós-processamento, selecione validação de vetores no menu de pós-processamento e aplique um limiar de filtro de desvio padrão de sete a todos os quadros no menu de gráficos.Selecione parâmetros derivados. Modifique os dados seguidos por vetores, pixels por quadro e ajuste a suavização dos vetores e o filtro passa-alta. Após aplicar esses ajustes a todos os quadros, defina os quadros utilizados como um para finalizar.Por fim, clique no botão calcular vetores médios para medir os vetores médios de todos os quadros, concentrando-se na rotação da gônada de adultos do tipo selvagem de C. elegans, conforme demonstrado. Um modelo 3D das células germinativas é gerado a partir dos dados de microscopia, permitindo a análise das alterações no tamanho celular que ocorrem enquanto as células transitem do braço distal para o braço proximal do cus, utilizando microscopia de lapso de tempo com dois cores. Os modelos obtidos por fusão de proteínas de histona em linha e miosina não muscular em NDR ilustram o padrão estereotipado de herança dos remanescentes da divisão celular.Além disso, a partir dos dados das linhas, é possível obter neste experimento as trajetórias de cada célula L e dos remanescentes da divisão celular, bem como a correlação com o momento da divisão celular. Foi realizada microscopia de lapso de tempo de curta duração com alta resolução temporal da miosina não muscular cortical dois para avaliar as diferenças na dinâmica do fluxo polarizado cortical entre embriões do tipo selvagem e embriões privados da proteína ativadora de GTPase RGA três, conforme esperado. O fluxo nos embriões do tipo selvagem foi predominantemente ao longo do eixo longo do embrião.Embora o fluxo no embrião de interferência por RNA RGA três fosse ortogonal a este eixo, conforme facilmente observável pela análise de PIP. Uma vez dominada, a segmentação manual de objetos complexos e o rastreamento celular durante o desenvolvimento embrionário podem ser realizados em algumas horas, desde que adequadamente executados, ao tentar realizar o rastreamento de células e objetos. É importante lembrar de configurar uma resolução temporal apropriada para não perder o objeto durante a análise utilizando as três ferramentas descritas aqui.A análise estatística também pode ser realizada para responder perguntas sobre variabilidade ou simplesmente para comparar diferentes embriões. A implementação de softwares de análise de imagem quantitativa nos permite, e a outros biólogos do desenvolvimento como nós, explorar os mecanismos morfogenéticos do desenvolvimento em um nível de detalhe sem precedentes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar um conjunto diversificado de ferramentas de software para realizar análise de imagem quantitativa.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Temos desenvolvido um vídeo taxa de sistema de microscópio de rastreamento que pode gravar e...

C. elegans Acompanhamento e Medição do Comportamento

Este vídeo descreve o uso de software de vídeo e rastreamento para registrar o movimento do verme em uma arena. O protocolo de exemplo mede o efeito da exposição ao etanol na locomoção do verme.

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Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

A propagação de agregados proteicos semelhante ao príon surgiu recentemente como implicada em muitas doenças neurodegenerativas. O objetivo deste protocolo é descrever como usar o nematóide C. elegans como um sistema modelo para monitorar a disseminação de proteínas e investigar fenômenos semelhantes a príons.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Aqui, apresentamos um quadro para relacionar a restrição dietética de vasta gama de expectativa de vida e expressão gênica. Descrevemos os protocolos para a vasta gama de restrição dietética e para a imagem latente quantitativa da expressão do gene sob esse paradigma. Nós esboçamos mais análises computacionais para revelar subjacentes recursos de processamento de informações dos circuitos genéticos envolveram na detecção comida.

Quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em C. elegans.

Descrevemos os protocolos para a utilização da plataforma de controle de nematoides amplo campo de visão (WF-NTP), que permite alta produtividade Caracterização fenotípica de grandes populações de Caenorhabditis elegans. Estes protocolos podem ser usados para caracterizar mudanças comportamentais sutis em cepas mutantes ou em resposta ao tratamento farmacológico de forma altamente escalável.

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

Aqui, nós apresentamos uma aproximação combinatória usando a microscopia de alta resolução, as ferramentas computacionais, e a rotulagem da único-pilha em embriões vivos de C. elegans para compreender a única dinâmica da pilha durante o neurodevelopment.

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e montar embriões de Caenorhabditis elegans , registrando o desenvolvimento sob um microscópio 4D e traçando a linhagem celular.

Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

Este estudo apresenta protocolos para duas abordagens semi-automatizadas de análise de atividade locomotor em C. elegans complexo I disease gas-1(fc21) worms, ou seja, ZebraLab (um ensaio de rendimento médio) e WormScan (um ensaio de alto rendimento) e fornecem análise comparativa entre uma ampla gama de métodos de pesquisa para quantificar o comportamento nematoides e função neuromuscular integrada.

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Aprenda a rastrear e quantificar processos de desenvolvimento em C. elegans usando ferramentas de código aberto como o IMOD. Este método permite reconstruir modelos 3D de células e analisar fenótipos mutantes de forma quantitativa.

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