Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em

O objetivo geral do uso de software de análise de imagens e da biologia do desenvolvimento é obter dados quantitativos para modelos mecanicistas de processos biológicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como, por exemplo, como os fenótipos de mutantes podem ser analisados de forma quantitativa? A principal vantagem desta metodologia é que ela fornece aos pesquisadores a capacidade de identificar alterações em processos biológicos e fenômenos de desenvolvimento de maneira imparcial.

Embora este método possa ser usado para obter informações sobre o desenvolvimento e a morfogênese de *sea elegance*, ele também pode ser aplicado a outros organismos modelo, como *josepha*. A reconstrução da forma celular com IOD será demonstrada por CINA Leman, estudante de doutorado no meu laboratório. Após instalar o programa IM MOD, abra o shell eunuch e digite Im mod na janela do IM mod. Selecione o arquivo com os dados brutos apropriados para gerar um modelo 3D e use a janela de informações para localizar a parte inferior e superior dos objetos na janela zap.

No painel de informações, novamente, siga os contornos das células criando o primeiro contorno no plano superior de cada célula e tomando cuidado para criar um novo objeto para cada célula. Em seguida, role para baixo no eixo Z e crie um novo contorno para cada plano Z, criando posteriormente um novo objeto para cada célula. Após delinear tantas células quanto apropriado para o modelo, abra a janela de visualização do modelo para inspecionar os objetos e seus contornos.

Em seguida, na barra de ferramentas da visualização do modelo, escolha editar e objetos. A janela de edição respectiva será aberta para modelar todas as células como objetos preenchidos e fechados. Escolha malha como o tipo de dado de desenho e preenchimento como o estilo de desenho.

Clique em "meshing" e marque a opção "cap". Em seguida, marque quantos objetos forem necessários e clique em "mesh". O programa gerará objetos sólidos a partir das pilhas de contornos.

Altere a escala Z na janela de visualização para ajustar o fator de amostragem Z conforme necessário. Em seguida, no menu editar, selecione a visualização para rotacionar os objetos tridimensionais, salvando imagens ou vídeos das células conforme apropriado para rastrear objetos a partir de gravações fluorescentes com lapso de tempo. Usando primeiro o NDR, converta os dados brutos em um arquivo TIFF.

Em seguida, abra o arquivo. No final da gota, selecione o ícone do visualizador 2D e clique no ícone de ajuste de intervalo para ajustar o histograma no menu de dados.

Selecione o arquivo, nome, imagem, conjunto, canal, e defina a resolução X, Y, Z e insira os valores de X, Y e Z. Para anotar os núcleos, vá até o plano de interesse e selecione novamente o visualizador 2D. Em seguida, selecione linhagem no menu suspenso e escolha nova linhagem.

Clique e arraste sobre o núcleo de interesse para marcá-lo. Em seguida, clique com o botão direito sobre o núcleo e escolha renomear partícula. No menu suspenso, insira um nome para a partícula e depois arraste o ícone de seta para alterar o diâmetro do círculo.

Em seguida, clique no ícone direito para marcar o plano central do núcleo. Depois, para avançar no tempo e no plano, escolha as opções de quadro e Z na barra de ferramentas inferior e ajuste a posição ou o tamanho do círculo que marca o núcleo conforme necessário, até que a célula rastreada se divida. Quando uma divisão celular for observada, marque os núcleos filhos e clique no ícone de janelas para alternar para a linhagem.

O visualizador deve marcar simultaneamente os três núcleos e selecionar "associar pai" na opção de linhagem. Em seguida, quando todas as células tiverem sido rastreadas, clique no nome do arquivo e mude para o canal. Marque o remanescente da divisão celular para analisar quantitativamente o fluxo cortical utilizando o software de simetria de velocidade de imagem de partículas.

Carregue os novos arquivos de imagem no pif lab e selecione o estilo de sequenciamento. 1, 2, 2, 3. Em seguida, navegue até o diretório que contém a sequência de imagens desejadas.

Selecione as imagens e clique em adicionar para importar as imagens. Em seguida, nas configurações de análise, selecione exclusões. Máscara de ROI e use o botão.

Desenhe máscaras para o quadro atual para inativar a parte indesejada das imagens nas configurações de análise. Novamente, selecione as configurações de PIF e escolha a deformação da janela de transformada rápida de Fourier como o algoritmo de PIF desejado. Para a primeira passagem, insira um valor de área de interrogatório de 64 pixels com um passo de 32 na segunda passagem.

Insira um valor de área de interrogação de 32 pixels com um passo de 16. Em seguida, selecione linear no menu suspenso de deformação da janela e escolha o método gaussiano dois por três pontos para a estimativa de deslocamento subpixel. Agora, selecione analisar no menu de análise e selecione analisar todos os quadros no pós-processamento, selecione validação de vetores no menu de pós-processamento e aplique um limiar de filtro de desvio padrão de sete a todos os quadros no menu de gráficos.

Selecione parâmetros derivados. Modifique os dados seguidos por vetores, pixels por quadro e ajuste a suavização dos vetores e o filtro passa-alta. Após aplicar esses ajustes a todos os quadros, defina os quadros utilizados como um para finalizar.

Por fim, clique no botão calcular vetores médios para medir os vetores médios de todos os quadros, concentrando-se na rotação da gônada de adultos do tipo selvagem de C. elegans, conforme demonstrado. Um modelo 3D das células germinativas é gerado a partir dos dados de microscopia, permitindo a análise das alterações no tamanho celular que ocorrem enquanto as células transitem do braço distal para o braço proximal do cus, utilizando microscopia de lapso de tempo com dois cores. Os modelos obtidos por fusão de proteínas de histona em linha e miosina não muscular em NDR ilustram o padrão estereotipado de herança dos remanescentes da divisão celular.

Além disso, a partir dos dados das linhas, é possível obter neste experimento as trajetórias de cada célula L e dos remanescentes da divisão celular, bem como a correlação com o momento da divisão celular. Foi realizada microscopia de lapso de tempo de curta duração com alta resolução temporal da miosina não muscular cortical dois para avaliar as diferenças na dinâmica do fluxo polarizado cortical entre embriões do tipo selvagem e embriões privados da proteína ativadora de GTPase RGA três, conforme esperado. O fluxo nos embriões do tipo selvagem foi predominantemente ao longo do eixo longo do embrião.

Embora o fluxo no embrião de interferência por RNA RGA três fosse ortogonal a este eixo, conforme facilmente observável pela análise de PIP. Uma vez dominada, a segmentação manual de objetos complexos e o rastreamento celular durante o desenvolvimento embrionário podem ser realizados em algumas horas, desde que adequadamente executados, ao tentar realizar o rastreamento de células e objetos. É importante lembrar de configurar uma resolução temporal apropriada para não perder o objeto durante a análise utilizando as três ferramentas descritas aqui.

A análise estatística também pode ser realizada para responder perguntas sobre variabilidade ou simplesmente para comparar diferentes embriões. A implementação de softwares de análise de imagem quantitativa nos permite, e a outros biólogos do desenvolvimento como nós, explorar os mecanismos morfogenéticos do desenvolvimento em um nível de detalhe sem precedentes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar um conjunto diversificado de ferramentas de software para realizar análise de imagem quantitativa.