Formação de Epithelium próstata humano utilizando Tissue Recombinação de Rodent Urogenital Mesênquima Sinus e células-tronco humanas

O objetivo geral deste procedimento é isolar o mesênquima urogenital, sinusal ou UGSM de roedores de embriões de roedores e implantar misturas de tecidos na cápsula renal que podem formar o epitélio da próstata humana. Isso é feito isolando primeiro o seio urogenital de embriões de camundongos ou ratos. Em seguida, o mesênquima do seio urogenital é separado do epitélio.

Em seguida, suspensões unicelulares de mesênquima do seio urogenital são combinadas com células-tronco pluripotentes. Finalmente, a mistura de células é implantada sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o epitélio da próstata humana formado no rim de camundongo por meio da validação da expressão de PSA específico humano.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a função da próstata e o início da doença, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como xenoenxerto de tumores de próstata humanos e indução de linhagens celulares tumorogênicas semanais para formar tumores. Depois de sacrificar um camundongo ou rato prenhe, cronometrado, e isolar os embriões, separe-os do saco amniótico, corte o cordão umbilical e transfira-os para um tubo de 50 mililitros contendo mechas geladas. Equilibre a solução salina e mantenha no gelo.

Coloque um embrião em uma placa de Petri de 100 milímetros e use uma tesoura para dividi-lo ao nível do bolo alimentar. Remova o estômago e o intestino delgado e, em seguida, localize os ovários no embrião feminino, que são encontrados nos postes de mimo dos rins ou no testículo no homem localizado ao nível da bexiga. Sob um escopo de dissecação.

Use uma tesoura de Veneza para cortar a parede abdominal para expor a bexiga e a parede posterior do abdômen. Liberte o trato genital superior dos anexos e libere o cordão umbilical. Corte o osso púbico e com pinça de ponta fina dumont.

Sem rodeios, separe-o da parede anterior do seio urogenital. Separe a parede posterior do seio urogenital do reto e corte o seio urogenital com a bexiga na extremidade inferior. Em seguida, separe a bexiga do seio urogenital.

Armazene o seio urogenital e bloqueie em HBSS gelado. Transfira o seio urogenital para um tubo de 50 mililitros contendo 1% de tripsina em HBSS sem cálcio e magnésio e incube a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, remova a tripsina e adicione 10% de FBS e DM a meio MF 12 para neutralizar a digestão.

Em seguida, use uma agulha ou pinça de ponta fina Para provocar cuidadosamente a manga mesenquimal pegajosa do tubo epitelial. Manter o tubo epitelial intacto reduz as chances de contaminação das células epiteliais do mesênquima. Isso pode resultar na formação de glândulas de roedores junto com o epitélio glandular humano derivado de células-tronco.

Transfira o UGSM para um novo tubo de 50 mililitros contendo meio DMM F 12 contendo 10% de FBS, 1% de estreptococos de caneta, 1% de aminoácidos não essenciais e um nanomolar. R 1 8 81 Incubar o tubo a 37 graus Celsius com 5%CO2 durante a noite. No dia seguinte, centrifugue o tecido a 200 G. Descarte o sobrenadante e use PBS para lavar o pellet.

Após a remoção do PBS, ressuspenda o tecido em 0,2% de colagenase em DMAF 12 e incube a 37 graus Celsius com balanço suave por uma hora, vórtice vigorosamente o tecido digestivo três vezes até que se torne uma mistura homogênea de célula única e neutralize a colagenase adicionando meio DMAM 12 com 10% de FBS 1% de estreptococo de caneta, 1% de aminoácidos não essenciais e um nanomolar R 1 8 81. Lave as células três vezes peletizando-as a 200 G e suspendendo-as em HBSS. Por fim, suspenda as células mesenquimais no DMM F 12 e use um hemocitômetro para contá-las para realizar o transplante.

Depois de preparar uma área cirúrgica estéril e anestesiar um camundongo nu atímico macho com uma injeção IP de cetamina xilazina, de acordo com o protocolo de texto, execute uma pinça no dedo do pé para confirmar o nível de sedação cirurgicamente prepare o mouse raspando o local da cirurgia, se necessário, e limpando-o com três lenços alternados de álcool a 70% seguidos de solução de Betadine. Depois de aplicar a pomada para os olhos, faça uma incisão longitudinal de um centímetro nas costas e continue a cortar a parede abdominal com uma incisão longitudinal de 0,5 centímetro. Esprema suavemente o rim para fora do abdômen e use gotas de solução salina estéril para mantê-lo úmido.

Em seguida, usando uma agulha de seringa de calibre 27, perfure suavemente a cápsula renal para criar um local de injeção para a mistura celular. Em seguida, encha uma agulha de seringa de calibre 28 com 10 microlitros de mistura de células e insira-a lentamente no local da punção, penetrando no parênquima renal. Para alcançar uma área abaixo da cápsula renal.

Injete 10 microlitros da mistura celular para formar um bolo no rim sob a cápsula renal e retire a agulha. Retorne o rim à cavidade abdominal e prenda a camada muscular do peritônio com quatro suturas de náilon. Feche a pele com suturas ou grampos e use solução salina estéril para limpar o sangue da pele.

Aqui é mostrada uma imagem de ultrassom de um xenoenxerto em crescimento oito semanas após o implante. A área circulada representa o xenoenxerto na superfície do rim. Essas imagens demonstram o crescimento do xenoenxerto na superfície renal.

Após 12 semanas, as células ES humanas implantadas na ausência de seio urogenital, o mesênquima formará um grande teratoma, enquanto o mesênquima do seio urogenital implantado sozinho não conseguirá formar qualquer estrutura discernível. Mostrado no centro. Os painéis desta figura são colorações imuno-histoquímicas representativas do epitélio da próstata humano derivado de células-tronco versus tecido da próstata humana adulta.

Como mostrado aqui à esquerda, as glândulas contêm uma camada epitelial luminal positiva para AR. Isso também é PSA positivo, uma camada de células epiteliais basais P 63 positiva e cromogranina rara. Células neuroendócrinas, as glândulas não são câncer, como mostrado pela coloração A-M-A-C-R negativa na castração do hospedeiro.

As células luminais positivas para PSA AR não estão mais presentes, demonstrando dependência androgênica característica. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter muito cuidado ao separar o mesênquima do seio urogenital do epitélio. Como contaminante, o epitélio do seio urogenital formará glândulas e potencialmente confundirá seus resultados.