Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de Mycobacterium abscessus Em embriões Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é estudar e comparar a virulência de cepas de Mycobacterium abscessus e descrever as interações entre essas bactérias e o sistema imunológico inato do hospedeiro in vivo usando embriões de peixe-zebra de transparência. Isso é feito preparando primeiro o inocular bacteriano homogêneo. Em seguida, os embriões são injetados por via intravenosa com as suspensões bacterianas 30 horas após a fertilização.

Além disso, para estudar com mais precisão o papel dos macrófagos no controle da infecção, um procedimento de injeção baseado em lipo choate é usado para gerar embriões empobrecidos de macrófagos. Finalmente, os embriões infectados são preparados e fotografados usando fluorescência e microscopia confocal para monitorar a progressão da infecção. Em última análise, os resultados que podem ser obtidos mostram as interações específicas entre as células fagocíticas fluorescentes e o M abscessus, seja como basi individual ou como cordões serpentinos dentro de um embrião transparente.

A principal vantagem de usar o peixe-zebra em relação a outros modelos animais, como camundongos, é que ele permite investigar especificamente o processo de infecção em tempo real e estudar uma imagem das interações específicas entre abscessos de microbactérias e micrófagos ou neutrófilos. Esta etapa é uma questão crítica para a pressão de injeção subsequente no peixe-zebra. Devido à alta propensão do Mycobacterium abscessus rugoso para formar grandes agregados e produzir códigos, é necessário um tratamento específico para preparar inocular homogêneo e quantitativamente controlado antes da microinjeção.

Para preparar m abscessus, colha culturas de crescimento exponencial de frascos de cultura de tecidos de 150 centímetros quadrados em tubos de plástico estéril de 50 mililitros e centrifugue a 4.000 vezes G e temperatura ambiente por 15 minutos. Use um mililitro de Middlebrook sete H nove, complementado com o enriquecimento OADC, mais tween 80 doravante referido como sete H nove meio para ressuspender o pellet e Eloqua. 200 microlitros das suspensões bacterianas em tubos de 1,5 mililitro com uma agulha de calibre 26 homogeneizam cada quadrilátero ALI de suspensão bacteriana 15 vezes.

Em seguida, usando um sonicado em banho-maria, sonice três vezes por 10 segundos cada, com intervalos de dez segundos. No meio, adicione um mililitro de sete H nove, médio e brevemente vórtice, em seguida, centrifugue a 100 vezes G por três minutos. Recolha cuidadosamente as micobactérias contendo sobrenadantes para evitar aglomerados e puxe as suspensões homogéneas num tubo de plástico estéril de 50 mililitros.

Centrifugue a suspensão a 4.000 vezes G por cinco minutos e use 200 microlitros de sete H nove meio para ressuspender o inóculo bacteriano final da pastilha. De acordo com o protocolo de texto, A demonstração visual deste método, é fundamental, pois as etapas são difíceis de aprender porque a manipulação suave e precisa da injeção em embriões de peixe-zebra sob o microscópio, bem como a aquisição da técnica de microinjeção, exigiu tempo para realizar a microinjeção de M abscessus em cerca de 24 horas. Após a fertilização ou HPF, use uma pinça para revestir os embriões em uma placa de Petri de 100 milímetros e mantê-los a 28,5 graus Celsius.

Transfira 30 48 embriões HPF para uma câmara de posicionamento em forma de V preenchida com 25 mililitros de água de peixe contendo 270 miligramas por litro de trica com uma ponta de micro carregador cortada. Coloque os embriões corretamente nos canais para facilitar a manipulação. Use PBST com 0,05% entre 80 para diluir o inóculo microbacteriano para a UFC desejada a ser entregue e inclua 10% de vermelho de fenol para verificar a injeção adequada com uma ponta de micro carregador.

Carregue uma agulha de microinjeção com cinco a 10 microlitros do inóculo bacteriano. Conecte a agulha de microinjeção no suporte de um micromanipulador conectado ao injetor e use uma pinça fina para quebrar a parte superior da agulha. Para obter um diâmetro de abertura de cinco a 10 micrômetros.

Calibre o volume de injeção ajustando a pressão e o tempo de microinjeção. Em seguida, para obter o volume de injeção necessário, meça o diâmetro de uma gota expelida na gema de um embrião para microinjetar na veia do mimo. Posicione o embrião com o lado ventral voltado para a agulha e coloque a ponta da agulha perto da abertura urogenital.

E empurre suavemente a ponta da agulha para dentro do embrião até que ela perfure a região da veia do mimo. Em seguida, forneça o volume desejado de suspensão bacteriana, geralmente de um a três nanolitros contendo cerca de 100 UFC por nanolitro. Incubar e monitorar os embriões de acordo com o protocolo de texto para realizar lipo Choate, depleção de macrófagos e embriões a 24 HP. Destino, os embriões, e transferi-los para um prato de injeção cheio de água de peixe com trica.

Em seguida, oriente-os para o lado dorsal para baixo. Após o vórtice da solução de clodronato encapsulada em lipossomas, carregue a agulha microcapilar e calibre o volume de injeção. Perfure a região da veia do coddle conforme demonstrado anteriormente e injete dois a três litros de solução.

Repita a injeção três vezes. Incube os embriões a 28,5 graus Celsius e use microscopia de fluorescência para controlar o esgotamento adequado dos macrófagos antes de infectar. Conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, para enumerar unidades formadoras de colônias ou UFCs no ponto de tempo desejado.

Colete cinco embriões por condição de infecção e transfira cada embrião para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. A crioanestesia dos embriões por incubação em gelo por 10 minutos após a eutanásia dos embriões com 300 a 500 miligramas por litro. Trica. Use água estéril para lavar os embriões duas vezes em um novo tubo.

Em seguida, depois de remover a água a 2% Triton X 100 em um XPBS para cada embrião, use uma agulha de calibre 26 para homogeneizar o tecido para lise completa. Depois de centrifugar a suspensão, use um X-P-B-S-T para ressuspender o pellet. Em seguida, a placa de diluição serial do homogêneo em Middlebrook sete H 10 OADC.

Suplementado com B-B-L-M-G-I-T Panta incubar as placas a 30 graus Celsius por quatro dias antes de contar as colônias para imagens ao vivo da infecção por M abscessus, monte embriões anestesiados trica em 1% de baixo ponto de fusão aros em uma placa de Petri com fundo de vidro de 35 milímetros para um microscópio invertido ou uma única lâmina de depressão de cavidade para microscopia confocal vertical. Oriente o embrião para a posição desejada e cubra o aros solidificado com água de peixe contendo trica para imagens fixas da infecção por M abscessus. Após a eutanásia dos embriões, transfira-os para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e fixe os embriões em aldeído paraforme a 4% em um X-P-B-S-T por duas horas.

À temperatura ambiente, remover o aldeído paraforme lavando os embriões duas vezes com um X-P-B-S-T durante 10 minutos para preservar a integridade dos tecidos e a fluorescência sucessivamente. Incube os embriões em concentrações crescentes de solução de glicerol por 10 minutos por condição. Coloque o embrião embebido em glicerol a 50% em uma câmara de visualização.

Finalmente, use um microscópio de fluorescência com objetiva de 10 x ou um microscópio confocal de fluorescência com objetivas de 40 x ou 63 x para aquisição de fluorescência sequencial e imagens de transmissão do embrião. Para investigar e comparar a virulência de variantes rugosas e lisas de M abscessus, bactérias fluorescentes foram injetadas por via intravenosa em 30 embriões proficientes em HPFC. Em contraste com a variante lisa, a áspera induz uma infecção mais robusta e letal com o desenvolvimento de abscessos no sistema nervoso central.

As diferenças na virulência foram quantificadas enumerando a UFC ou determinando as contagens de pixels fluorescentes que estão correlacionadas. Isso aponta para cargas bacterianas mais altas para a variante áspera Como visto nesta figura, a cinética de formação do cordão pode ser monitorada e visualizada por microscopia de vídeo de maneira não invasiva, demonstrando a propensão da variante áspera a se replicar extracelularmente, conforme mostrado aqui. A infecção de embriões empobrecidos de macrófagos com o abscesso M áspero leva a um aumento maciço nas cargas bacterianas e na produção de cordão umbilical e à rápida morte larval.

Isso indica claramente que os macrófagos são necessários para controlar a infecção por M abscessus para observar em tempo real as interações entre os macrófagos e o M abscessus. A linha transgênica de cereja EG one M que produz macrófagos fluorescentes vermelhos pode ser usada. As infecções induzem um recrutamento acentuado de macrófagos com fagocitose eficiente de bactérias individuais, enquanto os cordões micobacterianos representam uma estratégia desenvolvida por abscessos para evitar serem fagocitados após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para explorar o importante papel da codificação como um novo mecanismo de evasão imunológica. Graças à toupeira de infecção do peixe-zebra, torna-se agora possível observar e descrever a contribuição in vivo dos códigos na patogênese dos abscessos de micobactérias.