Name: Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de Mycobacterium abscessus Em embriões Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a estudar a patogênese de Mycobacterium abscessus em embriões de zebrafish transparentes usando microscopia de fluorescência. Este método permite visualizar em tempo real as interações entre bactérias e o sistema imune inato.

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Os autores agradecem a K. Kissa para discussões úteis e para a prestação de lipo-clodronate e L. Ramakrishnan pelo dom generoso de pTEC27 e pTEC15 que permitir a expressão de tdTomato e Wasabi, respectivamente. Este trabalho faz parte dos projetos da Agência Nacional de Investigação francesa (ZebraFlam ANR-10 MIDI-009 e DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) e Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7-PEOPLE-2011-ITN) sob acordo de subvenção não. PITN-GA-2011-289209 para a Marie-Curie de Formação Inicial Rede FishForPharma. Gostaríamos também de agradecer à Associação Gregory Lemarchal e Vaincre La mucoviscidose (RF20130500835) para o financiamento CM Dupont.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O peixe-zebra emergiu recentemente como um excelente sistema modelo para o estudo dos vertebrados dinâmica da infecção bacteriana usando um campo largo e de imagem confocal em tempo real 36. A combinação de suspensões de micobactérias dispersas (protocolo 2.2), juntamente com métodos micro-injecção (protocolo 4) permite infecções sistêmicas, reprodutíveis e posterior acompanhamento e visualização da progressão da infecção com um foco especial sobre as interações bacterianas com macrófagos de acolhimento. Viru...

Mycobacterium abscessus é um agente patogénico emergente que faz com que um largo espectro de síndromes clínicos em seres humanos. Estes incluem infecções cutâneas, bem como infecções pulmonares crônicas graves, principalmente encontrados em imunocomprometidos e em pacientes com fibrose cística 1,2,3,4. M. abscessus também é considerado como um dos principais rápido crescimento espécies de micobactérias responsáveis ​​por infecções hospitalares e iatrogênica em seres humanos. Além disso, vários relatórios recentes em destaque a possibilidade de que M. abscessus pode atravessar a barreira sangue-cérebro e induzir lesões importantes no sistema nervoso central (SNC) 5,6. Apesar de ser um cultivador rápido, M. exposições abscessus também várias características patogênicas que estão relacionados com os do Mycobacterium tuberculosis, incluindo a capacidade de permanecer em silêncio durante anos dentro de estruturas granulomatosas e gerar lesões caseosas nos pulmões 7. Mais alarmante é a baixa sensensibili- de M. abscessus aos antibióticos, tornando estas infecções extremamente difícil de tratar levando a uma taxa de insucesso terapêutico significativo 8,9. A ameaça importante desta espécie é principalmente a sua resistência intrínseca a antibióticos, que é de grande preocupação em instituições de saúde públicas 10 e uma contra-indicação para transplante pulmonar 11. M. abscessus exibe lisas (S) ou ásperas morfotipos (R) da colônia que levam a desfechos clínicos diferentes. Em contraste com a estirpe S, R bactérias têm uma tendência para crescer uma extremidade à outra, levando a uma corda ou cabo, como a estrutura 12,13. Vários estudos independentes com base em modelos celulares e animais seja revelado o fenótipo hiper-virulência do morfotipo R 14,15. A partir de estudos epidemiológicos, os casos mais graves de M. infecções pulmonares abscessus parecem estar associados com R 16 variantes que são a única variante quetem sido visto a persistir por anos em um hospedeiro infectado 3. A diferença morfotipo depende da presença (em S) ou perda (em R $) de glycopeptidolipids associada de superfície (GPL) 12. No entanto, devido às limitações inerentes dos modelos celulares / animais actualmente disponíveis utilizados para estudar M. infecção abscessus, o nosso conhecimento sobre os eventos fisiopatológicos das variantes R ou S permanece obscura. A infecção de ratos imuno-competentes através de via intravenosa ou aerossóis conduz à colonização transiente, o que dificulta a utilização de ratos para estudar infecções persistentes e in vivo para os testes de susceptibilidade droga 17. Por conseguinte, o desenvolvimento de modelos animais susceptíveis à manipulação da resposta do hospedeiro é um grande desafio. Neste contexto, os modelos não-mamíferos de infecção foram recentemente desenvolvidos, incluindo Drosophila melanogaster 18 que oferece várias vantagens, tais como custos, velocidade e ética o aceitabilidadeVer o modelo de mouse. O modelo de peixe-zebra (Danio rerio) de infecção também tem sido explorada para visualizar, por imagem não-invasivo, a progressão e cronologia da M. abscessus infecção em um animal vivo 19. Importante, uma prova de conceito também foi criado para demonstrar a sua aptidão para avaliações in vivo de antibióticos contra M. abscessus 17,20. O peixe-zebra têm sido amplamente utilizados durante as duas últimas décadas para estudar as interacções entre vários agentes patogénicos e o sistema imune do hospedeiro 21. O crescente sucesso deste modelo vertebrado alternativa depende de grandes e únicas oportunidades que motivaram e validados a sua utilização para uma melhor compreensão das inúmeras infecções virais e bacterianas 19,22,23,24,25,26,27,28,29. Ao contrário da maioria dos outros modelos animais, embriões de peixe-zebra são opticamente transparentes, permitindo que imagens de fluorescência não-invasivo 30. Esta has levou a estudar M. abscessus infectado embriões de peixe-zebra com detalhes sem precedentes, culminando com a descrição dos cordões extracelular, que representam um exemplo de plasticidade morfológica bacteriana. Cordões representa um novo mecanismo de subverter o sistema imunitário e um mecanismo de chave promover patogénese de M. aguda infecção abscessus 19. Este relatório descreve novas ferramentas e métodos que utilizam o embrião de peixe-zebra para decifrar os traços fisiopatológicos da M. abscessus infecção e para estudar as interacções entre os bacilos íntimas e do sistema imune inato. Em primeiro lugar, um protocolo detalhado microinjecção que inclui o processamento do inoculo bacteriano, preparação de embriões, e infecção por si só, é apresentada. Métodos especificamente adaptado para avaliar M. virulência abscessus medindo vários parâmetros, tais como a sobrevivência do hospedeiro e a carga bacteriana, são apresentados. É dado especial relevo sobre comopara monitorar, a um nível de espaço-temporal, o destino e a progressão da infecção e da resposta imune do hospedeiro a M. abscessus usando microscopia de vídeo. Além disso, para investigar a contribuição eo papel dos macrófagos durante M. abscessus infecção, métodos para gerar macrófagos-empobrecido embriões (usando abordagens quer genetically- ou baseados em quimicamente) são descritos. Finalmente, os protocolos para visualizar as interações específicas com macrófagos ou neutrófilos seja utilizando embriões fixos ou vivem são documentados. O objetivo deste relatório é estimular novos estudos para lançar uma nova luz em M. mecanismos de virulência abscessus e particularmente o papel de cordões no estabelecimento de um processo de infecção aguda e descontrolada.

<table><tbody><tr><td>BBL MGIT PANTA</td><td>BD Biosciences</td><td>245114</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-E</td><td></td></tr><tr><td>Catalase de Fígado Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H10 Ágar</td><td>BD Biosciences</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Caldo</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Tricaína)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Oleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Delta Microscopia</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319244</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Gibco Life Technologie</td><td>30391-023</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixo derretimento</td> Sais Instantâneos do Mar <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Aquarium Systems Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato&nbsp;</td><td>Instrumento Sutter Inc</td><td>BF100-78-10</td><td>1 mm OD X 0,78 mm ID</td></tr><tr><td>Dispositivo extrator de micropipetas&nbsp;</td>Extrator de <td>Micropipeta Flamming/Brown</td>da <td>Sutter Instrument Inc</td><td></td> p-87</tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Tritech Research&nbsp;</td><td></td><td>MicroINJETOR Digital, Pinça Minj-D</td></tr><tr><td></td><td>Sciences Tools inc</td><td></td><td>Dumont # M5S&nbsp;</td></tr><tr><td>Pontas de microcarregadeira</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

decifrar e imagem patogênese e cording de<em&gt; mycobacterium abscessus</em&gt; em embriões zebrafish

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Os embriões de peixe-zebra (Danio rerio) são cada vez mais utilizados como modelo de infecção para estudar a função do sistema imune inato dos vertebrados nas interações patógeno-hospedeiro. A facilidade de obtenção de um grande número de embriões, sua acessibilidade devido ao desenvolvimento externo, sua transparência óptica, bem como a disponibilidade de uma ampla panóplia de ferramentas genéticas/imunológicas e coleções de linhas repórter transgênicas, contribuem para a versatilidade deste modelo. A este respeito, o presente manuscrito descreve o uso do peixe-zebra como um sistema modelo in vivo para investigar a cronologia da infecção por Mycobacterium abscessus. Este patógeno humano pode existir como variantes lisas (S) ou ásperas (R), dependendo da composição da parede celular, e sua respectiva virulência pode ser visualizada e comparada em embriões e larvas de peixe-zebra. A microinjeção de variantes fluorescentes S ou R diretamente na circulação sanguínea através da veia caudal leva a infecções crônicas ou agudas / letais, respectivamente. Este sistema biológico permite a visualização e análise de alta resolução do papel do cordão micobacteriano na promoção da formação de abscessos. Além disso, o uso de bactérias fluorescentes junto com linhagens transgênicas de peixe-zebra que abrigam macrófagos fluorescentes produz uma oportunidade única para imagens multicoloridas das interações patógeno-hospedeiro. Este artigo descreve protocolos detalhados para a preparação de inóculo homogêneo de M. abscessus e para injeção intravenosa de embriões de peixe-zebra para subsequente imagem de fluorescência da interação com macrófagos. Essas técnicas abrem caminho para futuras investigações envolvendo mutantes defeituosos na formação do cordão e são dedicadas a entender como isso afeta a patogenicidade de M. abscessus em um vertebrado inteiro.

Apesar de vários sítios anatômicos podem ser injetados 32, injeções veia caudal são muitas vezes utilizados para gerar infecção sistêmica para análises posteriores, incluindo experiências de sobrevivência, determinação carga bacteriana, atividade fagocitose ou a formação do cordão umbilical. As injecções nos músculos da cauda são usados ​​para avaliar o recrutamento de macrófagos no local da injecção (Figura 3A). Para investigar e comparar a virulência de R e S variantes de M. abscessus,<...

Embriões de peixe-zebra opticamente transparentes são amplamente utilizados para estudar e visualizar em tempo real as interações entre microrganismos patogênicos e as células imunes inatas. A microinjeção de Mycobacterium abscessus, combinada com imagens de fluorescência, é usada para examinar características patogênicas essenciais, como a formação de cordão em embriões de peixe-zebra.

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar e comparar a virulência de cepas de Mycobacterium abscessus e descrever as interações entre essas bactérias e o sistema imunológico inato do hospedeiro in vivo, utilizando embriões transparentes de peixe-zebra. Isso é realizado primeiramente preparando uma inoculação bacteriana homogênea. Em seguida, os embriões são injetados intravenosamente com as suspensões bacterianas 30 horas após a fecundação.Além disso, para estudar com maior precisão o papel dos macrófagos no controle da infecção, é utilizada uma técnica de injeção baseada em lipocônjugo para gerar embriões desprovidos de macrófagos. Por fim, os embriões infectados são preparados e analisados por microscopia de fluorescência e microscopia confocal para acompanhar a progressão da infecção. Em última instância, os resultados que podem ser obtidos demonstram as interações específicas entre as células fagocíticas fluorescentes e o M. abscessus, seja como bactérias individuais ou como cordões serpentiformes dentro de um embrião transparente.A principal vantagem do uso de peixes-zebra em comparação com outros modelos animais, como camundongos, é que ele permite investigar especificamente o processo de infecção em tempo real e analisar imagens das interações específicas entre Mycobacterium abscessus e macrófagos ou neutrófilos. Esta etapa é um aspecto crítico para a pressão de injeção subsequente em peixes-zebra. Devido à alta propensão do Mycobacterium abscessus rugoso em formar grandes agregados e produzir biofilmes, um tratamento específico é necessário para preparar um inóculo homogêneo e quantitativamente controlado antes da microinjeção.Para preparar m abscessus, inocular a colheita de culturas em crescimento exponencial de frascos de cultura de tecido de 150 centímetros quadrados em tubos plásticos estéreis de 50 mililitros e centrifugar a 4.000 × g e temperatura ambiente por 15 minutos. Utilizar um mililitro de Middlebrook sete H nove, suplementado com o enriquecimento OADC, mais tween 80, doravante referido como meio sete H nove, para ressuspender o pellet e Eloqua. Transferir 200 microlitros das suspensões bacterianas para tubos de 1,5 mililitro com uma agulha de 26 gauge e homogeneizar cada ALI quad da suspensão bacteriana 15 vezes.Em seguida, utilizando um banho-maria com ultrassom, sonique três vezes por 10 segundos cada, com intervalos de dez segundos. Entre as sonicações, adicione um mililitro do meio 7H9 e vortexe brevemente, depois centrifugue a 100 × g durante três minutos. Colete cuidadosamente os sobrenadantes contendo micobactérias para evitar agregados e transfira as suspensões homogêneas para um tubo plástico estéril de 50 mililitros.Centrifugue a suspensão a 4.000 × g durante cinco minutos e use 200 microlitros de meio 7H9 para ressuspender o pellet e avaliar o inóculo bacteriano final. De acordo com o protocolo descrito, a demonstração visual deste método é crítica, pois os passos são difíceis de aprender devido à manipulação precisa e suave da injeção em embriões de peixe-zebra sob o microscópio, bem como à aquisição da técnica de microinjeção, o que exige tempo. Para realizar a microinjeção de M. abscessus em aproximadamente 24 horas pós-fertilização (HPF), use pinças para acomodar os embriões em uma placa de Petri de 100 milímetros e mantenha-os a 28,5 graus Celsius.Transfira 30 a 48 embriões HPF para uma câmara de posicionamento em forma de V preenchida com 25 mililitros de água para peixes contendo 270 miligramas por litro de trica, utilizando uma ponteira de microcarga recortada. Posicione adequadamente os embriões nos canais para facilitar a manipulação. Use PBST com 0,05% entre 80 e 100 para diluir o inóculo microbacteriano até a concentração desejada de UFC a ser administrada, incluindo 10% de vermelho de fenol para verificar a injeção correta com uma ponteira de microcarga.Carregue uma agulha de microinjeção com cinco a 10 microlitros do inóculo bacteriano. Conecte a agulha de microinjeção ao suporte de um micromanipulador ligado ao injetor e use pinças finas para quebrar a ponta da agulha. Para obter um diâmetro de abertura de cinco a 10 micrômetros.Calibre o volume de injeção ajustando a pressão e o tempo de microinjeção. Em seguida, para obter o volume de injeção necessário, meça o diâmetro de uma gota expelida na gema de um embrião para microinjetar na veia coddle. Posicione o embrião com o lado ventral voltado para a agulha e coloque a ponta da agulha próxima à abertura urogenital.E empurre suavemente a ponta da agulha para dentro do embrião até que ela perfure levemente a região da veia coddle. Em seguida, aplique o volume desejado de suspensão bacteriana, normalmente de um a três nanolitros contendo cerca de 100 UFC por nanolitro. Incube e monitore os embriões de acordo com o protocolo descrito no texto para realizar a lipo Choate, a depleção de macrófagos e os embriões às 24 HP. Destine os embriões e transfira-os para uma placa de injeção preenchida com água para peixes contendo trica.Em seguida, posicione-os com o lado dorsal voltado para baixo. Após agitar a solução de cloreto de lipossoma encapsulado, carregue a agulha de microcapilar e calibre o volume de injeção. Fure a região da veia coddle conforme demonstrado anteriormente e injete dois a três litros da solução.Repita a injeção três vezes. Incube os embriões a 28,5 graus Celsius e utilize microscopia de fluorescência para controlar a correta redução de macrófagos antes da infecção. Como demonstrado anteriormente neste vídeo, enumere as unidades formadoras de colônia ou UFCs no ponto temporal desejado.Colete cinco embriões por condição de infecção e transfira cada embrião para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Anestesie os embriões com criogenia por meio da incubação em gelo durante 10 minutos, após a eutanásia dos embriões com 300 a 500 miligramas por litro de Trica. Use água estéril para lavar os embriões duas vezes em um tubo novo.Em seguida, após remover a água com uma solução de Triton X-100 a 2% em PBS 1X em cada embrião, utilize uma agulha de calibre 26 para homogeneizar o tecido e obter lise completa. Após centrifugar a suspensão, utilize PBS-T 1X para ressuspender o precipitado. Em seguida, plaque diluições seriadas do homogenato em Middlebrook 7H10 com OADC.Suplemente com B-B-L-M-G-I-T Panta e incube as placas a 30 graus Celsius por quatro dias antes de contar as colônias. Para a imagem viva da infecção por M. abscessus, monte embriões anestesiados em ágar a 1% de ponto de fusão baixo em uma placa de Petri de fundo de vidro de 35 milímetros para microscopia invertida ou em uma lâmina com cavidade única para microscopia confocal ereta. Oriente o embrião para a posição desejada e cubra o ágar solidificado com água para peixes contendo trica. Para imagem fixada da infecção por M. abscessus, após a eutanásia dos embriões, transfira-os para tubos microcêntrifugos de 1,5 mililitro e fixe os embriões em paraformaldeído 4% em PBS-T 1X por duas horas.À temperatura ambiente, remova o paraformaldeído lavando os embriões duas vezes com X-P-B-S-T por 10 minutos para preservar a integridade dos tecidos e a fluorescência sucessivamente. Incube os embriões em concentrações crescentes de solução de glicerol por 10 minutos por condição. Coloque o embrião embutido em glicerol a 50% em uma câmara de visualização.Por fim, utilize um microscópio de fluorescência com objetiva de 10 x ou um microscópio confocal de fluorescência com objetivas de 40 x ou 63 x para aquisição sequencial de fluorescência e imagens de transmissão do embrião. Para investigar e comparar a virulência de variantes ásperos e lisos de M abscessus, bactérias fluorescentes foram injetadas por via intravenosa em 30 embriões proficientes em HPFC. Em contraste com a variante lisa, a variante áspera induz uma infecção mais intensa e letal, com o desenvolvimento de abscessos no sistema nervoso central.As diferenças na virulência foram quantificadas mediante a contagem de UFC ou pela determinação da contagem de pixels fluorescentes, que são correlacionados. Isso indica maiores cargas bacterianas para a variante rugosa. Como visto nesta figura, a cinética da formação de cordões pode ser monitorada e registrada por microscopia de vídeo de maneira não invasiva, demonstrando a propensidade da variante rugosa em se replicar extracelularmente, conforme mostrado aqui. A infecção de embriões esvaziados de macrófagos com o M. abscessus rugoso leva a um aumento maciço nas cargas bacterianas e na produção de cordões, bem como à morte larval rápida.Isso indica claramente que macrófagos são necessários para controlar a infecção por M abscessus a fim de observar em tempo real as interações entre macrófagos e M abscessus. A linha transgênica EG one M cherry, que produz macrófagos fluorescentes vermelhos, pode ser utilizada. As infecções induzem um acentuado recrutamento de macrófagos com fagocitose eficiente de bactérias individuais, enquanto os cordões micobacterianos representam uma estratégia desenvolvida por am abscesses para evitar serem fagocitados após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para explorar o importante papel do codificação como um novo mecanismo de evasão imunológica. Graças ao modelo de infecção em peixe-zebra, torna-se agora possível observar e descrever a contribuição in vivo dos códigos na patogênese de Mycobacterium abscessus.

deciphering-imaging-pathogenesis-cording-mycobacterium-abscessus

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Fonte: Zhang, X., et al. Um modelo de embrião de peixe-zebra para visualização in vivo e análise intravital da infecção por Staphylococcus aureus associada a biomateriais. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra imagens de fluorescência de embriões de peixe-zebra injetados com Staphylococcus aureus, permitindo a quantificação da progressão da infecção e distribuição bacteriana para avaliar o impacto das microesferas de biomateriais nas interações patógeno-hospedeiro in vivo.

 Imagem de fluorescência de infecção bacteriana associada a biomateriais em embriões de peixe-zebra

Fonte: Niu, L., et al. Visualização da morte celular lítica de macrófagos durante infecção por micobactérias em embriões de peixe-zebra via microscopia intravital. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o uso da microscopia confocal intravital para visualizar a morte celular lítica de macrófagos em embriões de peixe-zebra após infecção por Mycobacterium marinum .

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Fonte: Bernut, A., et al., Decifração e Imagem da Patogênese e Cordamento de Mycobacterium abscessus em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2015).Este vídeo demonstra um protocolo para isolar e quantificar Mycobacterium abscessus de um embrião infectado de peixe-zebra. O procedimento envolve eutanásia embrionária, lise dos tecidos e homogeneização para liberar as bactérias, seguidas de centrifugação e ressuspensão em um tampão de surfactante. Por fim, a suspensão bacteriana é diluída em...

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Fonte: Bernut, A., et al. Decifração e Imagem da Patogênese e Cordamento do Mycobacterium abscessus em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um protocolo que utiliza embriões transgênicos de peixe-zebra expressando macrófagos fluorescentes e infectados com a cepa áspera fluorescente Mycobacterium abscessus para visualizar as interações hospedeiro-patógeno. Ele revela como o cordão extracelular possibilita a evasão imunológica, promovendo a sobrevivência bacteriana e...

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