Name: Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprenda a medir a taxa de filtração glomerular em ratos conscientes usando injeção única de FITC-inulina e modelo de decaimento exponencial bifásico. Este método não invasivo permite avaliar a função renal sem cirurgia.

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Agradeço ao Dr. Jessica Dominguez Rieg para a leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association (Scientist Desenvolvimento Grant 10SDG2610034), a Carl W. Gottschalk Research Grant da Sociedade Americana de Nefrologia, o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais O&#39;Brien Center for Acute Kidney Injury Research ( P30DK079337) e do Departamento de Assuntos de Veteranos.

1. Soluções <ol><li> 0,85% de NaCl: 8,5 g de NaCl / 1 l ddH2O (8,5 g / L). </li><li> 0,5 mol / L de HEPES pH 7,4 (dissolver 59,6 g de HEPES em 0,5 L de ddH 2 0 e ajustar o pH para 7,4 utilizando NaOH 10 N). </li></ol> 2. Preparação de FITC-inulina Injection Solution <ol><li> Pesar com FITC inulina para preparar uma solução a 5% e dissolvido em 0,85% de NaCl (normalmente 100 mg / 2 ml de 0,85% de NaCl) por aquecimento a 90 ° C até estar completamente dissolvido. </li><li> Pesar dissolvido solução de FITC-inulina e peso nota. </li><li> Cortar uma 20 centímetros pedaço de membrana de diálise (peso molecular de corte: 1000) e coloca em ddH2O durante 30 min para remover o residual NaN 3 a partir da membrana e lave algumas vezes depois. </li><li> Preencha dissolvido FITC-inulina em membrana de diálise e lacrar com encerramentos. </li><li> Pese toda membrana de diálise. </li><li> Colocar a membrana de diálise, em 1 L de solução de NaCl a 0,85% e agita-se lentamente à luz protegida durante 24 horas à rotemperatura om. </li><li> Pesar inteiro membrana de diálise novo e calcular a nova concentração (a água irá passar para o osmoticamente membrana e FITC não ligado ou ligado de FITC-inulina &lt;1,000 peso molecular irá mover para fora da membrana, assim, a concentração de FITC-inulina diminui substancialmente) . </li><li> A nova concentração FITC-inulina (c) é calculada utilizando a seguinte fórmula: C = N / V, onde n = quantidade de FITC-inulina inicial, V = novo volume (diferença de peso do tubo de diálise antes e depois da diálise mais o volume inicial de solução de FITC-inulina). </li><li> Antes de usar esterilizar solução dialisada com FITC inulina por filtração através de um filtro de seringa 0,22. </li><li> Ficar FITC-inulina protegido da luz (folha de alumínio), a 4 ° C. Dialisadas e esterilizado com FITC inulina pode ser utilizada para um máximo de 2 semanas. Participaram FITC-inulina pode ser re-dissolvido por aquecimento a 90 ° C durante alguns minutos. </li></ol> Nota: se estiver usandoFITC-sinistrin 16-18, o qual não necessita de diálise, todos os passos necessários para a diálise pode ser ignorada. 3. Injeção e Coleta de Sangue <ol><li> Tire o peso corporal (pc) dos camundongos antes do experimento. </li><li> Anestesiar ratos brevemente com isoflurano. </li><li> Por alto rendimento de 6 ratinhos siga protocolo fornecido na Figura 3. </li><li> Injetar 2 l / g de peso corporal de dialisado FITC-inulina no plexo retro-orbitária 24 usando um G30 ½ em agulha (remover bolhas de ar de 100 l seringa Hamilton, primeiro usando uma G26 ½ na agulha e, em seguida, mudar para um G30 ½ na agulha para injecção). </li><li> Corte de 1 mm da cauda do rato com uma tesoura uma vez e coletar sangue em 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 min após a injeção de Na-heparina minicapillaries. Seal minicapillaries após a coleta de sangue, com Cha-seal. </li><li> Manter as amostras protegidas da luz. </li><li> Coloque selado minicapillaries dentro hematocrit capilares e centrifugar durante 5 min. </li><li> Quebre minicapillaries usando um cortador de diamante e plasma toda transferência por pipetagem em um tubo de 0,2 ml. </li><li> Fazer uma diluição de 1:10 utilizando 2 ul de plasma e 18 ul de 0,5 mol / L de HEPES (pH 7,4) em 0,2 ml novo tubo (amostras podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C, para medições de fluorescência). </li><li> Meça 2 mL de amostra diluída com NanoDrop 3300 em duplicatas. A descrição e uso do instrumento é descrito aqui 5. </li></ol> 4. Elaboração de normas <ol><li> Coleta de sangue de ratos da mesma linhagem fundo em heparina revestido hematócrito capilares, girar e diluir 1:10 com 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), geralmente 80 mL de plasma + 720 ul de HEPES. </li><li> Diluir solução injeção FITC-inulina com plasma diluído mouse para obter as seguintes diluições padrão: 01:10: 10 ul solução não diluída de FITC-inulina + 90 ul de plasma diluído rato 1:100: 10 &amp; mu, Solução l (1.10) + 90 mL de plasma diluído rato 1:1000: 10 ul (1:100) + 90 ul de solução de plasma de rato diluído 1:2000: 30 ul (1:1) + 30 ul de solução de plasma de rato diluído 1:10000: 10 ul (1:5) + 40 ul de solução de plasma de rato diluído 1:20000: 20 ul (1:1) + solução de 20 ul de plasma diluído rato 1:100.000: 10 ul (1:5) + 40 ul de solução de plasma de rato diluído A concentração dos padrões dependerá da diálise e será sempre diferente para cada preparação de FITC-inulina. É necessário entrar na concentração para a curva padrão novo a cada vez. </li><li> Analisar os dados para calcular a taxa de filtração glomerular com software apropriado (por exemplo, GraphPad Prism) utilizando uma função de decaimento exponencial de duas fases, tal como descrito aqui 15, 20 e mostrado na secção de resultados representativas. </li></ol>

<ol><li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Kidney+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li>
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</ol>

O autor recebeu financiamento para cobrir os custos desta publicação pela Thermo Fisher Scientific.

O presente estudo descreve uma técnica para a determinação da taxa de filtração glomerular em ratos conscientes pela injeção single-bolus e análise de fluorescência em oito amostras de sangue por duas fases de decaimento exponencial. A medição da TFG em um rato leva 75 min. Ao utilizar um fluxograma especial, é possível medir a TFG de 6 ratinhos em 130 min. É possível repetir esse protocolo fluxograma até quatro vezes por dia e medir a taxa de filtração glomerular em 24 ratos. Nós este método modificado de modo que seja possível a recolha de sangue a partir de um pequeno recorte da cauda, ​​em vez de punção na veia da cauda, ​​o que é mais rápido e mais fácil para os investigadores a executar em relação ao punção da veia da cauda. Usando 10 ml de hematócrito capilares e uma diluição de 1:10, é possível reduzir a quantidade total de sangue necessário para &lt;100 ul. Finalmente, a fluorescência é medida utilizando um NanoDrop fluorospectrometer 3300, que permite a determinação da fluorescência de 1-2 ul de amostra diluída. Este método vai dar o investigato interessadosra o verdadeiro valor da TFG. Em contraste, as medições de creatinina em ratos têm várias deficiências, incluindo &quot;gama cego creatinina&quot;, e dificuldades relacionadas com a determinação específica e sensível. A &quot;escala de creatinina cego&quot; limita a sua função como um marcador para a taxa de filtração glomerular da creatinina sérica, porque permanece na gama normal de até 50% da função renal é perdido 19. Uma vez que vários investigadores utilizam camundongos geneticamente modificados em suas pesquisas para estudar a fisiologia e fisiopatologia renal, este tem o seguinte problema: supondo que um camundongo knockout do gene X teria um GFR significativamente menor (40%) em comparação com um rato do tipo selvagem, uma triagem simples, comparando creatinina plasmática não detectar essa diferença. A necessidade de um bom método preciso para determinação TFG torna-se mais crítica quanto menor as diferenças na taxa de filtração glomerular se. Os ratos têm concentrações elevadas de chromagens não creatinina no plasma e na urina que interferem com comercialmenteOs ensaios da creatinina estão disponíveis. Consequentemente, os ensaios que se baseiam na picrato Jaffé reacção alcalina sobreavaliação concentração de creatinina no plasma em comparação com a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) determinação 6, 13. Outra limitação é que a creatinina sérica é inferior aos limites de detecção dos vários ensaios disponíveis comercialmente em comparação com a análise por HPLC. No entanto, através da utilização de reacções enzimáticas investigadores foram capazes de determinar a creatinina no plasma em ratinhos 10, 22. TFG em uma faixa semelhante foram encontrados em ratos conscientes, utilizando um método comparável de injeção single-bolus, bem como desembaraço FITC-inulina urinária 14. Em contraste com o seu protocolo, o nosso protocolo usando recorte cauda não exige precauções especiais para preservar a integridade do vaso em relação ao punção da veia da cauda, ​​ou veia safena. Para o apuramento urinária / plasma baseada FITC-inulina é necessário implantar cirurgicamente duas milhas osmóticanipumps. Duas bombas são necessárias para atingir suficientes concentrações plasmáticas no estado de equilíbrio alta FITC-inulina que são claramente distinguíveis do fundo. Isso também requer o uso de gaiolas metabólicas para coleta de urina completo e cronometrado. As gaiolas devem ser enxaguados para ter em conta a perda de 25-37% de FITC-inulina, que de outro modo ocorre sem enxaguar. Os perigos de usar este método de FITC-inulina são limitadas. Os investigadores devem estar cientes do seguinte: (i) assegurar que não há bolhas de ar na seringa usada para a injeção da solução de FITC, (ii) a injeção retrobulbar completo deve ser alcançado porque a quantidade injetada determina a TFG calculada e ( iii) a ratos vão mais provável urinar durante o 75 min experimento TFG, portanto, evite a contaminação de amostras de sangue com a urina, o que terá uma concentração muito elevada de FITC-inulina, como uma consequência da capacidade de concentração renal. Vantagens Geral of este método FITC-inulina incluem o seguinte: (i) é uma técnica não-radioactivos, (ii) é possível repetir várias vezes medições no mesmo rato, (iii) o ensaio pode ser realizado em ratos conscientes, ( iv) recolha de urina não é necessário, e (v) uma opção de alto rendimento podem ser utilizadas. As desvantagens para a injecção de bolus único incluem a necessidade de diálise de FITC-inulina, que pode ser ultrapassada pela utilização de um melhor marcador FITC, FITC-sinistrin, que está disponível e pode ser medido usando um dispositivo transcutea miniaturizado especial 18. Mesmo que a TFG é medida, não é possível medir a excreção fracionada de fluido ou de iões com este método. Tomados em conjunto, este método oferece a viabilidade de um método de alto rendimento para a medição da TFG em ratos conscientes. Assim, esta técnica pode ser de interesse para outros pesquisadores que estão interessados ​​na determinação da função renal em camundongos.

A taxa de formação de ultrafiltrado do plasma no glomérulo tornou-se a base para a avaliação da função renal (taxa de filtração glomerular, TFG). O marcador ideal para determinar a TFG deve ser filtrada livremente, nem segregada ou reabsorvido e não metabolizado. Tal comportamento foi encontrado para ser verdadeiro para inulina, e depuração de inulina tornou-se um padrão-ouro para a determinação da taxa de filtração glomerular 3. Considerando que a liberação de creatinina é amplamente utilizado como uma medida da taxa de filtração glomerular em humanos e animais, a creatinina não preenche os requisitos de um marcador ideal da TFG. Cerca de 10 - 40% do clearance de creatinina em seres humanos é a conseqüência de secreção tubular ativa 1, 11, e secreção renal de creatinina também é destaque em camundongos e ratos 4, 7, 9, 22. A disfunção renal é conhecido para aumentar a secreção tubular de creatinina, que limita a sua utilidade como um marcador de uma taxa de filtração glomerular, 2. Nós mostramos anteriormente que ânion orgânico transportador isoforma3 (OAT3) contribui para murino secreção de creatinina 22. No entanto, a depuração de inulina normalmente requer o uso de inulina marcada radioactiva (3 H, ou 14 C). A determinação radioactiva da inulina pode ser utilizada tanto em ratinhos anestesiados e conscientes, mas abriga as desvantagens de vários regulamentos de segurança e problemas de manuseamento inerentes rigorosas com a utilização de isótopos radioactivos. Ao longo destas linhas, os preparativos apuramento cirúrgicas para determinação da TFG são demorados, bem como do terminal na natureza. Em 1999 Lorenz et al. 12 introduzida FITC-inulina, como marcador do único nefrónio TFG em ratos anestesiados. Cinco anos mais tarde, Qi et al. 15 determinou todo rim TFG em ratinhos conscientes utilizando FITC-inulina. Protocolos alternativos estão usando agora FITC-inulina como um marcador exógeno para medir a taxa de filtração glomerular em ratos conscientes e anestesiados. Estes protocolos de reter a sensibilidade de inulina radioactivos usando fluorescência DETECTIe em contornar as desvantagens de se trabalhar com um marcador radioactivo marcado. O ensaio FITC-inulina foi modificado por outros 7, 8 e nos 22, 23 para aproveitar a capacidade microvolume do NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Isto permite a redução do volume total de amostra necessária para &lt;100 ul de sangue por TFG medida. Com o método e o protocolo de alto rendimento fornecida nesta publicação, que demonstram a viabilidade da medição de GFR em até 24 ratinhos conscientes por dia. Esta técnica pode ser útil para outros pesquisadores que estudam GFR murino e esperamos que ele irá substituir métodos menos precisos como índices para a função renal, tais como creatinina e uréia no sangue.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>FITC-inulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7706</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Webster Membrana</td><td>de diálise 78366551</td><td></td>veterinária</tr><tr><td>(MWCO 1000)</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132636</td><td></td></tr><tr><td>Fechamento de membrana</td><td>Spectrum Laboratórios</td><td>132736</td><td></td></tr><tr><td>80 &mu; l Capilares de hematócrito</td><td>Drummond Scientific</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de hematócrito</td><td>IEC</td><td>Micro-MB</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l Na+-Heparin minicaps Seringa</td><td>9000210</td><td></td><td>Hirschmann</td></tr><tr><td>(100 &mu; l)</td> <td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroespectrômetro</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 3300</td><td></td></tr><tr><td>Filter (0.22 &mu; m)</td> <td>Spectrum Laboratories</td><td>880-26464-UE</td><td></td></tr><tr><td>Selante</td><td>Ch&#226;-seal</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas (G26 &frac12; e G30 &frac12;)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305111 & 305106</td><td></td></tr></tbody></table>

um método de alta capacidade para medição de taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A medida da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão ouro na avaliação da função renal. Actualmente, os investigadores a determinar TFG por medição do nível de creatinina no biomarcador endógena ou exogenamente aplicado radioactivos inulina marcada (3 H, ou 14 C). Creatinina tem a desvantagem substancial de que as contas de secreção tubulares proximais para ~ 50% da excreção de creatinina e, por conseguinte, a creatinina é um marcador fiável da TFG. Dependendo da experiência realizada, a depuração de inulina pode ser determinada através de uma única injecção de bolus ou infusão intravenosa continua (intravenosa ou mini bomba osmótica). Ambas as abordagens requerem a recolha de plasma ou de plasma e urina, respectivamente. Outros inconvenientes da inulina rotulado radioactivo incluem o uso de isótopos, demorado preparação cirúrgica dos animais, e a exigência de uma experiência de terminal. Aqui, nós descrevemos um método que usa uma única injecção bolusfluoresceína isotiocianato (FITC) de inulina marcada e a medição da sua fluorescência em 1-2 ml de plasma diluído. Através da aplicação de um modelo de dois compartimentos, com oito coletas de sangue por mouse, é possível medir a TFG em até 24 ratos por dia usando um protocolo especial de fluxo de trabalho. Este método requer apenas anestesia isoflurano breve com todas as amostras de sangue a ser coletado em um mouse não-contido e acordado. Outra vantagem é que é possível seguir ratinhos durante um período de vários meses, e os tratamentos (isto é, fazendo experiências emparelhadas com as alterações dietéticas ou aplicações de droga). Esperamos que esta técnica de medição da TFG é útil para outros pesquisadores que estudam a função renal do rato e vai substituir métodos menos precisos para estimar a função renal, tais como creatinina plasmática e uréia.

TFG será calculada utilizando a seguinte fórmula: TFG = n / (+ A/K1 B/K2), onde n = quantidade injetada (n = c • V, onde c = concentração FITC-inulina, V = volume injetado) A = amplitude1, y-interceptar de eliminação K1 = constante de decaimento para a eliminação B = Span2, y-interceptar de distribuição K2 = constante de decaimento para distribuição Nota: A, K1, K2 e B são abreviaturas dadas por GraphPad Prism, cada um software capaz de analisar duas fase de decaimento exponencial pode ser utilizado, no entanto, outro software científica podem usar diferentes abreviaturas. Ao empregar um ajuste da curva de decaimento exponencial de duas fases, que se baseia no plasma concentrações de FITC-inulina, uma curva similar à mostrada na Figura 1, deve ser obtida. Calculando TFG pela fórmula mostrada acima (e como descrito aqui &lt;sup&gt; 20) permite detectar perturbações da função renal glomerular, hiperfiltração 15 ou 8, 23, conforme se encontra em ratos com diabetes mellitus tipo 1 (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> Figura 1. Para medir a taxa de filtração glomerular nos ratos conscientes, cinética plasmática do FITC-inulina na sequência de uma injecção intravenosa de uma dose única é usado. Para o cálculo da taxa de filtração glomerular, um modelo de dois compartimentos é empregue. No modelo de dois compartimentos, a fase inicial rápida decomposição representa redistribuição do FITC-inulina a partir do compartimento intravascular para o fluido extracelular. A fase posterior, com uma queda mais lenta em concentração de FITC-inulina, reflecte predominantemente depuração sistémica a partir do plasma. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> Figura 2. Detection de hiperfiltração diabética em ratinhos de tipo selvagem. Diabetes mellitus tipo I foi induzida por aplicação intraperitoneal de estreptozotocina (STZ, 50 mg / kg durante 5 dias consecutivos). TFG foi determinada antes (basal) e 5 semanas após a indução do diabetes. Devido ao feedback tubuloglomerular, um aumento primário na reabsorção proximal provoca cedo hiperfiltração diabético 21 uma descoberta que é reproduzível em camundongos selvagens (n = 10, p &lt;0,01 vs basal mesmo mouse). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> Figura 3. Fluxograma para a medição da taxa de filtração glomerular em um conjunto de seis camundongos. Para medir todo renal TFG pelo método de injeção única em bolus, oito amostras de sangue devem ser coletadas em 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 min após FITC-inulina injecção. Os números indicam os pontos temporais. Os números entre parênteses indicam o número da amostra. Momentos à esquerda da linha vertical vermelha indica injeçãoOs pontos de tempo (0, 11, 22, 33, 44 e 55 min). Cada rato é marcado com uma cor diferente. Para obter coletas de sangue sequenciais seguir as setas. Caixas cinzentas indicar quando o próximo rato deve estar preparado para anestesia com isoflurano antes da injecção. Usando este protocolo o tempo mínimo entre duas coletas de sangue de diferentes ratos é 1 min.

Medição da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão ouro para avaliação da função renal. Aqui, nós descrevemos um método de alto rendimento que permite a determinação da taxa de filtração glomerular em ratinhos conscientes utilizando uma única injecção de bolus, a determinação de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-inulina no plasma e no cálculo da TFG por um modelo de decaimento exponencial de duas fases.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

O objetivo geral deste procedimento é mostrar a outros pesquisadores como determinar a função renal em camundongos acordados. Isso é realizado primeiramente por meio da diálise de inulina marcada com isotiocianato de fluoresceína, ou inulina FSE, durante 24 horas e da determinação de sua concentração para injeção. O segundo passo é pesar o camundongo, preparar volumes precisos de inulina fitzy para injeção retrobulbar e anestesiar o camundongo.Em seguida, realiza-se a injeção retrobulbar de inulina Fitzy e são coletadas oito amostras de sangue ao longo de um período de 75 minutos. O passo final consiste em medir a Fitz Nulin utilizando um fluoro espectrômetro de microvolume e calcular a função renal empregando um modelo de decaimento exponencial bifásico. No fim das contas, combinar a sensibilidade do método de injeção única em bólus de Fiti Nulin com a capacidade de microvolume do fluoro espectrômetro permite detectar diferenças na função renal causadas por modificações genéticas em camundongos, alterações na dieta ou aplicações de fármacos.As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como infusão contínua e condições anestesiadas, implantação de minibombas osmóticas e uso de inulina radioativa, são que não é necessária cirurgia, não se trata de um experimento terminal, não é preciso coletar urina e é possível realizar até 24 medições por dia.Eu demonstrarei este procedimento juntamente com Maria Azimo, pesquisadora associada do meu laboratório, para preparar a solução injetável de Fitzy Nulin. Pese quantidade suficiente de ZI inulina para dois mililitros de uma solução a 5%, dissolva a inulina marcada em solução de cloreto de sódio a 0,85% aquecendo até 90 graus Celsius até completa dissolução. Coloque um pedaço de membrana de diálise de 20 centímetros em água bidestilada durante 30 minutos para remover o ácido residual de sódio da membrana, enxágue a membrana algumas vezes posteriormente, preencha a membrana de diálise com a inulina Fitzy dissolvida, feche-a adequadamente com clipes, e então pese toda a membrana.Deixe a inulina fitzy dissolvida dialisar em um litro de solução de cloreto de sódio 0,85% e agite lentamente, protegido da luz, por 24 horas à temperatura ambiente. Após a diálise, pese novamente toda a membrana de diálise e calcule a nova concentração. A água se moverá osmoticamente para dentro da membrana e a FSI não ligada sairá da membrana. Assim, a concentração de inulina FSI diminuirá substancialmente.Calcule a nova concentração de fit e inulina usando esta fórmula, onde C é a nova concentração, N é a quantidade inicial de fit E inulina e V é o novo volume, que corresponde à diferença de peso do tubo de diálise antes e depois da diálise, somada ao volume da solução inicial de fitzy inulina. Em seguida, esterilize a solução dialisada por filtração através de um filtro de seringa de 0,22 mícron.Lembre-se de sempre manter a inulina fitzy protegida da luz para evitar fotobranqueamento antes do experimento. Meça o peso corporal dos camundongos após anestesiá-los brevemente com 4 a 5% de isoflurano. Verifique a profundidade da anestesia pelo reflexo do rabo. Aspire dois microlitros por grama de peso corporal de inulina fitzy dialisada utilizando uma seringa Hamilton de 100 microlitros com agulha de 26 graus e meio centímetro de comprimento para remover bolhas de ar; em seguida, troque para uma agulha de 30 graus e meio centímetro de comprimento para a injeção.Prossiga com a injeção da inulina fitzy dialisada no plexo retro-orbital. Deixe os camundongos se recuperarem espontaneamente em suas gaiolas de origem. Corte um milímetro da cauda do camundongo com tesoura uma única vez e colete sangue em múltiplos pontos temporais após a injeção em capilares mini de heparina sódica.Selar capilares mini após a coleta de sangue com selante cha e manter as amostras protegidas da luz. Colocar os capilares mini selados dentro de capilares de hematócrito e centrifugar por cinco minutos após a centrifugação. Quebrar os capilares mini utilizando um cortador de diamante e transferir todo o plasma por pipetagem para um tubo de 0,2 mililitro.Prepare uma diluição de um para 10 utilizando dois microlitros de plasma e 18 microlitros de tampão de 0,5 mols por litro em um novo tubo de 0,2 mililitro. Em seguida, meça dois microlitros da amostra diluída com o NanoDrop 3300 em duplicatas para alto rendimento de seis camundongos. Siga o protocolo do fluxograma fornecido no texto para medir o GFR renal total pelo método de injeção única de bólus: oito amostras de sangue devem ser coletadas aos 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 minutos após a injeção de FSE nulin.Neste fluxograma, os números indicam os pontos de tempo de coleta, enquanto os números entre parênteses indicam os pontos de tempo do número da amostra; à esquerda da linha vermelha vertical estão indicados os pontos de tempo de injeção. Cada camundongo é marcado com uma cor diferente. Para obter coletas sanguíneas sequenciais, siga as setas.As caixas cinzas indicam quando o próximo camundongo deve ser preparado para anestesia com isoflurano antes da injeção usando este protocolo. O tempo mínimo entre duas coletas de sangue de camundongos diferentes é de um minuto. Dilua a solução de injeção de fitzynulina com plasma de camundongo diluído para obter as diluições-padrão listadas no protocolo textual. A concentração dos padrões dependerá da diálise e será sempre diferente para cada preparação de fitzynulina.Portanto, é necessário inserir a concentração para a curva padrão a cada vez. Analise os dados para calcular a taxa de filtração glomerular ou TFG com um software apropriado, utilizando uma função de decaimento exponencial bifásica, conforme descrito em detalhes no protocolo do texto, para medir a TFG em camundongos conscientes. A cinética plasmática da inulina ZI após uma única dose por injeção intravenosa é utilizada para o cálculo da TFG, sendo empregado um modelo de dois compartimentos.A fase inicial de decaimento rápido representa a redistribuição da inulina fitzy do compartimento intravascular para o líquido extracelular. A fase posterior, com decaimento mais lento na concentração de inulina fitzy, reflete predominantemente a depuração sistêmica do plasma. O diabetes melito tipo 1 foi induzido pela aplicação intraperitoneal de estreptozotocina.A FGR foi determinada antes e cinco semanas após a indução de diabetes tipo 1; os animais diabéticos mostram claramente hiperfiltração glomerular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a FGR em camundongos grandes utilizando uma técnica de injeção única em bólus e empregando um modelo exponencial de duas fases DK.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra a aspiração de fluidos de glomérulos de camundongos usando a técnica de micropuntura mediada por dois fótons. A técnica fornece acesso aos glomérulos do camundongo vivo e, portanto, ajuda a obter informações sobre a fisiologia renal.

Aspiração de fluidos de glomérulos de camundongos: um método para aspirar fluido glomerular de camundongos usando micropuntura mediada por dois fótons

Uma técnica de alta resolução utilizando microscopia intavital 2-fotão para visualizar e quantificar directamente filtração gloemrular nos glomérulos superfície. Este método permite a determinação direta de características de permeabilidade de macromoléculas em estados normais e doentes.

Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

O objetivo deste protocolo é demonstrar os princípios e técnicas para medir e calcular a taxa de filtração glomerular, a taxa de fluxo de urina e a excreção de sódio e potássio em um rato. Esta demonstração pode ser usada para fornecer aos alunos uma compreensão conceitual geral de como medir a função renal.

Laboratório de Fisiologia Demonstração: Taxa de filtração glomerular em um Rat

A determinação da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão-ouro para avaliar a função renal geral. No entanto, os procedimentos tradicionais para medir esse parâmetro são complicados e exigem um grande investimento de tempo. Aqui descrevemos um método mais rápido e minimamente invasivo para determinar a TFG por via transcutânea.

Avaliação transcutânea da função renal em roedores conscientes

Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

Apresentamos o uso da microscopia 2-fóton para colocar uma micropipeta no espaço urinário de Bowman em camundongos, combinando 2 técnicas fundamentais da fisiologia renal. Uso da microscopia 2-fóton supera limitações críticas de microscopia convencional para estudos de Fisiologia renal de micropunção.

Micropunção do espaço de Bowman em camundongos facilitada pela microscopia de fóton 2

Aqui descrevemos um protocolo para medir a taxa de filtração glomerular (TFG) em consciente, movimentando-se livremente ratos usando um monitor de TFG transdérmica.

Transdermal medição da taxa de filtração Glomerular em ratos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para testar a permeabilidade glomerular nos ratos usando um Tracer altamente sensível, nonradioativo. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina.

Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando microscopia de 2 fótons em ratos Wistar Fromter de Munique com glomérulos superficiais para quantificar os efeitos da obstrução ureteral prolongada na dinâmica e função glomerular.

Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

A taxa de filtração glomerular (TFG) é o marcador ideal para avaliar a função renal. No entanto, o método de medição padrão usando injeção de inulina com análise seriada de sangue e urina é impraticável. Este artigo delineia um método prático para medir a TFG por via transdérmica em leitões.

Medição Transdérmica da Taxa de Filtração Glomerular em Leitões Ventilados Mecanicamente

Este estudo apresenta um conjunto fácil de usar, completo e simples de métodos para marcar e analisar glomérulos de rins de camundongos eliminados pela CUBIC. Dados como número e volume de glomérulos podem ser obtidos de forma fácil e confiável usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextran, microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) ou microscopia confocal comum e software como Imaris.

Um método eficiente e rápido para rotular e analisar glomérulos de camundongos

Aprenda a medir a taxa de filtração glomerular em ratos conscientes usando injeção única de FITC-inulina e modelo de decaimento exponencial bifásico. Este método não invasivo permite avaliar a função renal sem cirurgia.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

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