Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

O objetivo geral deste procedimento é mostrar a outros investigadores como determinar a função renal em camundongos acordados. Isso é feito primeiro dialisando isotiocianato de fluoresceína ou inulina FSE por 24 horas e determinando sua concentração para injeção. O segundo passo é pesar o camundongo, preparar volumes precisos de inulina fitzy para injeção retrobulbar e anestesiar o camundongo.

Em seguida, é realizada a injeção de inulina Retrobulbar Fitzy e oito amostras de sangue são coletadas em um período de 75 minutos. A etapa final é medir Fitz Nulin usando um espectrômetro de flúor de micro volume e calcular a função renal empregando um modelo de decaimento exponencial de duas fases. Em última análise, a combinação da sensibilidade do método de injeção em bolus único Fiti Nulin com a capacidade de microvolume do espectrômetro de flúor permite detectar diferenças na função renal causadas por modificações genéticas em camundongos, mudanças na dieta ou aplicações de medicamentos.

As principais vantagens desta técnica sobre os métodos existentes, como infusão contínua e condições anestesiadas, a implantação de minibombas osmóticas usando inulina radioativa é que nenhuma cirurgia é necessária. Não é um experimento terminal. Não é necessário coletar urina e é possível medir até 24 M por dia.

Estarei demonstrando este procedimento junto com Maria Azimo, uma pesquisadora associada do meu laboratório Para preparar a solução injetável Fitzy Nulin. Pese inulina ZI suficiente para dois mililitros de uma solução a 5%, dissolva a inulina marcada em solução de cloreto de sódio a 0,85% aquecendo a 90 graus Celsius até dissolver completamente. Coloque um pedaço de membrana de diálise de 20 centímetros em água bidestilada por 30 minutos para remover o ácido de sódio residual da membrana, lave a membrana algumas vezes depois, encha a membrana de diálise com selo de inulina Fitzy dissolvido adequadamente com tampas e, em seguida, pese toda a membrana.

Deixe a inulina fitzy dissolvida dialisar em um litro de solução de cloreto de sódio a 0,85% e mexa lentamente protegida da luz por 24 horas em temperatura ambiente após a diálise, pese toda a membrana de diálise novamente e calcule a nova concentração. A água se moverá osmoticamente para dentro da membrana e o FSI não ligado sairá da membrana. Assim, a concentração de inulina FSI diminuirá substancialmente.

Calcule a nova concentração de inulina usando esta fórmula, onde C é a nova concentração. N é a quantidade inicial de inulina E ajustada e V é o novo volume, que é a diferença de peso do tubo de diálise antes e depois da diálise, mais o volume da solução inicial de inulina fitzy. Em seguida, esterilize a solução dialisada por filtração através de um filtro de seringa de 0,22 mícron.

Lembre-se de sempre manter a inulina fitzy protegida da luz para evitar o fotobranqueamento antes do experimento. Tome o peso corporal dos camundongos após anestesiar os camundongos brevemente com flúor ISO de quatro a 5%. Verifique a profundidade da anestesia por reflexo de toína, aspire dois microlitros por grama de peso corporal de nulina fitzy dialisada usando uma seringa Hamilton de 100 microlitros com uma agulha de calibre 26 de meia polegada de comprimento para remover bolhas de ar e, em seguida, mude para uma agulha de calibre 30 de meia polegada de comprimento para injeção.

Prossiga para injetar a inulina fitzy dialisada no plexo retroorbital. Permita que os ratos se recuperem espontaneamente em sua gaiola doméstica. Cubra um milímetro de cauda de rato com uma tesoura uma vez e colete sangue em vários momentos após a injeção em minicapilares de heparina sódica.

Sele os mini capilares após a coleta de sangue com cha seal e mantenha as amostras protegidas da luz. Coloque os mini capilares selados dentro dos capilares de hematócrito e centrifugue por cinco minutos após a centrifugação. Quebre os mini capilares usando um cortador de diamante e transfira todo o plasma pipetando em um tubo de 0,2 mililitro.

Faça uma diluição de um a 10 usando dois microlitros de plasma e 18 microlitros de 0,5 moles por litro em um novo tubo de 0,2 mililitro. Em seguida, meça dois microlitros da amostra diluída com o NanoDrop 3, 300 em duplicatas para alto rendimento de seis camundongos. Siga o protocolo do fluxograma fornecido no protocolo de texto para medir a TFG renal total pelo método de injeção em bolus único, oito amostras de sangue devem ser coletadas em 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 minutos após a injeção de nulina FSE.

Neste fluxograma, os números indicam pontos de tempo de coleta, enquanto os números entre parênteses indicam o número de amostras, os pontos de tempo à esquerda da linha vermelha vertical indicam pontos de tempo de injeção. Cada mouse é marcado com uma cor diferente. Para obter coletas de sangue sequenciais, siga as setas.

As caixas cinzas indicam quando o próximo camundongo deve ser preparado para anestesia com flúor antes da injeção usando este protocolo. O tempo mínimo entre duas coletas de sangue de camundongos diferentes é de um minuto diluído Fitzy solução injetável de nulina com plasma de camundongo diluído para obter as diluições padrão listadas no protocolo de texto. A concentração dos padrões dependerá da diálise e será sempre diferente para cada preparação de FSI nulina.

Portanto, é necessário inserir a concentração para a curva padrão a cada vez. Analise os dados para calcular a taxa de filtração glomerular ou TFG com o software apropriado usando uma função de decaimento exponencial bifásico, conforme descrito em detalhes no protocolo de texto para medir a TFG em camundongos conscientes. A cinética plasmática da inulina ZI após uma injeção intravenosa de dose única é usada para o cálculo do modelo GFRA de dois compartimentos é empregado no modelo de dois compartimentos.

A fase inicial de decaimento rápido representa a redistribuição da inulina fitzy do compartimento intravascular para o fluido extracelular. A fase posterior, com decaimento mais lento na concentração de inulina fitzy, reflete predominantemente a depuração sistêmica do plasma. O diabetes mellitus tipo um foi induzido pela aplicação intraperitoneal de estreptozotocina.

A TFG foi determinada antes e cinco semanas após a indução do diabetes, os animais diabéticos tipo um apresentam claramente hiperfiltração glomerular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a TFG em camundongos grandes usando uma técnica de injeção de bolus único e empregando um modelo DK exponencial de duas fases.