Name: Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a quantificar a permeabilidade glomerular de macromoléculas fluorescentes em ratos Wistar de Munique usando microscopia intravital de 2 fótons. Este método permite visualizar a filtração renal em tempo real.

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Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Silvia B Campos-Bilderback e George J Rhodes para a realização dos procedimentos cirúrgicos envolvendo a colocação de linhas de acesso venoso. Eles também gostariam de agradecer a Sara E Desmame para manter as colônias Munich-Wistar, que consistem em Simonsen e cepas Frömter.

1. Conjugação de albumina de soro de rato Sulfo-rodamina 101 sulfonilo (vermelho do Texas) <ol><li> Dissolve-se 100 mg de albumina de soro de rato (RSA) em 6.667 ml de bicarbonato de sódio a 100 mM pH 9,0; concentração final de 15 mg / ml num tubo de 50 mL cónico. </li><li> Solução lugar no gelo / água copo e legal entre 0 e 4 ° C. </li><li> Adicionar 200 mL de dimetil formamida anidra qualidade elevada (DMF) a um frasco de 10 mg de cloreto de sulfonilo vermelho do Texas (TRSC); vórtice no meio durante 15 seg. </li><li> Solução RSA Vortex no meio e adicione o TRSC dissolvido. </li><li> Envoltório cónico de 50 ml em folha (Parafilm pode ser usado para assegurar uma vedação hermética é formada), local horizontalmente w / gelo e apenas lugar no balancim solução a agitar lentamente (para evitar a formação de bolhas) no balde de gelo, para permitir a reacção prosseguir a 0 a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Adicione 5 L de solução salina a 0,9%, e molhar um peso molecular de 50 kDa cortado câmara, que pode ser tanto uma) membrana de diálise com clipes, b) ditubagem ÁLISE como num flutuador-a-lyzer, ou c) da cassete Slide-a-lyzer (todos adequados para a remoção de TRSC não conjugada). </li><li> Mistura de reacção lugar na câmara de diálise e colocar no recipiente de 5 L w / solução salina a 0,9%, dializar durante a noite a 4 ° C, com uma agitação suave, utilizando uma barra de agitação. </li><li> Alterar a solução de diálise de 5 L de manhã e no fim da tarde até uma incubação durante a noite resulta em praticamente nenhuma mudança de cor (Isto normalmente leva ~ 48 h, com pelo menos quatro trocas). Além disso, com o MWCO de 50 kDa estar tão perto do MW de RSA, 66kDa, que nunca é possível produzir uma solução límpida, que será dependente da distribuição do tamanho de poro da membrana, 60 horas e 5 trocas é tempo mais do que suficiente. </li><li> Medir o volume e se dividir o peso inicial de 100 mg por o volume para dar uma concentração aproximada de TR-RSA; tipicamente concentrações intervalo 10-13 mg / ml. O corante final: razão de albumina deve ser ~ 4:1, um fluoróforo por 15,000 Daltons de massa molecular da proteína. Armazenar a 4 ° C; NUNCA congelar a solução TR-RSA, como resultado a fragmentação que pode ocorrer se alterar os valores de permeabilidade. </li></ol> 2. Preparando o Microscópio Stage invertido para a imagem latente / Microscópio Configurações <ol><li> Ponto ~ 4-7 pedaços de fita de autoclave (aproximadamente ¾ &quot;de comprimento) perfeitamente empilhadas umas sobre as outras no interior de 50 mm com um prato inferior lamela de 40 mm (lamela prato inferior). Estes devem ser colocados mais perto de uma das arestas de modo que o borda da fita vai entrar em contacto com a borda de curvatura do rim, mas não bloquear o caminho da luz objectivo (Figuras 1A e 1B), ratos maiores exigirá mais espaço entre a fita ea aresta de prato. </li><li> Colocar duas almofadas Repti-Therm próximos à fase juntamente com os primeiros 50 mm prato (Figura 1A). Coloque um aquecimento da água da camisa cobertor sobre o palco. </li><li> Maximizar a eficiência na recolha de imagens, assegurando a torre objetivo tem o ar 10xr 20x (ar ou água de imersão) a objetiva de imersão em água de maior potência para coletar imagens para a quantificação objetiva e. </li><li> Durante as imagens do modo mais eficiente para adicionar água para os objectivos está a rodar para o lado e adicionar água usando uma seringa de 1 cc com uma peça longa de tubo de PE-200, que pode atingir o topo dos objectivos. </li><li> Definir a intensidade da excitação do laser 10watt a ~ 15-20%, utilizando os filtros de densidade neutra em relação ao software. O arsenieto de gálio fosforeto fotodetectores não descanned estão definidos para 750 para coletar as emissões verdes, e 625 para recolher as emissões vermelhas. Emissão azul (tal como a mancha nuclear Hoechst 33342) são recolhidos utilizando um detector de multialkaline nondescanned padrão com uma definição entre 750-800. </li><li> Para assegurar a correcta recolha das emissões de baixa intensidade no espaço de Bowman, certifique-se os limites inferiores dos detectores são ajustados de modo a não excluir esses valores. Marcadores de aviso visual irá indicar se a sensibilidadeajuste é demasiado baixo e estes valores são sendo dado um valor de intensidade de zero. </li><li> Carregue uma seringa de 1 cc com ~ 5-8 mg da solução de albumina fluorescente diluído com solução salina 0,9% estéril para abrir o volume total de 1 cc. </li></ol> 3. A exposição do Rim em Munich Wistar Rat para Intravital dois fótons de imagem <ol><li> Comece com um rato pré-anestesiados usando Pentabarbitol (50 mg / ml de solução, μl/100 120 g de peso corporal), Inactina (130 mg / ml de solução, μ/100 120 g de peso corporal), ou Isofluorano (indução 5%, 1,5 a manutenção 2,5%), uma linha de acesso venoso residente (venosa ou femoral ou jugular), e do flanco esquerdo raspada a partir debaixo da caixa torácica para apenas acima da coxa esquerda. </li><li> Coloque o rato plana em seu lado direito, para que o lado esquerdo raspada está voltada para cima, certifique-se que está sobre a mesa, com a sua postura alongada e não agachado, com as patas dianteiras tocando um ao outro e as patas traseiras tocar uns aos outros (Figura 2A). </li&gt; <li> Muito apalpar suavemente para sentir o rim para determinar onde ele naturalmente coloca dentro do retroperitônio e desenhar uma linha reta paralela ao corpo (de costelas de coxa), utilizando uma Sharpie (Figura 2A). </li><li> Pegue a pele com um par de pinças dentadas, e apertar a pele ao longo da linha traçada usando um par de hemostats para esmagar o tecido e evitar hemorragias. Corte ao longo da incisão usando um par de tesouras cirúrgicas. Trituração a pele exterior e as camadas musculares antes do corte irá reduzir drasticamente e tipicamente eliminar sangramento. </li><li> Repita este procedimento para a camada muscular externa, que é fino. </li><li> Para a incisão na camada muscular interna, que vai expor o peritoneu, o re-apalpar o rim para estimar o tamanho. Beliscar uma linha de incisão menor do que o rim, garantindo a incisão é apenas sobre o rim. É melhor fazer essa incisão muito pequena e torná-lo maior, se necessário. Se esta for muito grande, será necessário suturar.Esta última incisão é crítica; muito mais em qualquer direção irá afetar a estabilidade no palco e induzir tanto artefatos de movimento de respiração (melhor cenário) ou vai esticar a perfusão renal pedículo e reduzir adversamente renal (pior cenário). </li><li> Localize o rim (como mostrado na Figura 2B) e pega a gordura ao redor usando uma pinça, trabalhando para o pólo inferior do rim em uma mão sobre a mão de moda. </li><li> Uma vez que o pólo inferior do rim é atingido, puxe o rim através da incisão enquanto aperta muito suavemente abaixo do rim para exteriorizar. Se a incisão é muito pequena, da camada muscular esmagar e cortar a alargá-la, repetindo o procedimento para exteriorização do rim. </li></ol> 4. Colocar a Munich Wistar Rat no Palco for Imaging <ol><li> Colocar o rim para a borda do prato lamela com o rim ligeiramente rodado para a dorsal (lado posterior) do rato de modo que o lado ventral do rim is fazer contato com o prato fundo de lamela (Figura 1A). Adicionar uma solução aquecida, estéril 09.% De solução salina para o prato. </li><li> Olhar através da objetiva de 10x ou 20x e verificar se há movimento. Se for detectado movimento, rolar o rato sobre um pouco para que o tórax é mais longe do prato fundo lamela, certifique-se o rim é o mais próximo da borda do prato, sem alongamento do pedículo renal (Figura 1B). </li></ol> 5. Aquisição de Imagens para quantificar a permeabilidade renal de albumina <ol><li> Cálculo da permeabilidade glomerular (Glomeruluar coeficiente de crivagem; SGC) de qualquer macromolécula exigirá tendo referência a imagens de glomérulos individuais fundo antes da infusão da molécula fluorescente. Se o seu microscópio é equipado com um palco motorizado capaz de localizações de marcação, encontrar e centro de glomérulos individuais usando o objetivo potência menor e marcar cada local. A dupla passagem Fluorescein / Rhodamine epifluorescência filter é ideal para este procedimento, embora seja filtro de emissão vai funcionar (contraste de fase ou de outras fontes não-fluorescência de iluminação não vai funcionar). Os glomérulos aparece como estruturas circulares vazios rodeados por tubos proximais possuindo um autoflourescence amarelo-laranja inerente quando vista através do filtro de passagem dupla. </li><li> Se o microscópio não tem uma fase motorizada, digitalizar o rim num padrão de quadriculação, com o objectivo de baixa potência e fazer um mapa do local onde o rudimentar glomérulos individuais estão localizados, baseando-se marcos naturais, tais como grandes vasos sanguíneos superficiais que se encontram acima da cápsula renal ou manchas de gordura. </li><li> Desligue o revólver para o objectivo de imersão em água poder superior e tomar conjuntos de cada glomérulos de dados 3D certificando-se as alças capilares e espaço de Bowman são claramente visíveis. Usando uma paleta de pseudo (algo diferente de B / W) vai ajudar a visualizar essas estruturas. </li><li> Concentrando-se em um vaso sanguíneo superficial lentamente infundir em tele fluorescente albumina tomada de tempo com certeza é dada para permitir a distribuição sistêmica. Para moléculas com baixo SGC é essencial para maximizar os valores da intensidade do plasma, mas não atingir níveis que saturam os fotodetectores no microscópio. Isto aumenta a detecção de moléculas de filtrados. Nota: normalmente há um lapso sec 5-7 entre o tempo da albumina fluorescente é introduzido para o tempo que aparece na tela (aquisição de quadros completos em ~ 1 frame / segundo). </li><li> Permitir que aproximadamente 10 min, para permitir que quaisquer potenciais pequenos fragmentos de peso molecular para limpar, antes de adquirir os volumes 3D em intervalos de 1 um a ser utilizados no cálculo SGC albumina. Normalmente, a tensão de Munique ratos Wistar do Simonsen tem muito menos glomérulos superficiais, por isso tudo o que pode ser visualizado são analisados ​​e quantificados. A estirpe Frömter tem um número muito maior de modo que limita o número quantificado para ~ 10. </li><li> No final do estudo, o rato é sacrificado através de uma sobredosagem de anestésicosic utilizado no estudo. Uma dupla pneumothoracotamy é realizada para assegurar a eutanásia. </li></ol> 6. Calculando GSC para fluorescente Albumina de Volumes 3D <ol><li> Usando o software de processamento de imagem Metamorph carregar os conjuntos de dados 3D para cada glomérulos, tanto o conjunto de fundo e definir tomada após a infusão da albumina fluorescente. </li><li> No volume que contém a fluorescente albumina localizar uma alça capilar superficial com espaço suficiente espaço vazio entre suas margens definidas e da borda da cápsula de Bowman. </li><li> No volume fundo localizar o mesmo plano focal que deve conter todos os elementos visuais da imagem que contém albumina. Selecione uma região dentro do ciclo capilar de interesse e anote a leitura média intensidade. Em seguida, selecione uma região no espaço de Bowman e observe a leitura média intensidade. Estes serão utilizados como valores de fundo. </li><li> Para a quantificação, selecione a região semelhante dentro do espaço de Bowman no c albuminaimage ontaining. Faça isso por pelo menos duas outras regiões para ter um valor médio para a intensidade média no espaço de Bowman. </li><li> Selecione o ciclo capilar com a intensidade plasma brilhante e desenhar uma região em torno dele. Em seguida utilizando a função de limiar, destacar os valores brilhantes dentro do plasma circulante, evitando as estrias escuras que estão circulando RBC. Note-se os valores médios da intensidade do espaço de plasma seleccionado. É importante selecionar preferencialmente as áreas brilhantes do plasma porque fatores dentro do sangue servirá apenas para provocar e subestimação dos níveis plasmáticos de fluorescência. </li><li> Usando uma planilha do Microsoft Excel insira os valores para calcular o GSC onde: </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3B+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504(2007).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489(2009).</li>
<li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447(2012).</li>
<li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601(1992).</li>
<li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides%2C+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat%3A+Effects+of+molecular+size+and+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237(2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389(2008).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9(2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os passos destacados aqui representam o que sentimos ser aqueles que irão produzir valores de permeabilidade consistentes e precisas, porque eles contornar as seguintes armadilhas: <ol><li> Dispersão: a utilização de um emissor de fluoróforos vermelhos permitem uma recolha mais eficiente da luz uma vez que mais fotões de comprimento de onda são menos propensas a dispersão. Usando tanto fluorophores emissores verdes ou azuis irá introduzir uma maior variação na GSC da causa do aumento da variabilidade nos valores de ...

<table><tbody><tr><td>Microscópio confocal/multi-fotônico Olympus Floview 1000</td><td>Olympus America</td><td></td><td>Filtros para detectores: Azul 430/100, Verde 525/50, Vermelho 605/90</td></tr><tr><td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Comprimentos de onda de excitação sintonizáveis: ~750-1150 nm</td></tr><tr><td>Fotodetectores de fosfeto de arseneto de gálio</td><td>Hamamatsu Corp</td><td></td><td>Nota: Configurações montadas na frente ou na lateral disponíveis.</td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem Metamorph</td><td>Molecular</td><td></td><td>Dynamics Nota: Versão 6.1r1</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td></td><td>versão 2007</td></tr><tr><td>Manuseio de fórceps</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Tesoura de dissecação</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>CA Micro tesoura Modelo 1C300</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Fórceps Hemostático (reto)</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>Manta de Camisa de Água + Almofada de Aquecimento</td><td>Gaymar</td><td></td><td>T/Bomba PN 11184-000 Manta-66N111CC</td></tr><tr><td>Repti-Therm Sob o Aquecedor do Tanque</td><td>ZooMed</td><td></td><td>RH-4</td></tr><tr><td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td><td>Invitrogen/Molecular Probes</td><td>Cat# T-353</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Rato Albumina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A-6272</td><td></td></tr><tr><td>DMF Anidro de Alta Qualidade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# 270547</td><td></td></tr><tr><td>Strate-Line Autoclave Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de Fundo de Lamínula Willco-dish (50 mm/40 mm)</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificar glomerular permeabilidade de macromoléculas fluorescentes usando microscopia 2-photon em munique ratos wistar

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Doenças renais envolvendo perda urinária de grandes macromoléculas essenciais, tais como albumina do soro, têm sido desde há muito se pensa ser causada por alterações na permeabilidade da barreira composta de podócitos, as células endoteliais vasculares, e uma membrana basal trabalhando em uníssono. Dados do nosso laboratório usando microscopia intravital dois fótons revelou uma barreira mais permeável de filtração glomerular (GFB) do que se pensava em condições fisiológicas, com a recuperação de albumina filtrada ocorrendo em um subconjunto inicial de células chamadas células do túbulo proximal (PTC) 1,2 3. As técnicas anteriores usados ​​para estudar a filtração renal e estabelecer a característica da barreira de filtração envolvido micropunção do lúmen desses segmentos tubulares de amostragem mais cedo com o conteúdo ea análise do fluido 4. Estes estudos determinaram a concentração de albumina no fluido luminal ser virtualmente inexistente; correspondente estreitamentecom o que é normalmente detectado na urina. No entanto, a caracterização de polímeros de dextrano com tamanhos definidos por esta técnica revelou aqueles com uma dimensão semelhante à albumina do soro tinham níveis mais elevados no lúmen tubular e de urina, o que sugere uma maior permeabilidade 5. Aqui é uma descrição pormenorizada da técnica utilizada para visualizar diretamente e quantificar glomerular fluorescente permeabilidade albumina in vivo. Este método permite a detecção da albumina filtrada através da barreira de filtração para o espaço de Bowman (a câmara de filtração inicial urinária) e também permite a quantificação de albumina reabsorção pelo túbulo proximal e visualização subsequente de transcitose albumina 6. A ausência de albumina fluorescente ao longo dos segmentos tubulares posteriores rota para a bexiga realça a eficácia da via de recuperação nos segmentos tubulares proximais anterior. Além disso, quando esta técnica foi aplicada para determinar a permeabilidadedos foram relatados dextranos possuindo um tamanho semelhante aos valores de permeabilidade virtualmente idênticos albumina 2. Estas observações suportam diretamente a necessidade de ampliar o foco de muitas doenças renais proteinúricas para incluídos alterações na recuperação de células do túbulo proximal.

A Figura 3 mostra um exemplo de uma imagem feita a partir de uma superfície de um glomérulo Munique Frömter rato Wistar e as medidas tomadas para determinar a permeabilidade da albumina fluorescente. O valor do SGC para a albumina derivada de 0,0111 para esta queda glomérulo individual no intervalo visto nesta linhagem de ratos Wistar de Munique, quando na condição alimentada 3. A estabilidade visto nestas imagens é devido à concepção e execução de instruções representadas nas Figuras...

Uma técnica de alta resolução utilizando microscopia intavital 2-fotão para visualizar e quantificar directamente filtração gloemrular nos glomérulos superfície. Este método permite a determinação direta de características de permeabilidade de macromoléculas em estados normais e doentes.

Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar com sucesso a unidade de filtração do néfron e quantificar a filtração de macromoléculas fluorescentes através da barreira de filtração para o espaço urinário in vivo. Isso é feito preparando primeiro o estágio do microscópio para o animal vivo. Em seguida, o rim é exposto e o rato é colocado no palco.Em seguida, os glomérulos individuais são identificados e mapeados e as imagens 3D de fundo são adquiridas. Finalmente, a albumina fluorescente é infundida. Volumes 3D de glomérulos individuais são adquiridos e a permeabilidade é quantificada.Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o coeficiente de filtração de macromoléculas através dos glomérulos no rim através do uso de microscopia de dois fótons intra frasco. A principal vantagem da microscopia de dois fótons é que ela permite a quantificação simultânea da filtração glomerular e da reabsorção tubular proximal e transcitose no animal. Ao mesmo tempo, as implicações da técnica vão além do mecanicista para o diagnóstico e terapêutico, como a importância de entender o papel da filtração glomerular e do tubular proximal.A reabsorção de albumina é fundamental para determinar o direcionamento da terapia. Depois de anestesiar o rato, insira uma linha de acesso venoso permanente através da veia jugular ou femoral e raspe o flanco esquerdo logo abaixo da caixa torácica até logo acima da coxa esquerda. Esta é uma cirurgia de não sobrevivência.Coloque o rato deitado do lado direito, de modo que o lado esquerdo raspado fique voltado para cima. Certifique-se de que esteja plano no banco com a postura alongada e não agachado com as patas dianteiras se tocando e as patas traseiras se tocando muito suavemente. Palpe para sentir o rim para determinar onde ele se encontra naturalmente dentro do retroperitônio e use uma caneta para desenhar uma linha reta paralela ao corpo com um par de pinças dentárias.Pegue a pele e use um par de hemostáticos para beliscar a pele ao longo da linha desenhada para esmagar o tecido e evitar sangramento usando uma tesoura cirúrgica. Corte ao longo da incisão. Use o mesmo procedimento para cortar a camada muscular externa, que é fina conforme necessário.Use hemostáticos para evitar sangramento para a incisão na camada muscular interna, o que exporá o peritônio. Volte a palpar o rim para estimar o tamanho. Aperte uma linha de incisão menor que o rim, garantindo que a incisão esteja logo acima do rim.É melhor fazer essa incisão muito pequena e torná-la maior, se necessário. Localize o rim e use uma pinça para segurar a gordura circundante trabalhando em direção ao pólo inferior do rim de mão em mão. Assim que o pólo inferior do rim for alcançado, puxe suavemente o rim através da incisão enquanto aperta suavemente abaixo do rim para exteriorizá-lo.Se a incisão for muito pequena, esmague a camada muscular e corte para alargá-la. Repita o procedimento para exteriorizar o rim depois de exteriorizar o rim do rato e colocar o rato no microscópio para obter imagens. Se o seu microscópio estiver equipado com uma platina motorizada capaz de marcar locais, usando uma haste de fluoresceína de passagem dupla, filtro de domina e uma objetiva de baixa potência, encontre e centralize glomérulos individuais, que aparecerão como estruturas circulares vazias cercadas por túbulos proximais.Tendo uma autofluorescência laranja amarela inerente marcando cada local, mude a torre para uma objetiva de imersão em água de maior potência e obtenha conjuntos de dados 3D de cada glomérulo. Certificando-se de que os loops capilares e o espaço de Bowman estejam claramente visíveis. O uso de uma pseudopaleta de cores ajudará a visualizar essas estruturas.Em seguida, concentrando-se em um vaso sanguíneo superficial infundindo lentamente albumina fluorescente, certificando-se de que seja dado tempo para permitir a distribuição sistêmica de moléculas com baixo coeficiente de cing glomerular ou GSC, é essencial maximizar os valores de intensidade no plasma, mas não atingir níveis que saturem os fotodetectores no microscópio. Isso aumenta a detectabilidade das moléculas filtradas Depois de esperar aproximadamente 10 minutos para permitir que quaisquer fragmentos potenciais de pequeno peso molecular sejam eliminados, adquira volumes 3D em intervalos de um mícron para serem usados no cálculo da albumina usando o software de processamento de imagem metamorfo. Carregue os conjuntos de dados 3D junto com as imagens de fundo para cada glomérulo no volume que contém a albumina fluorescente.Localize uma alça capilar superficial com espaço vazio suficiente entre suas margens definidas e a borda da cápsula de Bowman. No volume de fundo. Localize o mesmo plano focal, que deve conter todas as pistas visuais da imagem contendo albumina.Selecione uma região dentro do loop capilar de interesse e anote a leitura da intensidade média. Em seguida, selecione uma região dentro do espaço de Bowman e observe a leitura da intensidade média. Estes serão usados como valores de fundo para quantificação.Selecione a região semelhante dentro do espaço de Bowman na imagem que contém a albumina. Faça isso para pelo menos duas outras regiões para adquirir um valor para a intensidade média dentro do espaço de Bowman. Selecione a alça capilar com a intensidade de plasma mais brilhante e desenhe uma região ao redor dela.Em seguida, usando a função de limiar, destaque os valores brilhantes dentro do plasma circulante, evitando as listras escuras que circulam nos glóbulos vermelhos. Observe os valores médios de intensidade do espaço de plasma selecionado. É importante selecionar preferencialmente as áreas brilhantes do plasma, pois os fatores no sangue servirão apenas para causar uma subestimação dos níveis de fluorescência plasmática.Insira os valores em uma planilha do Excel para calcular o GSC onde GSC é igual à diferença do espaço bruto do arqueiro. Intensidade menos fundo Intensidade do espaço de Bowman dividida pela diferença da intensidade bruta da alça capilar menos a intensidade da alça capilar de fundo. A captação de albumina fluorescente filtrada ocorre predominantemente no segmento inicial dos túbulos proximais.O S, este painel mostra uma seção transversal de um glomérulo e um segmento S retirado de um rato Munich Wistar, cerca de 20 minutos após a infusão de um bolus RSA vermelho do Texas inicial. A abertura do espaço Bowman e a ávida absorção da albumina em vermelho são mostradas no segmento S um. Este painel mostra uma projeção 3D rasa de 20 mícrons do mesmo conjunto de dados, e aqui é mostrada uma projeção de menor potência feita aproximadamente 60 minutos após a infusão.Essas imagens demonstram que a microscopia intravital pode permitir a visualização do destino do material infundido após a filtração, corroborando até certo ponto, o coeficiente de filtração observado aqui são imagens tiradas da superfície do glomérulo. Este painel é uma imagem de fundo e esta imagem foi tirada cerca de 12 minutos após a infusão de albumina sérica de rato Texas Red. Esses dois painéis são desenhados em pseudo cor.Três pequenas regiões de interesse desenhadas no espaço de Bowman são usadas para calcular a intensidade média da albumina fluorescente que se moveu através da barreira de filtração. Os valores médios de intensidade para as regiões individuais foram relatados na área destacada dentro da caixa de diálogo mostrar estatísticas da região. O valor GSC para albumina de 0,0111 derivado para este glomérulo individual está dentro da cena de alcance nesta linhagem de ratos estrela de Munique quando na condição alimentada.Após este procedimento, outros métodos, como análise quantitativa e qualitativa, podem ser realizados em outras estruturas renais para responder a perguntas adicionais, como o eventual tráfego da macromolécula após a filtração no espaço urinário após seu desenvolvimento. Essa técnica permitiu que pesquisadores em fisiologia renal explorassem processos fisiológicos e fisiopatológicos dinâmicos, não apenas uma vez, mas longitudinalmente. Com o tempo, foi.

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Este vídeo mostra a aspiração de fluidos de glomérulos de camundongos usando a técnica de micropuntura mediada por dois fótons. A técnica fornece acesso aos glomérulos do camundongo vivo e, portanto, ajuda a obter informações sobre a fisiologia renal.

Aspiração de fluidos de glomérulos de camundongos: um método para aspirar fluido glomerular de camundongos usando micropuntura mediada por dois fótons

Medição da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão ouro para avaliação da função renal. Aqui, nós descrevemos um método de alto rendimento que permite a determinação da taxa de filtração glomerular em ratinhos conscientes utilizando uma única injecção de bolus, a determinação de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-inulina no plasma e no cálculo da TFG por um modelo de decaimento exponencial de duas fases.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

A preparação isolada de perfusão pulmonar de sangue faz com que seja possível visualizar redes microvasos na superfície do pulmão. Aqui nós descrevemos uma abordagem para quantificar a permeabilidade de microvasos de solteiro em pulmões isolados tempo real usando imagens de fluorescência.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.

Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

Apresentamos o uso da microscopia 2-fóton para colocar uma micropipeta no espaço urinário de Bowman em camundongos, combinando 2 técnicas fundamentais da fisiologia renal. Uso da microscopia 2-fóton supera limitações críticas de microscopia convencional para estudos de Fisiologia renal de micropunção.

Micropunção do espaço de Bowman em camundongos facilitada pela microscopia de fóton 2

Aqui descrevemos um protocolo para medir a taxa de filtração glomerular (TFG) em consciente, movimentando-se livremente ratos usando um monitor de TFG transdérmica.

Transdermal medição da taxa de filtração Glomerular em ratos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para testar a permeabilidade glomerular nos ratos usando um Tracer altamente sensível, nonradioativo. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina.

Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando microscopia de 2 fótons em ratos Wistar Fromter de Munique com glomérulos superficiais para quantificar os efeitos da obstrução ureteral prolongada na dinâmica e função glomerular.

Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

Este estudo apresenta um conjunto fácil de usar, completo e simples de métodos para marcar e analisar glomérulos de rins de camundongos eliminados pela CUBIC. Dados como número e volume de glomérulos podem ser obtidos de forma fácil e confiável usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextran, microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) ou microscopia confocal comum e software como Imaris.

Um método eficiente e rápido para rotular e analisar glomérulos de camundongos

Aprenda a quantificar a permeabilidade glomerular de macromoléculas fluorescentes em ratos Wistar de Munique usando microscopia intravital de 2 fótons. Este método permite visualizar a filtração renal em tempo real.

Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

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