Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

O objetivo geral deste procedimento é visualizar com sucesso a unidade de filtração do néfron e quantificar a filtração de macromoléculas fluorescentes através da barreira de filtração para o espaço urinário in vivo. Isso é feito preparando primeiro o estágio do microscópio para o animal vivo. Em seguida, o rim é exposto e o rato é colocado no palco.

Em seguida, os glomérulos individuais são identificados e mapeados e as imagens 3D de fundo são adquiridas. Finalmente, a albumina fluorescente é infundida. Volumes 3D de glomérulos individuais são adquiridos e a permeabilidade é quantificada.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o coeficiente de filtração de macromoléculas através dos glomérulos no rim através do uso de microscopia de dois fótons intra frasco. A principal vantagem da microscopia de dois fótons é que ela permite a quantificação simultânea da filtração glomerular e da reabsorção tubular proximal e transcitose no animal. Ao mesmo tempo, as implicações da técnica vão além do mecanicista para o diagnóstico e terapêutico, como a importância de entender o papel da filtração glomerular e do tubular proximal.

A reabsorção de albumina é fundamental para determinar o direcionamento da terapia. Depois de anestesiar o rato, insira uma linha de acesso venoso permanente através da veia jugular ou femoral e raspe o flanco esquerdo logo abaixo da caixa torácica até logo acima da coxa esquerda. Esta é uma cirurgia de não sobrevivência.

Coloque o rato deitado do lado direito, de modo que o lado esquerdo raspado fique voltado para cima. Certifique-se de que esteja plano no banco com a postura alongada e não agachado com as patas dianteiras se tocando e as patas traseiras se tocando muito suavemente. Palpe para sentir o rim para determinar onde ele se encontra naturalmente dentro do retroperitônio e use uma caneta para desenhar uma linha reta paralela ao corpo com um par de pinças dentárias.

Pegue a pele e use um par de hemostáticos para beliscar a pele ao longo da linha desenhada para esmagar o tecido e evitar sangramento usando uma tesoura cirúrgica. Corte ao longo da incisão. Use o mesmo procedimento para cortar a camada muscular externa, que é fina conforme necessário.

Use hemostáticos para evitar sangramento para a incisão na camada muscular interna, o que exporá o peritônio. Volte a palpar o rim para estimar o tamanho. Aperte uma linha de incisão menor que o rim, garantindo que a incisão esteja logo acima do rim.

É melhor fazer essa incisão muito pequena e torná-la maior, se necessário. Localize o rim e use uma pinça para segurar a gordura circundante trabalhando em direção ao pólo inferior do rim de mão em mão. Assim que o pólo inferior do rim for alcançado, puxe suavemente o rim através da incisão enquanto aperta suavemente abaixo do rim para exteriorizá-lo.

Se a incisão for muito pequena, esmague a camada muscular e corte para alargá-la. Repita o procedimento para exteriorizar o rim depois de exteriorizar o rim do rato e colocar o rato no microscópio para obter imagens. Se o seu microscópio estiver equipado com uma platina motorizada capaz de marcar locais, usando uma haste de fluoresceína de passagem dupla, filtro de domina e uma objetiva de baixa potência, encontre e centralize glomérulos individuais, que aparecerão como estruturas circulares vazias cercadas por túbulos proximais.

Tendo uma autofluorescência laranja amarela inerente marcando cada local, mude a torre para uma objetiva de imersão em água de maior potência e obtenha conjuntos de dados 3D de cada glomérulo. Certificando-se de que os loops capilares e o espaço de Bowman estejam claramente visíveis. O uso de uma pseudopaleta de cores ajudará a visualizar essas estruturas.

Em seguida, concentrando-se em um vaso sanguíneo superficial infundindo lentamente albumina fluorescente, certificando-se de que seja dado tempo para permitir a distribuição sistêmica de moléculas com baixo coeficiente de cing glomerular ou GSC, é essencial maximizar os valores de intensidade no plasma, mas não atingir níveis que saturem os fotodetectores no microscópio. Isso aumenta a detectabilidade das moléculas filtradas Depois de esperar aproximadamente 10 minutos para permitir que quaisquer fragmentos potenciais de pequeno peso molecular sejam eliminados, adquira volumes 3D em intervalos de um mícron para serem usados no cálculo da albumina usando o software de processamento de imagem metamorfo. Carregue os conjuntos de dados 3D junto com as imagens de fundo para cada glomérulo no volume que contém a albumina fluorescente.

Localize uma alça capilar superficial com espaço vazio suficiente entre suas margens definidas e a borda da cápsula de Bowman. No volume de fundo. Localize o mesmo plano focal, que deve conter todas as pistas visuais da imagem contendo albumina.

Selecione uma região dentro do loop capilar de interesse e anote a leitura da intensidade média. Em seguida, selecione uma região dentro do espaço de Bowman e observe a leitura da intensidade média. Estes serão usados como valores de fundo para quantificação.

Selecione a região semelhante dentro do espaço de Bowman na imagem que contém a albumina. Faça isso para pelo menos duas outras regiões para adquirir um valor para a intensidade média dentro do espaço de Bowman. Selecione a alça capilar com a intensidade de plasma mais brilhante e desenhe uma região ao redor dela.

Em seguida, usando a função de limiar, destaque os valores brilhantes dentro do plasma circulante, evitando as listras escuras que circulam nos glóbulos vermelhos. Observe os valores médios de intensidade do espaço de plasma selecionado. É importante selecionar preferencialmente as áreas brilhantes do plasma, pois os fatores no sangue servirão apenas para causar uma subestimação dos níveis de fluorescência plasmática.

Insira os valores em uma planilha do Excel para calcular o GSC onde GSC é igual à diferença do espaço bruto do arqueiro. Intensidade menos fundo Intensidade do espaço de Bowman dividida pela diferença da intensidade bruta da alça capilar menos a intensidade da alça capilar de fundo. A captação de albumina fluorescente filtrada ocorre predominantemente no segmento inicial dos túbulos proximais.

O S, este painel mostra uma seção transversal de um glomérulo e um segmento S retirado de um rato Munich Wistar, cerca de 20 minutos após a infusão de um bolus RSA vermelho do Texas inicial. A abertura do espaço Bowman e a ávida absorção da albumina em vermelho são mostradas no segmento S um. Este painel mostra uma projeção 3D rasa de 20 mícrons do mesmo conjunto de dados, e aqui é mostrada uma projeção de menor potência feita aproximadamente 60 minutos após a infusão.

Essas imagens demonstram que a microscopia intravital pode permitir a visualização do destino do material infundido após a filtração, corroborando até certo ponto, o coeficiente de filtração observado aqui são imagens tiradas da superfície do glomérulo. Este painel é uma imagem de fundo e esta imagem foi tirada cerca de 12 minutos após a infusão de albumina sérica de rato Texas Red. Esses dois painéis são desenhados em pseudo cor.

Três pequenas regiões de interesse desenhadas no espaço de Bowman são usadas para calcular a intensidade média da albumina fluorescente que se moveu através da barreira de filtração. Os valores médios de intensidade para as regiões individuais foram relatados na área destacada dentro da caixa de diálogo mostrar estatísticas da região. O valor GSC para albumina de 0,0111 derivado para este glomérulo individual está dentro da cena de alcance nesta linhagem de ratos estrela de Munique quando na condição alimentada.

Após este procedimento, outros métodos, como análise quantitativa e qualitativa, podem ser realizados em outras estruturas renais para responder a perguntas adicionais, como o eventual tráfego da macromolécula após a filtração no espaço urinário após seu desenvolvimento. Essa técnica permitiu que pesquisadores em fisiologia renal explorassem processos fisiológicos e fisiopatológicos dinâmicos, não apenas uma vez, mas longitudinalmente. Com o tempo, foi.