Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar cardiomiócitos humanos de células IPS humanas cultivadas em condições livres de alimentador. Isso é feito primeiro colocando as células IPS em placas de fixação ultrabaixa para formar corpos embrionários. A segunda etapa do procedimento é transferir os corpos embrionários formados para placas revestidas de gelatina.

Quando as áreas de contração aparecem, elas são dissecadas manualmente sob o microscópio estéreo e semeadas em placas revestidas de fibronectina. Para maior diferenciação, a etapa final é a obtenção de cardiomiócitos únicos por digestão enzimática de aglomerados em contração. Em última análise, os resultados podem mostrar a diferenciação de células semelhantes a cardiomiócitos que expressam marcadores estruturais típicos, ou seja, troponina cardíaca por meio de microscopia de imunofluorescência.

Este método pode ajudar a responder a uma questão-chave no campo da biologia cardiovascular, como, por exemplo, quais são os mecanismos que impulsionam a diferenciação e disfunção cardio durante o desenvolvimento cardiovascular e doenças ao nível do cardiomiócito humano. Esta é uma técnica muito interessante porque permite a geração de cardiomiócitos in vitro a partir de pacientes humanos e indivíduos humanos. E, em segundo lugar, permite a recapitulação da doença no tubo de ensaio para que novos medicamentos possam ser experimentados in vitro antes de serem in vivo.

Experimentação Comece com culturas de células IPS confluentes cultivadas em placas revestidas com matrigel de 35 milímetros. Substitua o meio de crescimento por um mililitro de PBS contendo um miligrama de diss. Examine as células usando pipetas de vidro com sondo.

Remova regiões com células diferenciadas, como crateras ou estruturas císticas no centro das colônias. Remova também todas as áreas onde as células se separaram, se achataram e parecem estar migrando para fora. Agora incube as células restantes a 37 graus Celsius sob um capuz de cultura até que as bordas da colônia se tornem mais brilhantes e comecem a se desprender.

Isso geralmente leva entre cinco e sete minutos. Neste ponto, remova a solução dispa e lave as células com um mililitro de HESM. Em seguida, descarte a solução de lavagem.

Em um mililitro novo de HESM, use um levantador de células para colher as colônias. Reúna as colônias em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, enxágue as células com outro mililitro de HESM e gire-as a 1000 vezes G por quatro minutos.

Em seguida, prossiga com o plaqueamento das células no matrigel e troque o meio diariamente durante o cultivo. Comece colhendo colônias IPS indiferenciadas conforme descrito na seção anterior. Uma vez isoladas as populações indiferenciadas, suspenda-as suavemente em um mililitro de EBM 20.

Usando uma pipeta de dois mililitros, não quebre muito os aglomerados de células. Limite a pipetagem a dois ou três golpes. Verifique o tamanho das colônias sob o estereoscópio entre os traços.

Quando as colônias são todas do mesmo tamanho, elas não precisam mais ser misturadas. Agora coloque as células em placas de fixação ultrabaixa, preenchendo uma placa de seis poços por placa de células colhidas. Não se esqueça de enxaguar o tubo com um mililitro de EBM 20 e distribuir o enxágue no prato.

Após o terceiro dia de incubação, troque o meio usando um microscópio para evitar a remoção dos corpos embrionários. Mantenha a pipeta perto da borda da placa. No sétimo dia, mova os corpos embrionários para placas revestidas com 0,1% de gelatina aquecida a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Adicione 35 a 40 corpos embrionários a cada prato de 35 milímetros em dois mililitros de meio. Durante o cultivo. Troque o meio duas vezes por semana regularmente.

Verifique se há áreas de batida nos corpos embrionários e marque onde as áreas de contas estão localizadas. Na parte superior da tampa do prato, as áreas de contração de contas devem aparecer após aproximadamente 10 a 20 dias. Quando as áreas com contração espontânea aparecerem, mude seu meio para EBM dois Depois que as áreas de contração aparecerem, continue cultivando e monitorando outras áreas da placa por até um mês.

No total. Na MBE dois A deficiência do processo de diferenciação é altamente dependente de vários fatores, sendo os mais críticos as linhagens celulares específicas e o lote de soro usado para induzir a cardiodiferenciação. Para obter a maior eficiência, teste várias linhas para o potencial cardiogênico e vários lotes de soro Comece revestindo 12.

Placas de poço com cinco microgramas por centímetro quadrado de fibronectina em PBS 300 microlitros por poço devem cobrir completamente a superfície de cada poço. Deixe as placas secarem descobertas em uma capa de cultura de células. Para remover a área de beading da cultura de células, use uma pipeta de vidro puxado e bisturi.

Em seguida, usando uma pipeta de um mililitro, transfira de quatro a cinco grampos para cada poço de uma placa revestida com fibronectina. Uma vez que todas as coletas tenham sido feitas, adicione um mililitro de EBM dois aos poços carregados na placa de coleta marque as áreas onde as células foram removidas. Em seguida, troque o meio e retorne a placa para a capa de cultura.

Se forem necessários aglomerados menores sob um microscópio estéreo, passe as áreas explantadas por uma pipeta. Isso produz pequenos aglomerados contendo algumas células batendo. Na cultura.

Troque o meio duas vezes por semana até que esteja pronto para análise. Primeiro, prepare lâminas de duas câmaras quadradas de quatro centímetros, revestindo-as com 20 microgramas de fibronectina diluída em PBS suficiente para cobrir a superfície. Se um suporte de vidro for usado, adicione mais 20 microgramas de laminina.

Isole a área de cultura do grânulo conforme descrito anteriormente. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira as células para um tubo de 15 mililitros contendo 500 microlitros de tubo de colagenase. Incube as células por 15 minutos e agite o tubo uma vez durante a incubação.

Após 15 minutos, mova as células através de uma pipeta de 200 microlitros para remover aglomerados se houver grumos. Transfira as células para a colagenase dois fresca e repita a incubação quando não houver mais aglomerados grandes. Termine a digestão adicionando três mililitros de EBM, dois sem ácido sóico, pois cada um é preparado.

Armazene os tubos em um rack aquecido sob o capô e centrifugue-os a 1000 vezes G por quatro minutos em temperatura ambiente. Depois de centrifugado, faça uma suspensão das frações celulares da mesma amostra inicial em um mililitro de 0,25% de tripsina EDTA em PBS. Em seguida, incubar a suspensão por cinco minutos no bloco aquecido, inativar a tripsina com quatro mililitros de E BM dois sem ácido sóico.

Em seguida, passe as células por uma agulha de calibre 18 em uma seringa de 2,5 mililitros até sete vezes até que nenhum aglomerado grande seja visível ao microscópio. Em seguida, centrifugue as células a 1000 vezes G durante quatro minutos. Agora ressuspenda o pellet da célula em E BM dois e coloque-os em duas lâminas de câmara de poço.

As células estarão prontas para análises após dois a três dias de incubação. Os CMS foram gerados a partir de várias linhagens celulares IPS. Essas linhas foram inicialmente geradas em uma camada alimentadora de metanfetamina e imediatamente colocadas em matrigel usando um meio definido.

As células mostraram uma morfologia semelhante à ESC humana com bordas brilhantes de fase e núcleos proeminentes. A análise de imunofluorescência mostrou que as células IPS expressaram corretamente o fator de transcrição T quatro e expressaram o antígeno de superfície TRA um 60. A análise citofluorométrica confirmou a expressão de antígenos típicos de pluripotência de superfície, SS EEA quatro e TRA um 60.

A estratégia de gating é mostrada na dispersão à esquerda. Uma análise cariotípica das células IP FS cultivadas em gel de matriz também foi realizada. A indução na linhagem cardíaca foi desencadeada pela agregação das células IPS em ebs, juntamente com a cultura na presença de um tipo específico de soro.

E como as áreas de contração do ácido sórbico representaram de 20 a 35% do total da cultura, dependendo da linhagem celular utilizada. Os CMS contraídos foram isolados dessas regiões por digestão enzimática e analisados quanto à expressão proteica. R-T-P-C-R encontrou expressão de canais iônicos cardíacos específicos expressos nas células batedoras derivadas do IPS, mas não em células não batedoras.

Esses canais incluíam um alfa, uma subunidade de um canal de cálcio dependente de voltagem, uma subunidade alfa de um canal de sódio dependente de voltagem tipo cinco, um canal dependente de voltagem de potássio da subfamília KQT, e ambas as formas de miosina. A análise de imunofluorescência de cadeia pesada revelou que cardiomiócitos derivados de IPS únicos expressaram as proteínas estruturais, alfa sarcomérico, actina, troponina cardíaca I e a junção cardíaca específica, conexão 43. Afinal, essa técnica realmente abriu caminho para a modelagem de doenças do miocárdio in vitro e permite a experimentação de drogas no ambiente humano sem injetar a droga no corpo humano.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manter as células IPS em condições livres e diferenciá-las em cardiomiócitos por meio de um método baseado na agregação de corpos embrionários.