Name: Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Aprenda a diferenciar cardiomiócitos humanos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em condições livres de feeder. Este protocolo utiliza corpos embrionários para gerar células cardíacas funcionais para pesquisa cardiovascular.

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BS foi apoiado pela Universidade de Milão-Bicocca Verão Student programa de investigação, a investigação contou com o apoio de fundos do Ministério italiano da Saúde e Ministério da Educação italiano, Universidade e Pesquisa e Fondazione Humanitas para GC; que graças Michael VG Latronico para ler criticamente a manuscrito.

1. Manutenção Feeder livre e Passaging de linhagens de células iPS humanas <ol><li> Preparar os pratos Matrigel revestidos. Descongelar um frasco de Matriz CES qualificado humano em gelo durante uma hora e dilua em 25 ml de meio DMEM-F12. Adicionar 1 ml de cada uma das placas 35 mm (ou quantidades equivalentes por unidade de área de superfície, se são utilizados outros pratos), mantendo-se tudo em gelo e assegurando que todas as placas e tubos são pré-arrefecida. Cubra as placas com papel alumínio. </li></ol> Nota: As concentrações variam de acordo com imagens de Matrigel do lote. Instruções de diluição são indicados na folha de dados. <ol start="2"><li> Manter as placas em gelo durante a noite e remover o gelo no dia seguinte. As placas podem ser mantidas no frigorífico até uma semana antes da utilização. </li><li> Preparar o meio completo mTESR1 (ou descongelar um frasco de meio de Nutristem) e o H-ESM (médio CES humana), de acordo com a tabela abaixo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> CONC FINAL </td><td> Por 500 ml </td></tr><tr><td> Knockout Serum Replacement (KSR) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Não essenciais MEM aminoácidos </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> 100 U / mL - 0,1 mg / mL </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 0,1 mM </td><td> 900 mL </td></tr><tr><td> B27 Suplemento - sem Vitamina </td><td> 1% </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> N2 Supplement </td><td> 1% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> Banco de meio pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais de 2 semanas. Para preparar o meio de crescimento completo, o FGF básico é adicionado imediatamente antes da suaalimentação e numa concentração final de 20 ng / ml. </li></ol> Nota: Complete H-ESM condicionado em fibroblastos de rato embrionárias podem ser usados ​​em vez de mTESR1 ou Nutristem para as células iPS. <ol start="4"><li> Colocar as placas revestidas em uma incubadora a 37 ° C durante 30 minutos a 2 horas antes da passaging. </li><li> As células devem ser passadas aproximadamente a cada 5 dias, ainda que não tenham atingido a confluência. Colônias não devem tocar. </li><li> Substituir o meio de crescimento com 1 ml de dispase (1 mg / ml, dissolver de um mg / ml de stock 10 em PBS). </li><li> Remover diferenciar áreas com puxados pipetas Pasteur de vidro. As áreas que devem ser removidos incluem estruturas em cratera cística ou no centro de colónias, e quaisquer áreas onde as células foram separadas a partir de colónias e achatada e parecem estar a migrar para fora. </li><li> Incubar a 37 ° C, sob uma capa de cultura até as fronteiras de colónias tornam-se mais brilhante e começar a separar (normalmente cerca de 5-7 minutos). Discard dispase. Lavar com 1 ml H-ESM e descartar. </li><li> Em 1 ml H-ESM, use um levantador de celular (espátula como raspador) para colônias de colheita e recolher em um tubo Eppendorf de 15 ml. Lavar com 1 ml de H-AGE e adicionar ao tubo. Girar a 1,000 rcf durante 4 min e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de crescimento pré-aquecido (ou mTESR1 ou Nutristem). Evite quebrar pedaços muito - pipeta cima e para baixo, com menos de 6-8x. Determine quantas células deve ser banhado e remover as células desnecessárias (geralmente 1:04 ou 1:05 diluição), por exemplo, para duas placas de 1:5, remover 600 mL, em seguida, adicionar 1,6 ml de meio fresco. </li><li> Remover Matrigel a partir de placas. Células lugar gota a gota, distribuindo uniformemente sobre a placa. Evite apertar o tubo em excesso, pois isso fará com que as células a se mover em direção ao centro. </li><li> Lave tubo com 1 ml de meio e dividir entre as placas. O volume final em cada uma das placas deve ser de 1,5 -2 mL. </li><li> Alterar meio todos os dias, exceto no dia seguinte passaging. Embora sejaideal para mudar o meio de todos os dias, isso pode ser mudado ocasionalmente com uma freqüência de uma vez a cada dois dias, se não mais de 2-3 dias se passaram desde a última passagem sem afetar o potencial de pluripotência e diferenciação. </li><li> Se a linha de célula deve ser congelado, voltar a suspender em vez em 1-2 ml de meio de congelação mFreSR usando uma pipeta de 2 ml e colocar 1 ml / cryovial. Colocar os frascos num cryobox a -80 ° C e a transferência de azoto líquido em 3-4 dias. </li></ol> Nota: microdissecção manual de células iPS deve ser realizada sob um microscópio estereoscópico. A fertilização in vitro (FIV) da estação de trabalho (por exemplo uma estação de trabalho de FIV KSystem) integrado com um estereomicroscópio permite a manipulação das células em condições estéreis, enquanto que eles são mantidos em uma área de superfície aquecida. Se este não está disponível, um estereomicroscópio pode ser transportada sob uma capa habitual de fluxo laminar. 2. Embryoid Corpos Agregação e Cardiac Induction <ol><li> Prepara EBM-20 meio de acordo com a tabela abaixo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> CONC FINAL </td><td> Por 500 ml </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino (origem América do Sul) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Aminoácidos não essenciais MEM </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicilina - estreptomicina </td><td> 100U/ml - 0,1 mg / mL </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 50um </td><td> 450 mL </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Utilização de FBS da América do Sul origem é crítico para a determinação da eficiência de diferenciação: o emprego de outros tipos de soros podem afectaro processo de diferenciação. Para preparar EBM-20, ácido ascórbico complemento completo (AA), a uma concentração final de 50 ug / ml. Meio de crescimento completo pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais do que uma semana. </li><li> Colheita iPS colónias tal como descrito acima (etapas 1,6-1,9). </li><li> Ressuspender suavemente em 1 ml de EBM-20 com uma pipeta de 2 ml. Evite quebrar pedaços muito - pipeta cima e para baixo, não mais do que 2 a 3 vezes, verificar o tamanho das colônias sob o microscópio estereoscópico. Placa em placas ultra-baixas de fixação na proporção de 1:1 (por exemplo, por um prato de 35 mm, utilizar um poço de uma placa de 6 poços). Enxaguar tubo com 1 mL de EBM-20 e adicionar ao prato. </li></ol> Nota: O tamanho das colónias de afectar o processo de diferenciação, controlar a eficiência e tempo de indução cardíaca. Agregação de homogeneamente médias EB foram mostrados para reduzir a variabilidade observada durante a diferenciação. <ol start="4"><li> No dia 3, alterar EBM-20 uma vez usando um microscópio para evitar removal da EBS. Mantenha pipeta junto da borda do prato e retire médio. </li><li> Nos dias 7, interruptor EBS para placas revestidas com gelatina a 0,1% e previamente colocada a 37 ° C durante 30 min. Se necessário, a gelatina pode ser removido e as placas deixada sob um capuz de cultura de células S / N. Adicionar 35-40 EBs por 35 milímetros prato. </li><li> Verifique EBs para bater áreas e mudança EBM-20 duas vezes por semana. Marque áreas onde batendo estão localizados na parte superior da tampa do prato, para facilitar a localização em que o microscópio estereoscópico. Áreas contratantes deve aparecer após cerca de 10-20 dias. </li><li> Quando as áreas com contração espontânea aparecer, mude de médio a EBM-2 (como preparar EBM-20, com 2% de FBS vez) e isolá-los, conforme descrito abaixo na seção 3. </li><li> Continue a verificar outras áreas para bater e mudar média duas vezes por semana até áreas batendo são necessários para novas experiências. </li></ol> Nota: A eficiência do processo de diferenciação é altamente dependentevários factores, o mais importante dos quais são as linhas de células específicas e o lote de soro usado para induzir a diferenciação cardíaca. Para se obter a máxima eficiência, as linhas celulares de teste para potencial cardiomiogênica e vários lotes de soro. 3. Batendo áreas de isolamento e Cultura <ol><li> Casaco placas de 12 poços (4 cm 2 de área) ou as placas de interesse com 5 ug / cm 2, fibronectina diluída em PBS para perfazer o volume suficiente para cobrir toda a superfície completamente (total de 300 ul por poço em placas de 12 poços). Mantenha descoberto na capa de cultura de células e deixe secar. As placas podem ser embalados e armazenados a 4 ° CO / N. </li><li> Remover área utilizando um copo de bater puxado pipeta Pasteur e bisturi, conforme necessário. Transfira para placas revestidas com fibronectina com um pipeta de 1 ml. </li><li> Adicionar 1 mL de EBM-2. </li><li> Atravessar fora da placa para indicar as áreas onde as células foram removidas e mudar o meio. As placas podem ser mantidos por até 1 mês, como outras áreas podem começar bcomer mais tarde. </li></ol> Nota: Se forem necessários pedaços menores batendo, pipetar a área explantada cima e para baixo várias vezes sob a lupa, até que quebre em pedaços menores. Isto irá resultar em aglomerados de algumas células batimento (ver o filme 3). <ol start="5"><li> Mudar meio duas vezes por semana até que esteja pronto para as análises. </li></ol> Nota: Os cardiomiócitos obtidos com este protocolo, possuem características morfológicas e funcionais semelhantes fetal; maturação para um adulto fenótipo semelhante pode ser obtido através do aumento do tempo em cultura para diferenciar ainda mais essas células. 4. Único batendo celas de isolamento e Análise <ol><li> Casaco lâminas 2-câmara (4 cm 2 de área) ou outros suportes apropriados, com 5 ug / cm 2 fibronectina diluído em PBS suficiente para cobrir toda a superfície de cultura. Se for usado um suporte de vidro, revestimento com laminina e fibronectina (5 ug / cm &lt;sup&gt; 2 cada). </li><li> Remover área batendo com uma pipeta de Pasteur / bisturi a partir das placas da secção 3. </li><li> Utilizando uma pipeta de 1 ml, transferir as células para um tubo de 15 ml contendo 500 ul de colagenase II (480 U / ml em PBS com Ca e Mg) e incubar 15 min a 37 ° C, agitando o tubo, uma vez durante a incubação. </li><li> Pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 200 mL. Se qualquer aglomerados permanecer, a transferência para novo colagenase II e repita o passo 4.3. </li><li> Repita o passo 4.4 até que não haja grandes aglomerações são deixados. </li><li> Inativar colagenase com 3 ml de EBM-2 (sem AA). O tubo pode ser deixado sob o capô em um rack aquecida até outros tubos estão prontos. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (diluído a partir de um estoque a 0,5% em PBS 1X) e incubar a 37 ° C durante 5 min. Combinar as fracções a partir de digestões com a mesma amostra inicial. </li><li> Inativar tripsina com 4 ml de EBM-2 (sem AA). Passe as células através de uma agulha de 18G em uma seringa de 2,5 ml não mais than 7x. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de EBM-2 por poço e a placa. As células podem ser usadas para análises funcionais e morfológicas de 2-3 dias após o plaqueamento. </li></ol>

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</ol>

Não há interesses financeiros para divulgar.

As células estaminais pluripotentes têm o potencial para se diferenciar espontaneamente em CMs, embora com eficiência baixa e alta variabilidade entre linhas. O desenvolvimento de novos métodos de indução tem, portanto, destinado a melhorar a eficiência do processo e movendo-se para mais protocolos definidos. No entanto, a maioria destes novos métodos de diferenciação são bastante complexas, exigindo condições de elaborar a cultura, um bom controle de tempo e concentração de reagentes e tratamento com citocinas caros e ...

Historicamente, a investigação dos mecanismos genéticos e moleculares de promoção do desenvolvimento humano e da doença tem sido baseados na geração de modelos animais geneticamente modificados. No entanto, vários fenótipos humanos não ser replicado com sucesso em ratos, principalmente por causa das diferenças biológicas existentes entre as duas espécies. Por outro lado, o acesso aos tecidos humanos podem ser limitados e muitas vezes não o suficiente para permitir que o material seja obtido em estudos experimentais em profundidade. O campo da biologia cardiovascular sofre de ambas as seguintes limitações: a fisiologia do coração humano é significativamente diferente da do rato, e uma quantidade significativa de tecido do coração é acessível apenas post-mortem ou durante a cirurgia cardíaca. Encontrar uma fonte ideal para a diferenciação funcional CMs humana tornou-se assim um tópico central na biologia cardiovascular, e tem sido feito muito esforço para resolver este problema. Têm sido propostos vários tipos de células, imioblastos esqueléticos ncluding, células cardíacas locais estaminais, células mononucleares de medula óssea, células progenitoras endoteliais, e de células estaminais mesenquimais. No entanto, os dados obtidos usando estas células não foram consistentes 4. A derivação de células estaminais embrionárias humanas (ESC) 5 primeiros ea descoberta inovadora de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) por Yamanaka e Thomson 6,7 tarde parecia fornecer soluções: estas células têm a capacidade de crescer indefinidamente e o potencial para dar subir a todos os derivados de células de as três camadas germinais, incluindo o MC. A utilização de células iPS oferece ainda outras vantagens: sendo derivadas de células adultas autólogas, que carregam o mesmo genoma que o indivíduo ou paciente a partir do qual eles são derivados. Por conseguinte, permitem o desenvolvimento de modelos in vitro que facilitam a investigação de doenças e dos mecanismos de desenvolvimento genéticas humanas. Em virtude dessa característica, as células iPS também pode overcome problemas relacionados à rejeição imunológica e questões éticas 8. Por estas razões, embora CES ainda representam o padrão ouro no campo da biologia de células-tronco, pesquisadores do mundo inteiro estão agora movendo-se mais para a tecnologia de células iPS. iPS estão agora a ser utilizados para modelar doenças humanas in vitro para várias condições, incluindo desordens cardiovasculares congénitos 9,10. Recentemente, a aplicação da modelagem de doença das células iPS foi realizado para doenças cardíacas monogênicas (ou seja, longos síndromes do QT, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgico) e patologias em que os defeitos cardíacos fazem parte de um fenótipo complexo (ie Leopard e síndromes Timóteo, cardiomiopatia dilatada). Estes relatórios confirmaram que as células iPS específicas do paciente, que são diferenciadas em CMs apresentam características fenotípicas e funcionais semelhantes como a doença in vivo. No entanto, existemainda muitos desafios para melhorar a eficácia de induzir as células iPS na linhagem cardíaca. Geração espontânea de CMs do CES humanos através de formação de agregados chamados corpos embrióides (EBS) provaram 17 bem-sucedida. Desde esta descoberta, têm sido propostos muitos outros métodos. Muitos grupos têm melhorado muito a eficiência do protocolo de diferenciação e deslocaram-se para os reagentes cultura quimicamente definidos e produtos de origem animal-free (veja Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) para uma revisão completa de todos os métodos existentes 3 ). No entanto, o método clássico baseado na EB agregação ainda representa o mais comumente empregado para a realização de estudos funcionais e investigar os mecanismos da doença. Nosso protocolo proposto é baseado na agregação de células iPS em EB e da cultura, na presença de soro e de ácido ascórbico, a qual foi mostrada para aumentar o processo de diferenciação cardíaca e positively impactar a maturação destas células 18,19. Neste artigo, vamos passar por essa metodologia em detalhe e vai mostrar como usar linhas de células iPS alimentador livres para gerar paciente específico CMs iPS derivadas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Media and Reagents</td></tr><tr><td>Human ESC qualified Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Descongele o frasco de 5 ml a 4 &graus; C sobre gelo O/N, alíquota em tubos criogênicos pré-resfriados sobre gelo, de acordo com as instruções de diluição da folha de dados e armazenar a -20 &graus; C .</td></tr><tr><td>Fibronectina, de plasma humano, solução a 0,1%</td><td>Sigma</td><td>F0896-2MG</td><td>Concentração de trabalho: 5 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>Concentração de trabalho: 5 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>PBS (sem Mg e Ca), 10X</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS (com Mg e Ca), 10X</td><td>Bio Sera</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, protease neutra, grau II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Estoque: 10 mg/ml em DMEM-F12 a -20 &deg; C, solução de trabalho: 1 mg/ml em PBS (sem Mg/Ca)</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA, 0,5%</td> <td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo 2</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td>Diluir a 480 U/ml (por exemplo</> 1,6 mg/ml) em PBS com Mg e Ca</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout</td><td>DMEM Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Substituição (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Descongelamento a 4 &graus; C, alíquota e armazene a -20 & C</td></tr><tr><td>F&#8211; tal Soro Bovino (origem América do Sul)</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>Os lotes devem ser testados quanto ao seu potencial cardiogênico. Descongele aos 4 graus; C, inativar o calor a 56 &graus; C por 30 min, alíquota e armazenar a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>PenStrep, penicilina-estreptomicina, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA, suplemento 100X</td><td>Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>N2, suplemento 100X</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapt&#8211; thanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina, de pele suína</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Faça estoque a 1% em água, armazene a -20 &deg;C. Dilua a 0,1% em PBS e mantenha a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td>Combine o suplemento 5X com o meio básico, alíquota e armazene a -20 °C. Não mantenha o meio completo em 4 graus; C por mais de 1 semana</td></tr><tr><td>Nutristem hESC XF</td><td>Stemgent da Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>Descongelar a 4 &deg; C O / N, alíquota e armazene a -20 &deg; C até o uso. As alíquotas podem ser mantidas em 4 &deg; C por não mais de uma semana.</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>Prepare estoques a 10 mg/ml em água. Armazene alíquotas em -20 &deg; C no escuro. Adicione à EBM na concentração final (500X)</td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>35 mm</td> placas de cultura <td>Becton Dickinson</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 12 poços</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Permanox 2 poços lâminas de câmara</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de câmara de vidro de 2 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços, superfície de fixação ultrabaixa</td><td>Corning Incorporated</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de 18 G</td><td>Pipetas Becton Dickinson</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur de vidro, 230 mm</td><td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 2,5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamentos</td></tr><tr><td>IVF Estação de trabalho</td><td>KSystem, por Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ1500 Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de cardiomiócitos humanos: um protocolo de diferenciação de feeder livres humanos células-tronco pluripotentes induzidas

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

A fim de investigar os eventos de promoção do desenvolvimento do coração e para determinar os mecanismos moleculares que conduzem a doenças do miocárdio em seres humanos, é necessário, antes de gerar cardiomiócitos humanos funcionais (CMS). A utilização destas células na descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia é também altamente benéfico, permitindo novas moléculas farmacológicas para o tratamento de desordens cardíacas a ser pré-clinicamente validado em células de origem humana. Dos possíveis fontes de CMS, células estaminais pluripotentes induzidas (iPS) estão entre os mais promissores, como elas podem ser derivadas directamente a partir de tecido do paciente facilmente acessíveis e possuir uma capacidade intrínseca para dar origem a todos os tipos de células do corpo 1. Foram propostos vários métodos para diferenciar as células iPS em CMs, desde os corpos embrióides clássicos (EBS) abordagem de agregação de protocolos de constituição química definida 2,3. Neste artigo, propomos um protocolo baseado em EBs e mostrar como este metodod podem ser empregues para gerar eficientemente células CM-funcionais, como a partir de células iPS alimentador livres.

Em nossos estudos geramos CMs de várias linhagens de células iPS. Estas linhas foram geradas inicialmente numa camada alimentadora MEF mas foram imediatamente colocadas em Matrigel utilizando um meio quimicamente definido (ou mTESR1 ou Nutristem). Vários ensaios foram usados ​​para verificar a manutenção das propriedades morfológicas, a expressão de marcadores típicos de células pluripotentes (OCT-4, e SSEA4 TRA1-60) e à sua estabilidade do genoma (figura 1). Indução na linh...

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar cardiomiócitos humanos a partir de células IPS humanas cultivadas em condições livres de camada de sustentação. Isso é realizado primeiramente semeando as células IPS em placas de aderência ultra baixa para formar corpos embrioides. O segundo passo do procedimento consiste em transferir os corpos embrioides formados para placas recobertas com gelatina.Quando aparecem áreas contráteis, essas são dissecadas manualmente sob microscópio estereoscópico e semeadas em placas revestidas com fibronectina. Para diferenciação adicional, o passo final consiste em obter cardiomiócitos isolados mediante digestão enzimática de agregados contráteis. Em última análise, os resultados podem demonstrar a diferenciação de células semelhantes a cardiomiócitos que expressam marcadores estruturais típicos, isto é, troponina cardíaca, por meio de microscopia de imunofluorescência.Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental na área da biologia cardiovascular, como, por exemplo, quais são os mecanismos que impulsionam a diferenciação e disfunção cardíacas durante o desenvolvimento cardíaco e as doenças ao nível do cardiomiócito humano. Esta é

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Aqui, descrevemos um protocolo robusto para derivação de cardiomiócitos humanos que combina diferenciação cardíaca modulada por pequenas moléculas e purificação de cardiomiócitos mediada por privação de glicose, permitindo a produção de cardiomiócitos purificados para fins de modelagem de doenças cardiovasculares e triagem de drogas.

Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome

A geração de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes in vitro permite o acesso a grandes quantidades de tecido cardíaco in vitro para ciência básica e aplicações clínicas.  Este protocolo utiliza o fator atrializante Grem2 tanto para aumentar o número de cardiomiócitos obtidos quanto para gerar cardiomiócitos com fenótipo atrial.

Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2

Aqui, apresentamos um protocolo robusto, rápido e escalável de diferenciação de cardiomiócitos para células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Os cardiomiócitos derivados usando este método em larga escala podem fornecer números de células suficientes para seu uso efetivo na modelagem de doenças cardiovasculares humanas, triagem de medicamentos de alto rendimento e aplicações potencialmente clínicas.

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

A caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC-CMs) é crucial para a modelagem de doenças cardíacas e para a determinação de respostas de fármacos. Este protocolo fornece as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em matrizes de múltiplos eléctrodos, medir o seu potencial de campo e um método para analisar os intervalos QT e RR.

Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Aqui nós descrevemos um método dimensionável, usando uma simples combinação de Activin A e mediada por lentivirus Id1-superexpressão, para gerar a primeiras progenitores cardíaca como campo de coração e cardiomyocytes ventricular, como de células estaminais pluripotentes humanas.

Geração do primeiro coração campo-como progenitores cardíaca e Cardiomyocytes Ventricular, como de células-tronco pluripotentes humanas

Este artigo contem um jogo dos protocolos para o desenvolvimento de redes pluripotentes induzidas humanas do cardiomiócito (hipsc-cm) cultivadas em placas de de mea para electroporate reversivelmente a membrana de pilha para medidas do potencial da ação. Gravações de alta taxa de transferência são obtidas dos mesmos sites de célula repetidamente ao longo dos dias.

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e expandir robustamente os cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente.

Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente

Aprenda a diferenciar cardiomiócitos humanos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em condições livres de feeder. Este protocolo utiliza corpos embrionários para gerar células cardíacas funcionais para pesquisa cardiovascular.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

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