Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar cardiomiócitos humanos a partir de células IPS humanas cultivadas em condições livres de camada de sustentação. Isso é realizado primeiramente semeando as células IPS em placas de aderência ultra baixa para formar corpos embrioides. O segundo passo do procedimento consiste em transferir os corpos embrioides formados para placas recobertas com gelatina.

Quando aparecem áreas contráteis, essas são dissecadas manualmente sob microscópio estereoscópico e semeadas em placas revestidas com fibronectina. Para diferenciação adicional, o passo final consiste em obter cardiomiócitos isolados mediante digestão enzimática de agregados contráteis. Em última análise, os resultados podem demonstrar a diferenciação de células semelhantes a cardiomiócitos que expressam marcadores estruturais típicos, isto é, troponina cardíaca, por meio de microscopia de imunofluorescência.

Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental na área da biologia cardiovascular, como, por exemplo, quais são os mecanismos que impulsionam a diferenciação e disfunção cardíacas durante o desenvolvimento cardíaco e as doenças ao nível do cardiomiócito humano. Esta é uma técnica muito interessante porque permite a geração de cardiomiócitos in vitro a partir de pacientes humanos e indivíduos humanos. E, em segundo lugar, permite a recapitulação da doença no tubo de ensaio, de modo que novas drogas possam ser testadas in vitro antes de avançar para estudos in vivo.

Experimentação Inicie com culturas confluentes de células IPS cultivadas em placas de 35 milímetros revestidas com Matrigel. Substitua o meio de crescimento por um mililitro de PBS contendo um miligrama de diss. Examine as células utilizando pipetas de vidro polidas.

Remova regiões com células diferenciadas, como estruturas em forma de cratera ou císticas no centro das colônias. Remova também quaisquer áreas onde as células tenham se separado, achatado e pareçam estar migrando para fora. Incube agora as células restantes a 37 graus Celsius sob capela de cultura até que as bordas das colônias fiquem mais brilhantes e comecem a se desprender.

Isso geralmente leva entre cinco e sete minutos. Neste ponto, remova a solução dispa e lave as células com um mililitro de HESM. Em seguida, descarte a solução de lavagem.

Em um novo mililitro de HESM, use um levantador de células para colher as colônias. Recolha as colônias em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, enxágue as células com outro mililitro de HESM e centrifugue-as a 1000 ×g por quatro minutos.

Em seguida, prossiga com o plaqueamento das células em matrigel e troque o meio diariamente durante o cultivo. Comece colhendo colônias de IPS indiferenciadas conforme descrito na seção anterior. Uma vez que as populações indiferenciadas tenham sido isoladas, suspenda-as suavemente em um mililitro de EBM 20.

Usando uma pipeta de dois mililitros, não desagregar muito os aglomerados celulares. Limite a pipetagem a duas ou três movimentações. Verifique o tamanho das colônias sob o estereoscópio entre as movimentações.

Quando as colônias tiverem todas aproximadamente o mesmo tamanho, não precisam de mais mistura. Agora plaque as células em placas de adesão ultra baixa, preenchendo uma placa de seis poços para cada placa de células colhidas. Não se esqueça de enxaguar o tubo com um mililitro de EBM 20 e distribuir o enxágue pela placa.

Após o terceiro dia de incubação, troque o meio utilizando um microscópio para evitar a remoção dos corpos embrionários. Mantenha a pipeta próxima à borda da placa. No sétimo dia, transfira os corpos embrionários para placas recobertas com gelatina a 0,1%, aquecidas a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Adicione 35 a 40 corpos embrionários a cada placa de 35 milímetros em dois mililitros de meio. Durante o cultivo, troque o meio duas vezes por semana regularmente.

Verifique os corpos embrionários em busca de áreas com batimento e marque onde estão localizadas as áreas pulsantes. Na superfície da tampa da placa, áreas contráteis devem surgir após aproximadamente 10 a 20 dias. Quando aparecerem áreas com contração espontânea, troque o meio para EBM dois. Após o surgimento das áreas contráteis, continue o cultivo e a monitorização de outras áreas da placa por até um mês.

No total. No EBM, a deficiência do processo de diferenciação depende fortemente de vários fatores, sendo os mais críticos as linhagens celulares específicas e o lote de soro utilizado para induzir a diferenciação cardíaca. Para obter a maior eficiência, teste várias linhagens quanto ao potencial cardiogênico e diversos lotes de soro. Comece revestindo 12.

Placas com 5 microgramas por centímetro quadrado de fibronectina em PBS, 300 microlitros por poço, devem cobrir completamente a superfície de cada poço. Deixe as placas secarem descobertas em uma cabine de cultura celular. Para remover a área de agregação da cultura celular, utilize uma pipeta de vidro puxada e um bisturi.

Em seguida, utilizando uma pipeta de um mililitro, transfira quatro a cinco grampos para cada poço de uma placa revestida com fibronectina. Após concluídas todas as coletas, adicione um mililitro de EBM dois aos poços carregados na placa, marcando as áreas de onde as células foram removidas. Em seguida, troque o meio e retorne a placa para a câmara de cultura.

Se forem necessários aglomerados menores com batimento sob microscópio estereoscópico, passe as áreas explantadas através de uma pipeta. Isso produz pequenos agregados contendo algumas células em batimento. Em cultura.

Altere o meio duas vezes por semana até que estejam prontos para análise. Primeiro, prepare lâminas com duas câmaras quadradas de quatro centímetros de lado revestindo-as com 20 microgramas de fibronectina diluídos em quantidade suficiente de PBS para cobrir a superfície. Se um suporte de vidro for utilizado, adicione mais 20 microgramas de laminina.

Isole a área de cultivo com as esferas conforme descrito anteriormente. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira as células para um tubo de 15 mililitros contendo 500 microlitros de tubo de colagenase. Incube as células por 15 minutos e agite o tubo uma vez durante a incubação.

Após 15 minutos, passe as células por uma pipeta de 200 microlitros para remover agregados, caso ainda existam. Transfira as células para colagenase dois fresco e repita a incubação quando não restarem grandes agregados. Encerre a digestão adicionando três mililitros de EBM dois sem ácido ascórbico, conforme cada um for preparado.

Armazene os tubos em uma grade aquecida sob a capela e, em seguida, centrifugue-os a 1000 vezes G durante quatro minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, prepare uma suspensão das frações celulares da mesma amostra inicial em um mililitro de tripsina 0,25% EDTA em PBS. Incube, então, a suspensão por cinco minutos no bloco aquecido e inative a tripsina com quatro mililitros de E BM dois sem ácido ascórbico.

Em seguida, passe as células por uma agulha de 18 gauge em uma seringa de 2,5 mililitros até sete vezes, até que nenhum grande agregado seja visível ao microscópio. Em seguida, centrifugue as células a 1000 × g durante quatro minutos. Agora, re-suspenda o pellet celular em E BM dois e plaque-as em lâminas de câmara de dois poços.

As células estarão prontas para análises após dois a três dias de incubação. Os CMS foram gerados a partir de várias linhagens de células IPS. Essas linhagens foram inicialmente geradas em uma camada de alimentadores de metionina e imediatamente transferidas para matrigel utilizando um meio definido.

As células exibiram uma morfologia semelhante à das ESC humanas, com bordas brilhantes em contraste de fase e núcleos proeminentes. A análise por imunofluorescência mostrou que as células iPS expressavam corretamente o fator de transcrição T four e o antígeno de superfície TRA one 60. A análise citofluorométrica confirmou a expressão dos antígenos de superfície típicos de pluripotência, SS EEA four e TRA one 60.

A estratégia de seleção é mostrada no gráfico de dispersão à esquerda. Uma análise de cariótipo das células IP FS cultivadas em gel de matriz também foi realizada. A indução à linhagem cardíaca foi desencadeada pela agregação das células IPS em ebs, juntamente com o cultivo na presença de um tipo específico de soro.

E como as áreas com contração ácido sórbico representavam de 20 a 35% do cultivo total, dependendo da linhagem celular utilizada. CMS com contração foram isoladas dessas regiões por digestão enzimática e analisadas quanto à expressão proteica. A R-T-P-C-R detectou expressão de canais iônicos específicos cardíacos expressos nas células pulsantes derivadas de IPS, mas não nas células não pulsantes.

Esses canais incluíram um alfa um, uma subunidade de um canal de cálcio dependente de voltagem, uma subunidade alfa de um canal de sódio sensível à voltagem do tipo cinco, um canal de potássio sensível à voltagem da subfamília KQT, e ambas as formas da miosina. A análise de imunofluorescência da cadeia pesada revelou que cardiomiócitos derivados de IPS individuais expressavam as proteínas estruturais, actina alfa sarcomérica, troponina I cardíaca e a junção específica cardíaca, conexina 43. Afinal, essa técnica realmente abriu caminho para a modelagem de doenças miocárdicas in vitro e permite a experimentação com fármacos em um contexto humano sem a necessidade de injetar o fármaco nos organismos humanos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manter células iPS em condições livres de soro e de como diferenciá-las em cardiomiócitos por meio de um método baseado na agregação de corpos embrionários.