Тканевая инженерия человеческого 3D В пробирке Опухоль Тестовая система

Общая цель этой процедуры заключается в создании 3D-тест-системы для опухолей с первичными клетками на децеллюляризованном биологическом каркасе. Это достигается путем предварительной подготовки каркаса с использованием процесса децеллюляризации, в котором сегмент свиньи нагнетается раствором для децеллюляризации. Второй шаг заключается в выделении первичных клеток человека из биопсии пациента с использованием стандартного протокола изоляции.

Затем настройте систему тестирования опухолей, разрезав подслизистую оболочку тонкой кишки с одной стороны, зафиксировав ее между двумя металлическими кольцами и засеяв опухолевыми клетками и связанными с ними стромальными клетками в определенной плотности клеток. Последним шагом является культивирование нагруженной клеткой конструкции в подходящей установке в статических или динамических условиях. В конечном счете, иммуногистохимическая микроскопия используется для оценки особенностей роста опухоли.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как системы тестирования опухолей TT, заключается в том, что с помощью этого метода можно создавать 3D-модели тканей, которые имитируют условия опухоли in vivo более точно, чем обычные 2D-модели. Преимущество динамической культуры заключается в том, что сохраняются специфические для клеток характеристики. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии опухолей, например, как раковые клетки формируют взаимодействие клеточных клеток и клеточного матрикса в 3D-среде, что поможет пролить свет на процессы, связанные с раком, такие как прогрессирование опухоли и метастазирование.

Биологический васкуляризированный скаффолд или биова, используемый в этой системе тестирования опухолей, получен из сегмента свиньи jaal. Промывайте сосудистую систему свиного сегмента и просвет кишечника с помощью PBS через канюлированный артериальный доступ. Повторяйте до тех пор, пока он не станет полностью чистым.

Подготовьте стеклянный бак диаметром 200 мм с четырьмя адаптерами и подключите их через силиконовые трубки к перистальтическому насосу. Блок управления давлением можно контролировать с помощью датчика давления, который подключен к стерильному одноразовому куполу. Наполните бутылки резервуара раствором децеллюляризации или ДЗ.

Проверьте систему трубок на наличие пузырьков воздуха. Подсоедините просвет кишечника с помощью кабельных стяжек к стеклянным разъемам для просветного потока. Закачайте 500 миллилитров раствора ДЗ в красный артериальный доступ сосудистой системы.

Прерывайте процесс сцеживания каждые 15 минут на короткое время, чтобы вручную выдавить весь просвет кишечника. Важно следить за давлением буферного раствора в процессе децеллюляризации. Давление должно составлять от 80 до 100 миллиметров ртутного столба, смоделированного по образцу естественного кровяного давления.

Промойте биову PBS до тех пор, пока она не освободится от остатков клеток, а сосудистая структура не станет полностью белого цвета. Начните эту процедуру с разрезания биопсии кожи на полоски шириной два-три миллиметра скальпелем и трижды промыв их раствором PBS. После инкубации ткани с раствором дисбе с помощью двух пинцетов отделите эпидермис от дермы.

Переложите оба по отдельности в чашки Петри, наполненные PBS для выделения первичных клеток дермального микрососудистого эндотелия или полосками для полоски дермы MV eecs После приема ene добавьте 10 миллилитров трипов в растворе ЭДТА в полоски дермы и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут. Остановите ферментативную реакцию с помощью 1% FCS и перенесите полоски кожи в чашку Петри, наполненную vascu life. Соскребите каждую полоску скальпелем по восемь раз с каждой стороны, немного надавливая, чтобы получилась клеточная суспензия.

Затем центрифугируют клеточную суспензию и ресусциацию, суспензируют клеточную гранулу с vascu life. Для выделения фибробластов. Сначала с помощью скальпеля нарежьте полоски дермы на мелкие кусочки.

Переложите кусочки дермы в пробирку Falcon и добавьте 10 миллилитров раствора коллагеназы, инкубированного при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут. Далее центрифугируйте раствор и аккуратно удалите надосадочную жидкость. Промойте гранулу DMEM плюс 10% FCS плюс 1% стрептококк.

После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в питательной среде и переложите в колбу для культуры T 75, чтобы позволить клеткам вырасти из инкубации ткани в статических условиях. Чтобы настроить систему тестирования опухолей, сначала разрежьте канальцевую подслизистую оболочку тонкой кишки или слизистую оболочку SIS, раскройте с одной стороны и зафиксируйте ее между двумя металлическими кольцами. Эти самоконструируемые клеточные коронки имеют диаметр 10 миллиметров.

Покройте SIS mu в среде для культивирования клеток на ночь на следующий день, высейте первичный MVE CS на базальную более позднюю поверхность SIS, бывшую CI. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа в течение трех часов. Через три часа заполните лунку средой, чтобы обеспечить погружение культуры и верните ее в инкубатор. Дайте эндотелиальным клеткам прилипнуть в течение трех дней после трех дней.

Переверните статическую культуральную систему на 180 градусов и переложите ее в 12-луночный планшет. Далее посмотрите на смесь первичных дермальных фибробластов и опухолевых клеток на апикальной поверхности СИС. Сторона прежнего просвета.

Дайте клеткам прилипнуть в течение трех часов. Заполните лунку средой для погружения культуральной культуры, тест-системы опухоли в статических условиях при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа еще на 14 дней, меняя питательную среду каждые два-три дня для динамической культуры. Закрепите SIS mu между двумя металлическими кольцами и затравкой первичной MV eecs, как было показано ранее.

Через три дня извлеките SIS mu из металлических колец и вставьте мембрану в проточный реактор с помощью шприца и канюли. Нанесите первичные дермальные фибробласты и опухолевые клетки на матрикс в биореакторе. Дайте клеткам прилипнуть в течение трех часов, прежде чем на следующий день заполнить систему биореактора питательной средой, поместите биореактор в самостоятельно сконструированную систему инкубатора и подключите его к перистальтическому насосу.

Такая конфигурация позволяет проводить динамическую культуру либо с регулируемым давлением, либо с постоянным потоком. В этом эксперименте используется постоянный поток среды в 3,8 миллилитра в минуту. Сохраняйте динамическую культуру в течение 14 дней, меняя питательную среду через семь дней.

По завершении экспериментов ткани фиксируются, парафинируются, встраиваются и окрашиваются, а затем визуализируются с помощью инверсионного микроскопа. Репрезентативные результаты приведены здесь. На панели А представлен обзор статически культивируемой линии опухолевых клеток S 4 62 в 2D монокультуре, окрашенной гемат толином.

3D-кокультура показана на панелях B, C и D. На этом окрашенном изображении H и e показана тройная культура опухолевых клеток S 4 62 и первичных фибробластов на апикальной стороне SIS MU и MVEC. На базальной боковой стороне стрелками отмечены эндотелиальные клетки. Различные типы клеток могут быть идентифицированы путем окрашивания специфичных для типа клеток маркеров, таких как фактор фон Виллебранда, для маркировки MVEC, показанного на панели C, и P 53, показанного на панели D. P 53 положительные S 4 62 клетки могут быть отделены от P 53 негативных первичных фибробластов, и трехмерное распределение клеток может быть проанализировано таким же образом.

Различные типы клеток могут быть идентифицированы на динамически культивируемой панели тройной культуры A представляет собой окрашенное изображение H и E, где стрелками отмечены эндотелиальные клетки. На панели B показано иммуногистологическое окрашивание на фактор фон Виллебранда, а на панели C показано окрашивание на P 53 после этой процедуры. Другие методы, такие как тесты на наркотики, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как поиск новых методов лечения рака или анализ важных сигнальных путей в опухолевом генезе.

Кроме того, первичные клетки могут быть использованы для определения наилучшего персонализированного лечения для отдельных пациентов.