Инженерная Трехмерные эпителиальной ткани Встроенные в внеклеточной матрицы

Целью этой процедуры является создание идентичных трехмерных тканей, встроенных в коллагеновый гель, для использования во многих экспериментальных контекстах, таких как определение влияния механического напряжения на разветвленный морфогенез. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы морфогенеза тканей, такие как определение основных механизмов коллективного поведения клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что геометрия искусственных тканей контролируется и воспроизводима, что позволяет точно манипулировать и измерять физические и биохимические факторы.

Таким образом, размер выборки достаточно велик, чтобы можно было делать выводы с высокой статистической достоверностью. Начните с подготовки мастер-кремниевого кремния, фотоструктурированного с помощью желаемого массива с использованием стандартных методов фотолитографии. Узор, используемый в этом видео, состоит из прямоугольных структур, расположенных на расстоянии 200 микрон друг от друга.

Затем смешайте 50 граммов PDMS, смешав преполимер и отвердитель в одноразовой посуде в соотношении 10:1. Затем поместите смесь под вакуум на 15-30 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые были введены в процессе смешивания. Поместите силиконовую текстурированную сторону вверх в пластиковую лодку для взвешивания и вылейте дегазированный раствор PDMS на верхнюю часть формы.

Затем поставьте блюдо в духовку и высушите PDMS при температуре 60 градусов Цельсия в течение 12 часов. После отверждения извлеките PDMS и мастер из пластикового контейнера. Осторожно отделите PDMS от кремниевой пластины.

Затем с помощью чистого бритвенного лезвия удалите излишки PDMS вокруг отпечатанных элементов. Теперь с помощью лезвия бритвы разрежьте узорчатый PDMS на отдельные прямоугольные штампы. Храните эти штампы лицевой стороной вверх в чистой чашке Петри диаметром 100 миллиметров.

Затем приготовьте свежую партию дегазированного раствора PDMS, используя то же соотношение преполимера и отвердителя 10:1. Нанесите два-три грамма этого раствора на чашку Петри диаметром 100 миллиметров, а затем высушите PDMS в течение 12 часов при температуре 60 градусов Цельсия. Затем с помощью лезвия бритвы разрежьте тонкий слой PDMS на прямоугольники, которые будут использоваться в качестве подложек для марок.

Для каждого штампа необходимо по две опоры. После того, как все опоры будут разрезаны, простерилизуйте штампы и подложки PDMS, погрузив их в 70% этанол и высушив с помощью аспиратора в шкафу биобезопасности. В шкафу биобезопасности добавьте 50 микролитров 1% BSA в PBS в верхнюю часть каждой марки.

Поместите покрытые каплями штампы при температуре четыре градуса Цельсия минимум на четыре часа, чтобы убедиться, что BSA впитается в поверхность штампа. Затем верните штампы в шкаф биобезопасности и отсасывайте раствор BSA из штампов PDMS. Далее дважды промойте поверхности штампов 50 микролитрами среды для клеточных культур.

Отсасывайте среду после каждого мытья. Выложите по одной чашке для культуры тканей диаметром 35 мм для каждого штампа PDMS. В каждую посуду уложите две опоры PDMS, разделенные расстоянием, чуть меньшим, чем длина штампов PDMS.

Затем с помощью пинцета возьмите стеклянные покровные листы диаметром 15 мм и простерилизуйте их с использованием 70% этанола. Отсасывайте лишнюю жидкость из покровных стеблей, удерживая их пинцетом, а затем храните их в отдельной чашке Петри. Затем нанесите 50 микролитров коллагеновой смеси в соотношении четыре миллиграмма на миллилитр непосредственно на каждый штамп, чтобы равномерно покрыть поверхность штампов PDMS.

С помощью пинцета возьмите каждый из покрытых коллагеном штампов PDMS и аккуратно переверните их. Опустите перевернутые штампы коллагеновой стороной вниз поверх опор PDMS в чашках для культуры тканей. Затем инкубируйте посуду при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем нанесите 50 микролитров оставшейся коллагеновой смеси на каждую из круговых покровных стекол и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. На этом этапе соберите интересующий вас тип клеток. Здесь у нас есть эпителиальные клетки молочной железы мышей с EpH4, которые мы суспендировали в концентрации от одного до 10 миллионов клеток на миллилитр.

Теперь извлеките из инкубатора желированные образцы коллагена. С помощью пинцета аккуратно поднимите штампы PDMS прямо вверх, чтобы отделить их от формованного коллагена и выбросить. Важно поднять штамп прямо вверх, чтобы не исказить черты в коллагеновом геле.

Нанесите 30 микролитров концентрированной клеточной суспензии на поверхность каждого коллагенового геля, содержащего формованные полости нужной геометрии. Наблюдайте за клетками под светлопольным микроскопом, осторожно встряхивая чашки из стороны в сторону, чтобы способствовать расселению клеток в полостях. Полости должны быть заполнены в течение пяти минут.

Чтобы удалить лишние клетки вокруг полостей, наклоните каждую чашку для тканевых культур на бок и аккуратно распределите 400 микролитров среды для клеточных культур по поверхности коллагенового геля. Важно осторожно мыть, медленно нанося питательную среду на гель, наклоняя чашку, чтобы удалить любые лишние клетки на поверхности геля и не сместить клетки в полостях геля. Отсадите жидкость и повторите промывку еще дважды.

Проверяйте коллагеновые гели под микроскопом между каждым мытьем, чтобы увидеть, когда лишние клетки были смыты. После того, как избыток клеток будет удален из заполненных клетками полостей, поместите чашки с культурами тканей в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут. Затем с помощью пинцета аккуратно переверните покрытые коллагеном стеклянные защитные стекла и поместите их поверх заполненных клетками коллагеновых форм так, чтобы коллаген из покровного стекла образовал колпачок над заполненными клетками полостями.

Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. После того, как коллагеновые колпачки прилипнут к заполненным клетками коллагеновым формам, медленно распределите от двух до 2 1/2 миллилитров среды для клеточных культур через стеклянную крышку, наносимую поверх гелей, и культивируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-трех дней. Эти изображения получены с малых и больших увеличений матриц, сформированных в коллагеновый гель I типа перед посевом клеток.

Форма лунок определяется формой элементов на кремниевом мастере. Здесь прямоугольные лунки заполнены эпителиальными клетками молочной железы. В этом примере каждая прямоугольная лунка размером 200 на 50 микрон содержит примерно от 80 до 100 ячеек.

Через 24 часа после посева клеток было замечено, что клетки слипаются друг с другом в лунках, образуя ткань. Через 24 часа после добавления фактора роста HGF в культуральную среду ткани подвергаются ветвящему морфогенезу. Одним из белков, участвующих в миграции клеток, является киназа фокальной адгезии, которая, как видно из этого составного изображения, увеличивается на концах лунок, где обычно происходит ветвление.

После освоения этой техники она может быть выполнена в течение двух часов при правильном выполнении. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как микроскопия тракционной силы, ОТ-ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинг, для определения сил, оказываемых клетками во время их миграции, а также изменений в уровнях транскриптов и белков интересующих генов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как настроить эту 3D-модель клеточной культуры, в которой ткани определенной начальной геометрии встроены в коллагеновый гель.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.