As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como adquirir imagens de super-resolução de tempestade de alta qualidade. Isso é feito preparando primeiro uma amostra de teste marcada com fluorescência. O segundo passo é preparar o buffer de comutação e, em seguida, preencher a câmara de imagem com o buffer.

Em seguida, os dados brutos são adquiridos em um microscópio de tempestade. A etapa final é reconstruir imagens de super-resolução a partir de dados brutos usando software de processamento de tempestade. Em última análise, as amostras de teste são usadas para mostrar como adquirir dados brutos de alta qualidade, que podem ser processados para gerar imagens de super-resolução de tempestade em células com resoluções entre 30 e 50 nanômetros, representando um aumento de resolução de cinco a dez vezes em relação às técnicas tradicionais de microscopia de fluorescência, incluindo relva e confocal.

Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque não percebem a importância de coletar muitos links esparsos de alta qualidade. Isso é muito mais fácil usando o corante Alexa 6 4 7 no buffer de comutação correto. Uma demonstração visual dessa técnica é essencial porque a aquisição de dados brutos de alta qualidade é fundamental na produção de imagens de resolução SPR.

As sequências de vídeo brutas dessa técnica parecem completamente diferentes de qualquer outra forma de microscopia de fluorescência. Para iniciar o procedimento de revestimento de vidro com dextrina fluorescente a 200 microlitros de solução de polilisina a 0,01% para cada poço de uma tampa de vidro de oito câmaras e incubar por 10 minutos. Após 10 minutos, remova a solução de polilisina com uma pipeta para garantir que nenhum líquido permaneça diluído.

0,25 microlitros de uma solução estoque de dextrina de dois miligramas por mililitro. Alexa 6 47 em 25 microlitros de água deionizada para criar uma solução de 20 microgramas por mililitro para criar um revestimento de dextrina de alta densidade. Solução Alexa 6 47.

Diluir 20 microlitros da solução de 20 microgramas por mililitro em um total de 200 microlitros de água deionizada. Para uma solução de densidade média, diluir dois microlitros em 200 microlitros de água deionizada. Para uma solução de baixa densidade, diluir 0,2 microlitros.

Em 200 microlitros de água deionizada, adicione 200 microlitros das soluções diluídas de dextrina Alexis X 47 a cada poço e incube por 10 minutos. Tempos de incubação mais longos podem ser usados, o que pode resultar em um revestimento de dextrina mais denso. Por fim, remova as soluções de Dexter Xis X 47 e lave com água três vezes.

Para preparar primeiro filamentos de actina fluorescente em vidro, adicione 200 microlitros de solução de polilisina a 0,01% a cada poço de uma câmara de oito. Cubra o vidro e incube por 10 minutos. Remova com uma pipeta para garantir que nenhum líquido permaneça.

Adicione a cada câmara 90 microlitros de tampão de actina geral previamente reconstituído de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione 10 microlitros de solução de filamento de actina pré-formada de 10 micromolares e um microlitro foid e Alexa 6 47 e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar, incube por 30 minutos em temperatura ambiente para preparar esferas fluorescentes de microesferas como marcadores fiduciais para diluir um microlitro de contas de tepec em 200 microlitros de PBS e misture. Adicione as esferas diluídas na câmara de imagem e aguarde 15 minutos.

Após 15 minutos, remova a solução e lave três vezes com PBS antes de obter imagens das células a cultivadas a aproximadamente 80% de fluência de co são usadas neste experimento. Remova o meio de cultura e lave com PBS. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de formaldeído a 4% por 10 minutos.

Remova o formaldeído e lave três vezes com PBS. Não permita que as células permaneçam secas e sempre use soluções tamponadas com PBS. Para evitar o estresse hipotônico, adicione dois microlitros de uma solução estoque de 50 microgramas por mililitro de EGF Alexa, 6 47 a 200 microlitros de solução de 0,1% BSA e, em seguida, adicione esta solução às células hela.

Incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Remova a solução e lave três vezes com PBS. Adicione uma solução de bloqueio de 0,1% BSA e deixe por 15 minutos em temperatura ambiente.

Depois disso, remova a solução de bloqueio e lave mais três vezes com PBS antes da imagem. Imediatamente antes da imagem, prepare o tampão de comutação misturando a enzima glicose e as soluções de estoque do agente redutor em uma proporção de 50 microlitros, 400 microlitros e 100 microlitros, adicione PBS para perfazer o volume final de um mililitro. Remova o PBS da câmara de imagem e encha até o topo com o buffer de comutação.

Coloque cuidadosamente uma lamínula sobre a parte superior da câmara, certificando-se de que não haja bolhas e que toda a câmara esteja coberta. Se alguma bolha for vista, complete com buffer adicional ou PBS. Caso contrário, o desempenho do buffer pode diminuir.

A coleta de dados de links esparsos e de alta qualidade é essencial para o sucesso deste procedimento, portanto, certifique-se de que os microscópios estejam devidamente focados e que as configurações de aquisição corretas sejam usadas. Localize uma estrutura fluorescente de interesse a ser fotografada. Selecione o ângulo de iluminação desejado.

Nesse caso, recomenda-se um ângulo de grama ou altamente inclinado, pois melhora a relação sinal-ruído, minimizando a luz fora de foco, o que é particularmente benéfico para amostras de células. Tome uma referência à imagem limitada por fração da estrutura antes da imagem da tempestade. Aumente o laser de excitação para uma alta potência correspondente a aproximadamente dois quilowatts por centímetro quadrado durante a geração de imagens com configurações de câmera de exposição de 10 milissegundos e um tempo de ciclo de aproximadamente 50 hertz ou quadros por segundo.

Uma vez que os quatros da flora tenham feito a transição para um padrão de piscar esparso, colete 10.000 quadros. Para começar esta reconstrução. Abra o arquivo RAINSTORM M de dentro do MATLAB e execute-o na janela do rainstorm.

Selecione o arquivo de imagem a ser analisado usando o botão de navegação. Este deve ser um arquivo TIF. Altere a largura do pixel para corresponder aos dados brutos do sistema de microscópio usado para adquirir os dados.

Deixe os outros valores como padrão. Pressione o botão processar imagens e aguarde até que uma imagem preliminar apareça. A duração do processamento dependerá do tamanho do arquivo, da especificação do computador e do número de links candidatos nos dados brutos.

Para gerar uma imagem de super-resolução atualizada, pressione o botão abrir revisor e uma segunda janela aparecerá. Pressione o botão de ajuste de contraste para alterar a exibição da imagem conforme desejado. Em alguns casos em que a imagem é muito escura, o valor máximo deve ser diminuído.

Use a janela do revisor para gerar métricas úteis de qualidade de imagem e refinar ainda mais a imagem de super-resolução. Deixe os três primeiros parâmetros de controle de qualidade com valores padrão de 5.000, 0,1 e 0,8 a 3,5, respectivamente. Atualize as contagens por valor de fóton.

Altere o corte de precisão de localização para compensar entre otimizar a localização média, precisão em relação ao número de localização. Na imagem final, valores de 30 a 50 nanômetros são recomendados, dependendo da qualidade dos dados e da amostra. O padrão do fator de escala de reconstrução é cinco, o que gerará pixels de super-resolução de 32 nanômetros, assumindo que o pixel nas imagens originais seja de 160 nanômetros.

Se as imagens brutas tiverem um tamanho de pixel de 100 nanômetros, isso produzirá imagens de super resolução com pixels de 20 nanômetros. Aumente o fator de escala para produzir pixels de super-resolução menores. Na imagem final, pressione o botão executar revisor para gerar uma imagem de super-resolução atualizada.

Pressione o botão exibir histogramas para exibir métricas de qualidade de imagem. Por fim, pressione o botão salvar imagem no revisor para salvar todos esses dados. Comece este procedimento gerando uma imagem da mesma forma demonstrada anteriormente.

Pressione o botão de rastreamento de caixa no revisor e clique e arraste uma caixa sobre o marcador fiducial na imagem revisada. Aguarde até que uma nova imagem apareça, que exibirá as posições encaixotadas. Salve esta imagem se desejar, se o objeto de interesse for um marcador fiducial.

Como é o caso aqui, execute a correção de desvio clicando no botão definir âncora seguido pelo botão subtrair desvio. Por fim, clique em executar revisor novamente para gerar uma nova imagem de tempestade. Um revestimento bem-sucedido de dextrina deve produzir uma monocamada fluorescente e os dados típicos de dextrina são mostrados nesta figura.

As imagens limitadas por difração mostram diferentes concentrações de dextrina antes da imagem da tempestade. As reconstruções de super resolução têm um tamanho de pixel de 25 nanômetros. 10.000 imagens foram coletadas com um tamanho de quadro de 1 28 por 1 28 pixels e quadros individuais são mostrados a partir dessa sequência.

Em alta concentração de dextrina. A monocamada fluorescente deve parecer relativamente uniforme, conforme ilustrado nestas imagens e neste segmento de vídeo. Em concentrações mais baixas, as piscadas parecerão mais esparsas e em foco.

Sem fundo óbvio durante esta fase de aquisição de imagem em iluminação constante do laser, o número de piscadas diminuirá com o tempo, conforme ilustrado por uma comparação entre o quadro 2000 e o quadro 8.000 na amostra de alta densidade. A principal diferença entre as imagens de super-resolução das concentrações de dextrina alta, média e baixa é a diminuição do número de localizações. Este gráfico mostra uma média de três sequências de 10.000 quadros de cada concentração de dextrina, onde as barras de erro indicam o desvio padrão.

No entanto, essa relação proporcional entre a concentração do número de moléculas fluorescentes nos dados brutos e o número de localizações não é linear simples, conforme ilustrado neste gráfico do número de localizações aceitas por quadro. Usando uma média contínua de 100 quadros em densidades de moléculas muito altas, o software não consegue localizar moléculas com sucesso ao obter imagens de qualquer amostra. Um problema comum pode ser a presença de névoa fluorescente brilhante, mas desfocada, na imagem, causada pela difusão da força do flúor através do meio.

Essas moléculas fluorescentes destacadas podem ser evitadas ou removidas aumentando o número de etapas de lavagem com PBS antes de adicionar o buffer de comutação ou adicionando um novo buffer de comutação ao processamento da câmara e comparando os dados de cada sequência de imagens resulta em imagens de super resolução muito diferentes. Os painéis C e D são construções de imagens de super-resolução correspondentes aos dados coletados nos painéis A e B, respectivamente. Este gráfico representa graficamente o número de localizações aceitas por quadro usando uma média contínua de 100 quadros.

A linha vermelha corresponde à sequência de tempestade A e C onde há um fundo alto, a linha azul corresponde a B e D onde o fundo é baixo. O número de localização aceito para as imagens correspondentes aos dados de fundo alto e baixo é mostrado no segundo gráfico. Essas três imagens limitadas por difração mostram dados típicos de filamentos de actina pré-formados presos à superfície do vidro antes da adição de buffer de comutação e imagens de tempestade.

Comprimentos variáveis de filamentos podem ser vistos. Filamentos muito brilhantes são frequentemente vários filamentos emaranhados. A seleção de filamentos relativamente brilhantes em vez de áreas emaranhadas resulta em imagens de melhor qualidade durante a fase de aquisição.

Piscadas brilhantes em foco devem ser vistas ao longo do comprimento do filamento. Piscadas esparsas devem ser vistas durante a fase de aquisição e, posteriormente, nos dados do processo. Deve haver um filamento fino e contínuo nas localizações por quadro deve mostrar um declínio gradual.

Normalmente, o total com metade do máximo ou FWHM de um filamento é dado como uma estimativa empírica de resolução, desenhando uma linha reta através de uma região ampliada do filamento de actina usando o recurso de perfil de plotagem na imagem J e, posteriormente, realizando um ajuste gaussiano. O FWHM é calculado como 43,2 nanômetros. Um problema de má localização pode ocorrer quando vários filamentos de actina estão se ramificando e/ou se cruzando processando subconjuntos de quadros e comparando o primeiro e os últimos 5.000 quadros.

Uma imagem diferente é produzida na imagem de super-resolução usando os primeiros 5.000 quadros. Muitas localizações são vistas no meio da imagem. No entanto, ao usar os últimos 5.000 quadros, muito poucas dessas localizações são aparentes e apenas os filamentos são deixados, embora um pouco contínuos devido ao baixo número de localizações na imagem.

Se houver suspeita de uma densidade de intermitência muito alta, a comparação das imagens com os dados de localização por quadro pode sugerir fortemente que esse problema está ocorrendo durante o primeiro conjunto de quadros. Há um número médio de localizações por quadro de mais de 10 em comparação com o último conjunto de quadros, onde é aproximadamente quatro. Outro problema potencial na microscopia de tempestade é o desvio, que ocorre quando a amostra se move em relação à lente objetiva Através da fase de aquisição de dados, embora muito difícil de detectar durante a fase de aquisição da imagem, o desvio pode ser detectado nas imagens de super-resolução de estruturas conhecidas, como filamentos de actina.

O primeiro sinal de que a deriva lateral pode ter ocorrido é que a estrutura é maior do que o esperado. Por exemplo, com um full relativamente grande com metade do máximo em comparação com os dados de limite de precisão da tempestade, neste caso 90 nanômetros em comparação com 67 nanômetros. Uma maneira melhor de detectar desvios é comparando as localizações em função do tempo IE, vendo se as localizações nos quadros posteriores são deslocadas em comparação com as dos primeiros quadros.

Isso pode ser visto claramente no caso dos filamentos de actina quando exibidos com um código de cores. Usando o recurso de rastreamento de caixa em tempestade, conforme mostrado nos painéis, as localizações B e c são exibidas com uma cor correspondente ao número do quadro de quando foram adquiridas. Por exemplo, as localizações do início da sequência de aquisição são azuis, enquanto as localizações do final da sequência de aquisição são vermelhas.

As cores deslocadas indicam que ocorreu um desvio para medir e corrigir. Para grânulos fluorescentes à deriva de 100 nanômetros de diâmetro podem ser usados como marcadores fiduciais, os números de um a quatro mostram grânulos cortados e ampliados individualmente. Em um exemplo em que há um desvio relativamente severo de aproximadamente 100 nanômetros ao longo de três minutos e 10 segundos durante a fase de aquisição, o mesmo recurso de rastreamento de caixa pode ser usado para codificar por cores e confirmar que o desvio ocorreu, pois todos os quatro grânulos neste exemplo são mostrados quase idênticos, é possível selecionar um deles, neste caso, o cordão dois para usar como referência e subtrair o desvio das outras contas.

Uma comparação com o painel E mostra que o desvio lateral foi corrigido. Finalmente, as células de calcanhar coradas com fator de crescimento epidérmico podem ser usadas para dar um exemplo realista de resolução de imagem. Nas células, o painel A mostra uma imagem limitada por difração de parte de uma célula hela focada na superfície basal da célula, onde as caixas amarelas indicam ampliado nas regiões de interesse mostradas nos painéis B e C, em contraste com o zoom indistinto nas regiões de interesse na imagem limitada por difração.

As imagens de super-resolução devem mostrar uma mistura de clusters ocasionais isolados pixels únicos. Os aglomerados terão aproximadamente 100 nanômetros de diâmetro e provavelmente corresponderão à formação de poços e vesículas. O caminho pelo qual o EGF é predominantemente regulado negativamente e as localizações endocitadas por dados de quadro do Painel D são apresentadas no gráfico G. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer algumas amostras de teste simples, adquirir dados e reconstruir tempestades de alta qualidade, veja imagens de resolução.

Esses métodos ajudarão a evitar algumas armadilhas de ajuste comuns, como deriva, e ajudarão a otimizar sua tempestade. Veja experimentos de resolução.