As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como obter imagens de super-resolução de alta qualidade usando microscopia STORM. Isso é realizado primeiramente preparando uma amostra-teste marcada com fluoróforos. O segundo passo é preparar o tampão de comutação e, em seguida, preencher a câmara de imagem com o tampão.

Em seguida, os dados brutos são adquiridos em um microscópio storm. O passo final é reconstruir imagens de super-resolução a partir dos dados brutos utilizando o software de processamento rainstorm. Em última análise, as amostras-teste são usadas para demonstrar como adquirir dados brutos de alta qualidade, os quais podem então ser processados para gerar imagens de super-resolução storm em células com resoluções entre 30 e 50 nanômetros, representando um aumento de resolução de cinco a dez vezes em comparação com técnicas tradicionais de microscopia de fluorescência, incluindo turf e confocal.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque não percebem a importância de coletar muitos vínculos esparsos de alta qualidade. Isso se torna muito mais fácil usando o corante Alexa 6 4 7 no tampão de comutação correto. Uma demonstração visual desta técnica é essencial, pois a obtenção de dados brutos de alta qualidade é fundamental para produzir imagens de resolução SPR.

As sequências de vídeo bruto desta técnica parecem completamente diferentes de qualquer outra forma de microscopia de fluorescência. Para iniciar o procedimento de revestimento de vidro com dextrina fluorescente, adicione 200 microlitros de uma solução de polilisina a 0,01% em cada poço de uma lâmina de vidro com oito câmaras e incube por 10 minutos. Após 10 minutos, remova a solução de polilisina com uma pipeta para garantir que nenhum líquido residual permaneça diluído.

0,25 microlitros de uma solução estoque de dextrina a dois miligramas por mililitro. Alexa 6 47 em 25 microlitros de água desionizada para criar uma solução a 20 microgramas por mililitro, visando obter um revestimento denso de dextrina. Solução Alexa 6 47.

Dilua 20 microlitros da solução de 20 microgramas por mililitro em um volume total de 200 microlitros de água desionizada. Para uma solução de densidade média, dilua dois microlitros em 200 microlitros de água desionizada. Para uma solução de baixa densidade, dilua 0,2 microlitros.

Em 200 microlitros de água desionizada, adicione 200 microlitros das soluções diluídas de dextrina Alexis X 47 a cada poço e incube por 10 minutos. Podem ser utilizados tempos de incubação mais longos, o que pode resultar em um revestimento de dextrina mais denso. Por fim, remova as soluções Dexter Xis X 47 e lave com água três vezes.

Para preparar filamentos de actina fluorescentes em lâmina de vidro primeiramente, adicione 200 microlitros de solução de polilisina 0,01% a cada poço de uma câmara de oito compartimentos. Cubra o vidro e incube por 10 minutos. Remova com uma pipeta para garantir que nenhum líquido permaneça.

Adicione a cada câmara 90 microlitros de tampão geral de actina previamente reconstituído de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione 10 microlitros de solução de filamentos de actina pré-formados a 10 micromolar e um microlitro de foid e Alexa 647 e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar. Incube por 30 minutos à temperatura ambiente para preparar microesferas fluorescentes como marcadores fiduciais. Dilua um microlitro de microesferas tepec em 200 microlitros de PBS e misture. Adicione as microesferas diluídas à câmara de imagem e aguarde 15 minutos.

Após 15 minutos, remova a solução e lave três vezes com PBS antes da aquisição de imagens. As células cultivadas até cerca de 80% de confluência são utilizadas neste experimento. Remova o meio de cultura e lave com PBS. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de formaldeído 4% por 10 minutos.

Remova a formaldeído e lave três vezes com PBS. Não permita que as células sequem e use sempre soluções tamponadas com PBS. Para evitar estresse hipotônico, adicione dois microlitros de uma solução estoque de 50 microgramas por mililitro de EGF Alexa 647 a 200 microlitros de solução de BSA 0,1%, e então adicione esta solução às células HeLa.

Incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Remova a solução e lave três vezes com PBS. Adicione uma solução bloqueadora de 0,1% de BSA e deixe por 15 minutos à temperatura ambiente.

Após isso, remova a solução bloqueadora e lave mais três vezes com PBS antes da aquisição de imagens. Imediatamente antes da aquisição, prepare o tampão de comutação misturando as soluções estoque da enzima glicose e do agente redutor em uma proporção de 50 microlitros, 400 microlitros e 100 microlitros, adicionando PBS para completar o volume final até um mililitro. Remova o PBS da câmara de imagem e, em seguida, encha até o topo com o tampão de comutação.

Coloque cuidadosamente uma lamínula sobre a parte superior da câmara, certificando-se de que não haja absolutamente nenhuma bolha e de que toda a câmara esteja coberta. Se forem observadas bolhas, complete com tampão adicional ou PBS. Caso contrário, o desempenho do tampão pode diminuir.

A coleta de dados de ligação de alta qualidade e esparsos é essencial para o sucesso deste procedimento; portanto, certifique-se de que os microscópios estejam corretamente focados e de que as configurações corretas de aquisição sejam utilizadas. Localize uma estrutura fluorescente de interesse a ser imageada. Selecione o ângulo desejado de iluminação.

Neste caso, recomenda-se um ângulo rasante ou altamente inclinado, pois isso melhora a relação sinal-ruído ao minimizar a luz fora de foco, o que é particularmente benéfico para amostras celulares. Adquira uma imagem de referência com resolução limitada por fração da estrutura antes da aquisição por microscopia STORM. Aumente o laser de excitação para uma potência elevada correspondente a aproximadamente dois quilowatts por centímetro quadrado, enquanto realiza a aquisição com configurações da câmera de 10 milissegundos de exposição e um tempo de ciclo de aproximadamente 50 hertz ou quadros por segundo.

Uma vez que os quatro grupos de flora tenham passado para um padrão de piscagem esparsa, colete 10.000 quadros. Para iniciar esta reconstrução, abra o arquivo M RAINSTORM dentro do MATLAB e execute-o na janela rainstorm.

Selecione o arquivo de imagem a ser analisado usando o botão de navegação. Este deve ser um arquivo TIF. Altere a largura do pixel para corresponder aos dados brutos do sistema de microscopia utilizado para adquirir os dados.

Deixe os outros valores como padrão. Pressione o botão processar imagens e aguarde até que uma imagem preliminar apareça. A duração do processamento dependerá do tamanho do arquivo, da especificação do computador e do número de links candidatos nos dados brutos.

Para gerar uma imagem atualizada de super-resolução, pressione o botão abrir revisor e uma segunda janela aparecerá. Pressione o botão ajustar contraste para alterar a exibição da imagem conforme desejado. Em alguns casos em que a imagem é muito escura, o valor máximo deve ser reduzido.

Utilize a janela do revisor para gerar métricas úteis de qualidade da imagem e refinar ainda mais a imagem de super-resolução. Mantenha os três primeiros parâmetros de controle de qualidade com os valores padrão de 5.000, 0,1 e de 0,8 a 3,5, respectivamente. Atualize o valor de contagens por fóton.

Altere o limite de precisão de localização para equilibrar a otimização da localização média, a precisão e o número de localizações. Na imagem final, recomenda-se valores entre 30 e 50 nanômetros, dependendo da qualidade dos dados e da amostra. O fator de escala de reconstrução padrão é cinco, o que gerará pixels de super-resolução de 32 nanômetros, assumindo que o pixel nas imagens originais seja de 160 nanômetros.

Se as imagens brutas tiverem um tamanho de pixel de 100 nanômetros, isso produzirá imagens de super-resolução com pixels de 20 nanômetros. Aumente o fator de escala para produzir pixels de super-resolução menores. Na imagem final, pressione o botão executar revisor para gerar uma imagem de super-resolução atualizada.

Pressione o botão exibir histogramas para mostrar as métricas de qualidade da imagem. Por fim, pressione o botão salvar imagem no visualizador para salvar todos esses dados. Inicie este procedimento gerando uma imagem da mesma maneira que demonstrado anteriormente.

Pressione o botão de rastreamento da caixa no visualizador e clique e arraste uma caixa sobre o marcador fiducial na imagem analisada. Aguarde até que uma nova imagem apareça, a qual exibirá as posições delimitadas. Salve esta imagem, se desejado, caso o objeto de interesse seja um marcador fiducial.

Como é o caso aqui, realize a correção de deriva clicando no botão definir âncora, seguido pelo botão subtrair deriva. Por fim, clique novamente em executar revisor para gerar uma nova imagem de tempestade. Um revestimento bem-sucedido de dextrina deve produzir uma monocamada fluorescente, e dados típicos de dextrina são mostrados nesta figura.

As imagens com limite de difração mostram diferentes concentrações de dextrina antes da aquisição por STORM. As reconstruções de super-resolução têm um tamanho de pixel de 25 nanômetros. Foram coletadas 10.000 imagens com um tamanho de quadro de 128 por 128 pixels, e quadros individuais são exibidos a partir dessa sequência.

Em alta concentração de dextrina. A monocamada fluorescente deve parecer relativamente uniforme, conforme ilustrado nestas imagens e neste segmento de vídeo. Em concentrações mais baixas, os piscarões aparecerão mais esparsos e em foco.

Com nenhum fundo aparente durante esta fase de aquisição de imagens com iluminação a laser constante, o número de piscadelas diminuirá com o tempo, conforme ilustrado pela comparação entre o quadro 2000 e o quadro 8.000 na amostra de alta densidade. A principal diferença entre as imagens de super-resolução das concentrações alta, média e baixa de dextrina é a redução no número de localizações. Este gráfico mostra uma média de três sequências de 10.000 quadros de cada concentração de dextrina, onde as barras de erro indicam o desvio padrão.

No entanto, essa relação proporcional entre a concentração das moléculas fluorescentes, o número de piscadelas nos dados brutos e o número de localizações não é uma relação simples e linear, conforme ilustrado neste gráfico do número de localizações aceitas por quadro. Utilizando uma média móvel de 100 quadros em densidades muito altas de moléculas, o software é incapaz de localizar com sucesso as moléculas ao imagens qualquer amostra. Um problema comum pode ser a presença de um halo fluorescente brilhante, mas desfocado, ao longo da imagem, causado pela difusão do fluoro no meio.

Essas moléculas fluorescentes destacadas podem ser evitadas ou removidas aumentando o número de etapas de lavagem com PBS antes de adicionar o tampão de comutação ou adicionando tampão de comutação fresco à câmara. O processamento e a comparação dos dados de cada sequência de imagens resultam em imagens de super-resolução muito diferentes. Os painéis C e D são reconstruções de imagens de super-resolução correspondentes aos dados coletados nos painéis A e B, respectivamente. Este gráfico representa o número de localizações aceitas por quadro utilizando uma média móvel de 100 quadros.

A linha vermelha corresponde às sequências de tempestade A e C, onde há um fundo alto; a linha azul corresponde às sequências B e D, onde o fundo é baixo. O número aceito de localizações para as imagens correspondentes aos dados de fundo alto e baixo é mostrado no segundo gráfico. Essas três imagens com limite de difração mostram dados típicos de filamentos de actina pré-formados aderidos à superfície do vidro antes da adição do tampão de comutação e da aquisição de imagens por microscopia STORM.

Podem ser observados filamentos de comprimentos variáveis. Filamentos muito brilhantes frequentemente consistem em vários filamentos emaranhados. A seleção de filamentos individuais relativamente brilhantes, em vez de áreas emaranhadas, resulta em imagens de melhor qualidade durante a fase de aquisição.

Devem ser observados piscamentos brilhantes e em foco ao longo do comprimento do filamento. Deve haver piscamentos esparsos durante a fase de aquisição e posteriormente nos dados processados. Deve estar presente um filamento contínuo e fino nas localizações por quadro, que devem mostrar uma diminuição gradual.

Normalmente, a largura total na metade do máximo, ou FWHM, de um filamento é fornecida como uma estimativa empírica de resolução, traçando-se uma linha reta através de uma região ampliada do filamento de actina utilizando a função perfil de plotagem no ImageJ e, posteriormente, realizando um ajuste gaussiano. O FWHM é calculado como 43,2 nanômetros. Pode ocorrer um problema de má localização quando vários filamentos de actina estão se ramificando e/ou cruzando uns aos outros, ao processar subconjuntos de quadros e comparar os primeiros e os últimos 5.000 quadros.

Uma imagem diferente é produzida na imagem de super-resolução utilizando os primeiros 5.000 quadros. Muitas localizações são observadas no centro da imagem. No entanto, ao usar os últimos 5.000 quadros, muito poucas dessas localizações são aparentes e apenas os filamentos permanecem, embora de forma parcialmente contínua devido ao baixo número de localizações na imagem.

Se for suspeita uma densidade de cintilação excessivamente alta, a comparação das imagens com os dados de localização por quadro pode indicar fortemente que esse problema está ocorrendo durante o primeiro conjunto de quadros. Há um número médio de localizações por quadro superior a 10, comparado ao último conjunto de quadros, onde é aproximadamente quatro. Outro problema potencial na microscopia STORM é a deriva, que ocorre quando a amostra se move em relação à lente objetiva durante a fase de aquisição de dados. Embora seja muito difícil detectar durante a aquisição da imagem, a deriva pode ser identificada em imagens de super-resolução de estruturas conhecidas, como filamentos de actina.

O primeiro sinal de que pode ter ocorrido deriva lateral é que a estrutura é maior do que o esperado. Por exemplo, com uma largura total em meia altura relativamente grande em comparação com os dados do limite de precisão de chuva, neste caso 90 nanômetros em comparação com 67 nanômetros. Uma maneira melhor de detectar deriva é comparando as localizações em função do tempo, ou seja, verificando se as localizações em quadros posteriores estão deslocadas em relação àquelas em quadros iniciais.

Isso pode ser claramente observado no caso dos filamentos de actina quando exibidos com um código de cores. Usando a função de rastreamento de caixas no rainstorm, conforme mostrado nos painéis B e C, as localizações são exibidas com uma cor correspondente ao número do quadro em que foram adquiridas. Por exemplo, localizações obtidas no início da sequência de aquisição são azuis, enquanto localizações obtidas no final da sequência de aquisição são vermelhas.

As cores deslocadas indicam que ocorreu deriva, a fim de medi-la e corrigi-la. Para medir a deriva, esferas fluorescentes de 100 nanômetros de diâmetro podem ser utilizadas como marcadores fiduciais; os números de um a quatro mostram esferas recortadas e ampliadas individualmente. Em um exemplo onde há uma deriva relativamente acentuada de aproximadamente 100 nanômetros ao longo de três minutos e 10 segundos durante a fase de aquisição, a mesma função de rastreamento de caixa pode ser usada para codificar por cores e confirmar a ocorrência da deriva, já que todas as quatro esferas neste exemplo apresentaram deriva quase idêntica. Nesse caso, é possível selecionar uma delas — a esfera dois — como referência e subtrair a deriva das outras esferas.

Uma comparação com o painel E mostra que a deriva lateral foi corrigida. Por fim, células HeLa marcadas com fator de crescimento epidérmico podem ser utilizadas para fornecer um exemplo realista de resolução de imagem. Nas células, o painel A mostra uma imagem limitada pela difração de uma parte de uma célula HeLa focalizada na superfície basal da célula, onde as caixas amarelas indicam regiões de interesse ampliadas exibidas nos painéis B e C, em contraste com as regiões de interesse ampliadas indistintas na imagem limitada pela difração.

As imagens de super-resolução devem mostrar uma mistura de aglomerados e, ocasionalmente, pixels isolados individuais. Os aglomerados terão aproximadamente 100 nanômetros de diâmetro e provavelmente corresponderão a fossas e vesículas em formação. O caminho pelo qual o EGF é predominantemente desregulado e as localizações de endocitose por quadro de dados do Painel D são apresentados no gráfico G. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar algumas amostras de teste simples, adquirir dados e reconstruir imagens de resolução elevada por microscopia STORM.

Esses métodos ajudarão a evitar algumas armadilhas comuns de ajuste, como deriva, e contribuirão para otimizar sua tempestade. Veja os experimentos de resolução.