Name: As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: Aprenda a preparar amostras de teste para otimizar a microscopia STORM de super-resolução. Este método demonstra a aquisição de dados brutos e a reconstrução de imagens com resolução de 30-50 nm.

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Reconhecemos o financiamento do programa de Química e Metrologia Biológica do Office Medição Nacional do Reino Unido. Agradecemos Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi e Eric Rees para assessoria técnica e sugestões. Agradecemos Miklos Erdelyi, Eric Rees e Max Ryadnov para comentários e discussões sobre este manuscrito úteis.

Nota: Ao longo deste protocolo, dicas e sugestões são encontradas seguindo determinadas etapas. A notação &quot;* 1&quot; indica que a nota 1 é relevante para este passo específico, e assim por diante. 1. Fluorescente Dextran Revestimento de Vidro <ol><li> Adicionar 200 mL de L-lisina de poli solução 0,01% a cada poço de uma lamela 8-câmara e incuba-se durante 10 min. Retire com uma pipeta para garantir que não é líquido restante. </li><li> Reconstituir dextrano-Alexa 647 * 1 de acordo com as instruções do fabricante para criar uma solução de 2 mg / ml. A partir deste, diluir 0,25 ul em 25 ul de água desionizada para criar uma solução de 20 ug / ml. </li><li> Para criar um revestimento de alta densidade de dextrano-Alexa 647 solução diluída 20 ul da solução de 20 ng / ml dentro de um total de 200 mL de água desionizada. Para uma solução de média densidade diluir 2 ul em 200 mL de água desionizada (diluição de 1:10.000 a partir da solução em bruto). Por um baixosolução densidade diluir 0,2 mL em 200 mL de água deionizada (1:100.000 diluição da solução estoque original). </li><li> Adicionar 200 ul dos diluídos dextrano-Alexa 647 soluções a cada poço e incubar durante 10 min. Tempos de incubação mais longos podem ser utilizados, que podem resultar em uma camada de dextrano mais denso. Remover e lavar com H2O, três vezes * 2 </li></ol> Nota 1: Outros conjugados de corante-dextrano pode ser utilizado. Dextrano não conjugado também pode ser conjugado com corantes se combinações desejadas não se encontram disponíveis comercialmente. Nota 2: As mesmas câmaras de dextrano pode ser recriada ao longo de um período de semanas, embora a uniformidade da fluorescência pode diminuir. O armazenamento a 4 ° C, na ausência de qualquer tampão é recomendado. 2. Fluorescente filamentos de actina em Vidro <ol><li> Adicionar 200 mL de L-lisina de poli solução 0,01% a cada poço da câmara, e incubar durante 10 min * 3. Remover-se com uma pipeta, para garantir que o líquido não é remanescente. </li><li> Adicionar 90 ul de tampão de actina geral (reconstituídos de acordo com as instruções do fabricante) para cada câmara. Adicionar 10 ml de 10 uM preformados solução filamentos de actina e 1 ul faloidina-Alexa 647 (0,2 unidades, quando dissolvido em 1,5 ml de metanol, conforme as instruções do fabricante) e suavemente pipetar para cima e para baixo para misturar. Incubar por 30 minutos * 4. </li></ol> Nota 3: O aumento do volume da solução de filamentos dentro dos resultados da câmara de menos filamentos que se ligam ao vidro revestidas com poli-L-lisina. Nota 4: Os tempos de incubação de até 48 horas a 4 ° C foram testados com bons resultados. Qualidade de imagem deteriora-se filamentos de actina, uma vez uma câmara tiver sido exposto a tampão de interrupção, por isso, não é recomendado utilizar a mesma amostra para mais do que um dia. 3. Microesferas fluorescentes Beads como Fiducial Marcadores <ol><li&gt; Diluir 1 ml de pérolas de TetraSpeck em 200 ul de PBS e misturar. </li><li> Adicione as contas diluídas em uma câmara de imagem e esperar por 15 minutos * 5. Remover a solução e lava-se 3 vezes com PBS antes da imagiologia. </li></ol> Nota 5 - o tempo de incubação e de diluição pode ser ajustada para se obter diferentes densidades dos grânulos. Este protocolo normalmente resulta em entre 3-10 contas por 20,5 mM x 20,5 mM campo de visão. 4. Fator de Crescimento Epidérmico coloração celular <ol><li> Cultura de células HeLa em câmaras de imagem para cerca de 80% de confluência em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e solução de penicilina-estreptomicina a 1%. </li><li> Remover o meio de cultura e lava-se com PBS. Em seguida adicionar 500 ml de solução de formaldeído a 4% (solução de formaldeído a 4 ml de 10%, 1 ml de PBS 10X, 5 ml de água) durante 10 min. Remover o formaldeído e lava-se 3 vezes com PBS. Não permita que as células permaneçam dry e use sempre PBS tamponado soluções para evitar o estresse hipotônico. </li></ol> ATENÇÃO - formaldeído é extremamente tóxico. Certifique-se de que as luvas apropriadas, proteção para os olhos e jalecos são usados. Verifique as diretrizes locais para a eliminação de formaldeído. <ol start="3"><li> Reconstituir o EGF-Alexa 647 de acordo com as instruções do fabricante para criar uma solução de estoque de 50 mg / ml. Adicionar 2 mL de desta solução de reserva a 200 ml de solução de BSA a 0,1% (em PBS). Remover o PBS a partir das células, adicionar a solução de EGF e incuba-se durante 30 min. </li><li> Remova a solução e lava-se 3 vezes com PBS antes da adição de uma solução de bloqueio de BSA a 0,1% (em PBS) durante 15 min. Remover esta e lavar mais 3 vezes com PBS antes da imagem. </li></ol> 5. Mudando de Buffer Preparação <ol><li> Adicione uma solução de estoque de enzima (A) com 10 ml de catalase (20 ug / ml), 20 pi de 1 M Tris cloridrato de (2-carboxyelthyl) fosfina (4 mM), 2,5 ml de glicerina (50%), 125 ulde 1 M de KCl (25 mM), 100 ul de 1 M de pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg de glicose-oxidase (1 mg / ml) e de topo até 5 ml de volume com diH20. Isto é suficiente para fazer 100 x alíquotas de 50 ul, que podem ser armazenadas a -20 ° C e utilizados para até 1 ano. </li><li> ) Adicione uma solução de glicose (B) com 4 g de glicose (100 mg / ml), 4 ml de glicerina (10%) e 36 ml diH20. Isto é suficiente para fazer 100 x 400 mL alíquotas, que podem ser armazenados a - 20 ° C e usadas até 1 ano. </li><li> Produzir uma solução stock do agente redutor (C) com 113,6 mg de MEA-HCl (1 M) e 1 ml de 2 0 dih. Use fresco ou fazer 10 x 100 mL alíquotas, as quais podem ser armazenadas a -20 ° C e utilizados para até 1 mês (não recongelar alíquotas). </li><li> Imediatamente antes da imagiologia, misturar a enzima (A), glucose (B) e as soluções de agente de redução (C) em conjunto na proporção de 50 ul, 400 ul, 100 ul e perfazer 1 ml com PBS * 6. Esse buffer será agora eliminar o oxigénio e ter um ambiente redutor (100 MEA-mMHCl) * 7. O pH final deverá estar na gama de 6,0-8,5 (ajustamento não é normalmente necessário) * 8. </li></ol> Nota 6 - este tampão é adequado para utilização com os corantes à base de carbocianina, tais como Cy5 e Alexa 647. Nota 7 - a concentração final de enzima é de 50 ng / ml (5 unidades / ml) de uma oxidase de glucose e 1 mg / ml (40-60 unidades / ml) de catalase. A atividade enzimática (unidades) é dada por fornecedores e podem variar. Os cálculos para a catalase assumir que 1 ug / ml de concentração final após a etapa 5.4 irá conter 50 unidades de enzima. Várias composições de tampão, incluindo os componentes de eliminação de oxigénio semelhantes podem ser encontrados 21,30,40. Para um resumo das combinações de tampão e corante ver referências 28,29. Glicerina e TCEP são necessários para o armazenamento a longo prazo a -20 ° C. Nota 8 - se os filamentos de actina imagiologia adicionar MgCl2 2 mM e ATP 0,2 mM, para ajudar a estabilizar tele filamentos. 6. Microscópio Aquisição de Dados STORM (usando Alexa 647 corante) <ol><li> Ligue o microscópio TEMPESTADE / PALM, de preferência, pelo menos, 3 horas antes de imagem para permitir um equilíbrio térmico a ser alcançado. Imagem antes disso tem uma chance maior de drift. </li><li> Insira a câmara de imagem no suporte de amostra do palco microscópio. Certifique-se de que a amostra é firmemente no suporte e é plana. </li><li> Retire a PBS da câmara de imagem e, em seguida, preencher a parte superior com o tampão de comutação. Com cuidado, coloque uma lamela sobre a parte superior da câmara, certificando-se de que não existem bolhas em tudo e que toda a câmara é coberto. Atestar com tampão adicional ou PBS, se as bolhas são vistos de outra forma tampão desempenho pode diminuir. </li></ol> CUIDADO - para minimizar as possibilidades de desvio lateral e axial da amostra em relação à lente objectiva, recomenda-se que a amostra e o tampão são deixados a equilibrarà temperatura ambiente durante pelo menos 15 minutos antes da imagiologia. <ol start="4"><li> Localize uma estrutura fluorescente de interesse a ser trabalhada. Seleccione o ângulo desejado de iluminação, neste caso, um ângulo TIRF ou altamente inclinado é recomendada pois aumenta a relação sinal-ruído através da minimização de luz fora do foco, o que é particularmente benéfico para as amostras de células. Pegue uma imagem de difração limitada de referência da estrutura antes da imagem STORM. </li><li> Aumentar o laser de excitação (com um comprimento de onda de excitação apropriada de cerca de 640 nm) a uma potência elevada, que corresponde a cerca de 2 kW / cm 2, embora de imagem com as configurações da câmara de exposição de 10 ms e um tempo de ciclo de cerca de 50 Hz (frames por segundo) . Uma vez que os fluoróforos fizeram a transição para um padrão de piscar escassa (provavelmente dentro de 10 segundos para a maioria das amostras) coletar 10.000 quadros * 9. </li></ol> Nota 9 - 10.000 quadros é adequado para as amostras aqui descritasmas pode ser necessário aumentar o número de quadros a 50.000 ou mais para outras amostras. 7. Reconstruindo Super-resolução de imagens a partir de dados brutos (usando tempestade) <ol><li> Abra o ficheiro de dentro rainSTORM.m MATLAB e executar (Figura 1A). </li><li> Na janela de tempestade (Figura 1B), selecione o arquivo de imagem a ser analisada usando o botão Procurar. Este deve ser um arquivo. Tif (ImageJ pode ser usado para converter outros tipos de arquivos em um formato tif). Altere a largura de pixel para combinar os dados brutos do sistema de microscópio utilizado para a aquisição dos dados * 10. Deixe os outros valores para o padrão. </li></ol> Nota 10 - A câmera típico EMCCD tem um tamanho de pixel de 16 mM de modo em um sistema com uma lente objetiva de 100X o tamanho do pixel na imagem será de 160 nm. Em sistemas comerciais o tamanho do pixel geralmente é exibido dentro do software. Tamanhos de pixel variar entre 100 nm e 160 nm, para a maioria dos microscópios de localização.<ol start="3"><li> Pressione o botão &quot;Processar Imagens &#39;e espere até que uma imagem preliminar aparece. A duração do tratamento dependerá do tamanho do ficheiro, especificação de computador e o número de candidatos pisca dentro dos dados brutos * 11. </li></ol> Nota 11 - 10.000 seqüências de quadros de actina e dados EGF levou 23 seg e 25 seg para processar respectivamente usando um PC com um processador Intel Xeon E5420. Usando o mesmo computador sem uma caixa de ferramentas de processamento paralelo em MATLAB, ou com um computador sem múltiplas core, os tempos eram de 66 seg e 81 seg, respectivamente. <ol start="4"><li> Para gerar uma super-resolução de imagem imprensa atualizou o botão &#39;Abrir Revisor&#39; e uma segunda janela será exibida (Figura 1C). Pressione o botão &quot;Ajustar Contraste&quot;, a fim de mudar a visualização da imagem se for o caso (Figura 1D). Em alguns casos, onde a imagem é muito escuro o valor máximo deve ser diminuído. </li><li> Use o reviewer janela (Figura 1C) para gerar métricas úteis qualidade de imagem e melhorar a imagem de super-resolução mais. Defina os três primeiros parâmetros de controle de qualidade a valores de 4000, 0,1 e 0,8-2,0 respectivamente * 12. Atualize as contagens por valor de fótons, que deve ser baseada em uma medida de calibração ou de fótons usando fótons curva valores das curvas de calibração especificado pelo fabricante da câmera para um ajuste de ganho particular, EM. Isso é fundamental para a obtenção de precisão exata e medidas de resolução * 13. </li></ol> Nota 12 - Contagens de sinal rejeita pisca com base em critérios de brilho. Quanto maior o valor mais brilhante a piscar deve ser tornar-se aceito como uma localização na imagem final. Isto pode necessitar de ser alterada de acordo com a saída de fotões de corante e o tempo de exposição e da sensibilidade da câmara. Tolerância rejeita pisca se houver erro quadrado significativa entre o sinal eo equipada Gaussian ou seja, dpicos ouble. PSF Sigma Faixa rejeita pisca se a largura de ajuste do PSF encontra-se fora deste intervalo, ou seja, uma faixa mais estreita pode ser usado para rejeitar fora de foco sinais e grandes manchas agregadas de fluorescência constante. Usando uma gama mais ampla pode resultar em artefactos mislocalization aparecem na imagem final. Na prática, recomenda-se realizar o controle de qualidade inicial usando o parâmetro de corte de precisão de localização. Nota 13 - para saber mais sobre as métricas de resolução de ver referências 23,27. Em resumo, conhecendo o número de fótons produzidos por cada piscar, é possível calcular a precisão de localização de cada localização e, consequentemente, derivam média global estimativas de precisão para toda a imagem. Usando um Andor IXON DU-897E com um ajuste de ganho de 200 as contagens por valor Photon é 9.04. <ol start="6"><li> Alterar a localização de corte de precisão (Figura 1C) a troca entre otimizando precis médios de localizaçãoíon contra número de localização na imagem final. Os valores de 30-50 nm, são recomendados, dependendo da qualidade dos dados e a amostra. Ambos os histogramas e os arquivos INFO.TXT pode ser utilizado para informar esta decisão (Figuras 1F e 1G). </li><li> O fator de escala reconstrução (Figura 1C) padrão é 5, o que irá gerar pixels de super-resolução de 32 nm, assumindo que a largura de pixel nas imagens originais é de 160 nm. Se as imagens cruas têm um tamanho de pixel de 100 nm isso irá produzir imagens de super-resolução, com pixels de 20 nm. Aumentar o fator de escala para a produção de pequenos pixels de super-resolução na imagem final * 14. </li></ol> Nota 14 - Resolução de microscopia localização depende da suavização necessária para a visualização (isto é, o tamanho do pixel de uma reconstrução histograma simples), bem como a precisão de localização. Na prática, o tamanho do pixel de reconstrução deve geralmente ser menor do que a localizaçãoprecisão (ver a métrica Média Precisão Estimativa no arquivo de texto info - passos 6.11 e 6.12). Neste caso, a perda de resolução devida a reconstrução tamanho do pixel será pequeno 23,27. Por exemplo, as estimativas de precisão média na linha e direção da Figura 4E coluna são de 16,1 nm e 16,2 nm. Um tamanho de pixel de 16 nm foi utilizado para visualizar dados (fator de escala reconstrução de 10 com uma largura original do pixel de 160 nm). <ol start="8"><li> Modificar a faixa limite do quadro (Figura 1C) para restringir a reconstrução de subconjuntos dos dados brutos, por exemplo [2001-inf] excluiria os 2.000 quadros iniciais de dados brutos. </li><li> Pressione o botão &quot;Run Revisor &#39;(Figura 1C) para gerar uma imagem de super-resolução atualizado (Figura 1E). </li><li> Pressione o botão &#39;Exibir&#39; histogramas (Figura 1C), a fim de exibir métricas de qualidade de imagem (Figura 1F) * 15. </li></ol&gt; Nota 15 - O gráfico no canto superior direito que representa o número de localizações aceites contra número do quadro da câmera e do histograma Thompson Localização Precisions no canto inferior direito (Figura 1F) pode ser usado para informar a opção de precisão de localização crítica de corte. Por exemplo, usando um corte de 50 nm excluiria todas as localizações com pior precisão de ser incluído na imagem final super-resolução. <ol start="11"><li> Pressione o botão &quot;Salvar imagem&quot; na revisor (Figura 1C), a fim de salvar todos esses dados * 16. </li></ol> Nota 16 - entre 3 e 5 arquivos podem ser salvos, dependendo das opções selecionadas (imagem soma, STORMdataImage, STORMprocessed, info &amp; hists), ver figura 1G. A imagem processada STORM é exibido com mapas de contraste e cores modificadas. O STORMdataImage é uma imagem em tons de cinza, em que o nível de cinza de cada pixel é igual ao entorpecidoer de localizações que foram identificados dentro dele. <ol start="12"><li> Depois de examinar os dados (por exemplo Info.txt arquivo e histogramas) retorno para a etapa 7.6 e repita os passos subsequentes com diferentes parâmetros do revisor, se desejar. Clicando no botão &quot;Salvar imagem&quot; no passo 7.11 substituirá os dados salvos anteriormente. </li></ol> 8. Box Rastreamento e Correção de Deriva (usando tempestade) <ol><li> Siga passos 7,1-7,9 para gerar uma imagem de uma forma normal. </li><li> Pressione o botão &#39;Caixa de rastreamento &quot;na revisor (Figura 1C) e clique e arraste uma caixa sobre o marcador fiducial ou estrutura de juros sobre a revisão da imagem. </li><li> Aguarde até que uma nova imagem aparece, que irá mostrar os &#39;Posições encaixotado&#39; (ver Figuras 6B, 6C e 6F para exemplos). Salve esta imagem, se desejar. </li><li> Se o objeto de interesse é um marcador fiducial então deriva correção pode ser feita clicando no botão &#39;Definir âncora&#39;, seguido do &#39;Subbotão Deriva trato &#39;. Por fim, clique novamente em &quot;Executar Revisor &#39;para gerar uma nova imagem STORM, que terá agora todas as localizações corrigidos de acordo com as posições dos marcadores fiduciais. As posições de contas são excluídos da imagem revisado final. </li><li> Se houver outros marcadores fiduciais dentro da imagem deriva corrigido final, estas podem ser removidas pressionando &#39;Box Rastreamento&#39;, &#39;Apagar em caixa &quot;e, em seguida, quantas vezes&#39; Run Viajante&quot; se o desejar. </li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Mostramos com algumas amostras de teste simples e livremente disponível tempestade software de processamento, é possível otimizar STORM super-resolução de imagem. Estas ferramentas e métodos irá fornecer pontos de partida úteis para novos usuários e maneiras para os usuários experientes para aumentar a confiança em seus microscópios e seu uso deles para estudo das estruturas biológicas e celulares com detalhes sem precedentes. Usando uma combinação de amostras com estruturas conhecidas ou bem compreendidos e um algoritmo que pode produzir uma série de métricas úteis qualidade de imagem, tais como estimativas de precisão média, o número de localização e histogramas mostrando que é possível melhorar a qualidade de imagem e de ter maior confiança no processo de imagem STORM. Não há um tamanho único abordagem para a aquisição dos dados, pois há um número de diferentes configurações de microscópio comerciais e auto-construído, que pode ser utilizada. Além disso, há muitos e preparação de amostras de imagem etapas de aquisição, que pode influenrência a imagem final, portanto, ter ferramentas de software e amostras de teste é fundamental para a compreensão e otimizando a qualidade de imagem de tempestade. Além disso, estes protocolos podem fornecer formas úteis e menos ambíguas de resolver quaisquer problemas que possam surgir. Por exemplo, a amostra de dextrano é uma forma muito útil para identificar se existe qualquer desalinhamento do feixe de laser ou de iluminação não uniforme da amostra. Se há preocupações de que o buffer de comutação não pode ser trabalho de um teste visual muito simples para ver se há alguma &#39;piscar&#39; vai ajudar. Filamentos de actina são uma maneira útil de medir resolução usando comparações FWHM, bem como destacar deriva e mislocalization artefatos. No entanto, deve notar-se que, como métodos de super-resolução com base em localização podem ser densidade fluoróforo sensível, não obstante os outros fatores que contribuem, tais como tempo de exposição, as taxas de frame, poderes laser e a forma como a imagem é processada, é impossível atribuir uma resolução para umespecial microscópio e assumir que todas as imagens terão essa resolução. O que é possível, no entanto, é medir vários aspectos da resolução, como precisões média de localização, número de localização e deriva 27. Mesmo marcadores fiduciais não pode ser incorporado em cada experiência que pode, pelo menos, ser usado para caracterizar um sistema de microscópio, o seu ambiente e entender melhor as considerações operacionais, tais como a forma como é exigido muito tempo para atingir o equilíbrio térmico após o arranque. Bem como corrigir o desvio lateral, marcadores fiduciais podem ser utilizados para caracterizar e corrigir o desvio axial, embora este requer o uso de uma lente de astigmatismo e um mecanismo de retorno para corrigir a posição da amostra, enquanto as imagens são adquiridas 43. Sistemas de super-resolução comerciais normalmente incluem algum tipo de controle de estabilidade ou concentrar-lock mecanismo, que pode ser uma solução mais prática para corrigir foco deriva. Há umre alternativas para a não-especificamente o revestimento de vidro com dextrano, tais como a utilização de corantes directamente ou outras moléculas conjugadas, tais como anticorpos secundários. Uma limitação dessas abordagens é que o número de moléculas ligadas ao vidro não é conhecido. Estruturas filamentosas alternativos que têm sido utilizados incluem microtúbulos 28 e 21 de DNA. No entanto, a combinação de tamanho muito pequeno e conveniente reagentes disponíveis comercialmente fazer actina uma alternativa atraente, em particular, como a distância de separação de filamentos divergentes ou ramificados também podem ser um indicador útil de desempenho do sistema 27. Há espaço para o desenvolvimento de amostras, apesar dos recentes progressos nesta área 28,29,46,47. Em particular, a imagem multi-cor apresenta um número de desafios em todos os três aspectos principais da imagiologia, rotulagem exemplo, a aquisição de imagem (hardware), e software (processamento de imagem e alinhamento). Tem sido umuma série de publicações abordando esses aspectos, 4-6 e, portanto, é claro que as amostras e metodologias de ensaio adequados são fundamentais para gerar e interpretar de forma confiável esses tipos de imagens. De fato, recentemente foi mostrado que dSTORM poderia ser usado para tirar duas imagens da cor, e resolver, a natureza altamente simétrico do complexo do poro nuclear e os autores sugeriram que esta seria uma forma ideal para avaliar o desempenho de correcções aberração cromática 45. Outra abordagem interessante é a utilização de origami de DNA para criar uma nanoruler, o que cria a possibilidade de posicionamento fluoróforos a distâncias sub-específicos para além de difracção 46. Isso fornece uma maneira de avaliar a resolução e fazer medições de distância. No entanto, o objectivo final é aplicar estas técnicas de super-resolução para amostras não-idealizados, como as células, que são estruturas tridimensionais complexas. Neste caso, uma combinação de compreensão mais completa de tele técnica combinada com ferramentas de software que auxiliam o usuário na aquisição de dados, processá-lo de forma adequada, e fornecendo métricas imagem é provável que seja a resposta definitiva 28,29,47,48.

Recentemente, uma série de técnicas de microscopia óptica foram desenvolvidos, normalmente referido como microscopia de super-resolução ou Nanoscopia, que pode ultrapassar o limite de difração e gerar imagens com resoluções de 100 nm ou melhor 1,2. Desde o anúncio da microscopia de super-resolução como sendo o método Nature Methods do ano em 2008, houve um grande desenvolvimento de microscópios com base em localização. Por exemplo, existem aplicações multi-cor 3-6, 7-12 implementações 3D e aplicativos de celulares ainda vivos 5,13-17. Além disso, como esses sistemas estão sendo comercializados e agora estão fazendo o seu caminho para fora dos laboratórios de ótica nas mãos dos biólogos não é provável que seja um aumento no seu uso e aplicação de questões biomédicas. Um ramo desta família são os métodos baseados em localização, que funcionam através da construção de uma molécula molécula-por-imagem. Euara fazer isso, a maioria das moléculas fluorescentes dentro da amostra deve ser desligada para que apenas algumas moléculas espacialmente separados são ativos a qualquer momento. Estas moléculas são então rapidamente ligado e desligado e muitas imagens são tomadas de modo que uma parte significativa da população é fotografada para refletir a estrutura subjacente com precisão sub-difração. Várias abordagens têm sido publicados incluindo GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, 21 e STORM RESOLFT 22. Algoritmos que medem a posição de uma única molécula de detecção pode então ser usada para localizar a posição real da molécula com precisões melhores do que 20 nm, por meio de montagem Gaussian 23, por exemplo rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 e palm3d RainStorm 27. Quando imagens de células ou de outras amostras biológicas, que têm uma elevada densidade de molécula, por isso, é necessário ter em muitos milhares de quadros deesta piscando, espacialmente separados, a fim de sinalizar uma imagem de parte significativa das moléculas marcadas. A microscopia óptica estocástica reconstrução (Storm) e a dSTORM altamente relacionados e métodos GSDIM são métodos de super-resolução à base de localização, que se demonstrou funcionar com corantes orgânicos comercialmente disponíveis 21. Eles têm sido desde demonstrou ser aplicável a um número de diferentes corantes 28-30, o que torna o método particularmente atraentes devido à especificidade e conveniência relativa de imunomarcação abordagens bem estabelecidas para a realização de microscopia de fluorescência. Consequentemente, não há acesso fácil a uma variedade de conjugados de anticorpos e de corantes de tintura-biomolécula, que têm o potencial para ser usado em super-resolução de imagem baseados em localização. Embora os princípios gerais da tempestade e abordagens semelhantes são relativamente simples, e à primeira vista a preparação do hardware e amostra parecem relativamente straightforward, há uma série de etapas no processo que são essenciais para a obtenção de alta qualidade, livre de artefatos, imagens de super-resolução. Tal como acontece com todas as técnicas de microscopia o processo pode ser considerado em três etapas principais: em primeiro lugar, a preparação da amostra, em segundo lugar, a aquisição de imagem e, em terceiro lugar, o processamento de imagem e / ou a análise e a interpretação da imagem. O poder de resolução adicional e método de geração de imagens de super-resolução usando uma abordagem baseada em localização introduz alguns novos problemas e considerações 31-33. Começando com a preparação da amostra, quando se realiza imunomarcação, particularmente de imunofluorescência indirecta em que a combinação do anticorpo primário e secundário é utilizado, deve-se notar que o corante fluorescente pode ser de até 20 nm de distância a partir da molécula de interesse. No caso dos microtúbulos, o que resulta em diâmetros de 35-50 nm em comparação com um diâmetro de microtúbulos esperado de 25 nm de 28,30. Além disso, a densidade de rotulagem deve meet os critérios de Nyquist, a fim de gerar uma imagem de alta qualidade 14. Por exemplo, para uma resolução de imagem prevista de 20 nm, ao longo de uma estrutura filamentosa deve haver uma molécula de corante, pelo menos a cada 10 nm 27. Enquanto muitos corantes têm sido publicados a trabalhar para sistemas baseados em localização se aproxima do desempenho geral do corante é uma mistura de pelo menos quatro critérios importantes, nomeadamente fótons detectados por comutação evento (o brilho de cada piscar - mais brilhante, melhor), o equilíbrio em -off ciclo de trabalho (a taxa de contraste de corantes no off contra no estado - mais fora geralmente é melhor), a fração de sobrevivência (a taxa de branqueamento de baixo é melhor) eo número de ciclos de comutação (o número de piscadas por fluoróforo - mais é melhor em alta resolução, embora uma intermitência por fluoróforo pode ser uma vantagem para fins de contagem da molécula). A situação é ainda mais complicada pelo facto de estas propriedades para qualquer dada corante pode variar em diferentes condições do tampão ecom potência 28,29 laser. Além disso, assim como estas considerações TEMPESTADE únicas, a qualidade da imagem pode ser melhorada através da optimização de preparação de amostras da mesma maneira como as técnicas mais tradicionais de microscopia de fluorescência, por exemplo, minimizando a autofluorescência por alteração das condições de fixação e a utilização de reagentes de extinção. Além disso, minimizando fluoróforos não ligados especificamente é importante, o que pode ser feito ajustando as concentrações de etiqueta, os tempos de incubação e de bloqueio e de lavagem. A segunda etapa de aquisição de imagens também é crítico. As configurações óptimas no microscópio dependerá do corante, condições de tampão, a densidade de rotulagem, e do tipo de amostra, por exemplo, de vidro, sobre as monocamadas de células ou amostras de tecido. As principais considerações são o tempo de exposição da câmera, número de quadros, ângulo de iluminação (TIRF, Hilo, Epi) e potência do laser. O objetivo é recolher o maior número pisca separadas espacialmente brilhantes o mais rápido possível. Se o i fundos muito elevados ou a piscar não são muito brilhantes, em outras palavras, a relação de sinal-para-ruído é má, o algoritmo de reconstrução não vai ser capaz de localizar as posições mais exacta. , Bem como maximizar a precisão de localização, isto é, a precisão com a posição de cada molécula pode ser medida, a qualidade da imagem, também depende de um grande número de localizações. Se um número suficiente de moléculas de interesse são gravadas, quer devido à falta de eficiência de marcação, fotodegradação excessiva ou um número do quadro insuficiente, então a imagem de super-resolução resultante será pontuada e descontínua como critério de Nyquist não foram cumpridos 14,27 . E, finalmente, a terceira etapa, processamento de imagem, é particularmente importante em comparação com as técnicas de microscopia de fluorescência padrão. Há uma variedade de livre e comercialmente disponíveis algoritmos, o que é tanto uma vantagem, em termos de escolha, e uma desvantagem, na medida em que pode ser confuso para saber which é o mais apropriado para usar. Se, por exemplo, os dados em bruto foi bem espaçadas pisca espacialmente distintas, em seguida, um algoritmo de ajuste de molécula única pode ser de alta precisão e eficiente, por exemplo, os algoritmos de ajuste esparsos disponíveis em chuvada 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 e 26 QuickPALM software . Se os dados em bruto contém uma grande quantidade de sobreposição de sinais, em seguida, os algoritmos que podem ser mais apropriado incluir DAOSTORM 34, 35 e 3B deconSTORM 36. Além disso, esses algoritmos contêm limites para vários critérios, tais como a contagem de sinal, ou fótons por piscar, bem como várias opções diferentes de visualização de imagens, tais como a visualização com funções de Gauss suavização ou como histogramas com grades de pixels, onde o tamanho do pixel super-resolução pode ser seleccionado pelo utilizador. Todas estas opções alterar a aparência da imagem final e ter implicações para a interpretação e análise de imagem. <p class="jove_content"&gt; Por isso, apresentamos três amostras de teste, que irá fornecer o novo usuário com um ponto de partida para experiências à base de corantes à base de localização de super-resolução, que por uma questão de clareza, vamos referem como tempestade, e os usuários mais experientes a oportunidade de otimizar ainda mais seus experimentos. Em primeiro lugar, é possível revestir a superfície de vidro com uma camada fluorescente de conjugado de dextrano-corante. Isso fornece uma maneira rápida e simples para estabelecer que o microscópio, corante e tampão estão trabalhando para gerar piscando sinal fluorescente. O método pode ser estendido por meio da comparação de precisão de localização e número de métricas médios gerados pela tempestade de otimizar as condições de buffer, configurações de aquisição de imagem e testar diferentes corantes. Em segundo lugar, apresentamos um protocolo simples para a preparação de filamentos de actina em vidro que pode ser facilmente rotulados com conjugados phalloidin-dye. Estes fornecem estruturas ideais para tomar medidas de resolução 27 e normalmente a metade de largura máxima cheia (FWHM)de um filamento é dada como uma estimativa empírica da resolução 37. Deve notar-se que a resolução varia entre as amostras e entre as imagens dentro da mesma amostra por resolução em microscopia de super-resolução à base de localização é uma função do brilho fluoróforo, o ruído de fundo e a densidade de localização 27 e estes não são necessariamente constantes ao longo do espécime. Filamentos de actina são usados ​​para demonstrar artefatos potenciais, como mislocalizations e deriva e como eles podem ser identificados com recursos de software dentro de tempestade. Além disso, descreve-se o uso de marcadores fiduciais fluorescentes para ambos medida e deriva correcta. E em terceiro lugar, a coloração das células com o factor de crescimento epidérmico (EGF), os conjugados de corante é descrito. EGF oferece um útil indicador de desempenho de imagem super-resolução, pois uma parte do receptor na superfície da célula sofre endocitose via vesículas, que são sub-difração de estruturas de tamanho de aproximadamente 50-150 nm de diâmetro 27,38,39.

<table><tbody><tr><td>Labtek Imaging chamberglass</td><td>Fisher</td><td>CBR-166-390E</td><td>Preparação de amostras</td></tr><tr><td>Microscópio invertido </td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>* Veja abaixo as alternativas</td></tr><tr><td>100 X TIRF Lente Objetiva</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td>* Veja abaixo as alternativas</td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>* Veja abaixo as alternativas</td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW - para imagens de corantes Alexa 647 ou Cy5</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>*Software de aquisição (hardware de controle)</td></tr><tr><td>PC </td><td>Dell</td><td></td><td>Windows XP (64 bits), CPU Intel Xeon E5420, 16 GB de RAM *Controle de instrumento e processamento de imagem</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Análise e processamento de imagens <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>rainSTORM</td> Software <td></td> do <td>Laser Analytics Group (Cambridge)</td><td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Running rainSTORM</td><td></td><td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td></tr><tr><td>*Exemplo de microscópios</td><td></td><td></td> STORM/PALM construídos por nós mesmos <td>Consulte também a referência 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</ a></td></tr><tr><td>*Microscópios</td><td></td><td></td> comerciais de super-resolução STORM/PALM <td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Localização Monet) Alternativas aos microscópios autoconstruídos</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Materiais e Equipamento </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1; 2; 3; 4</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1; 2.1</td></tr><tr><td>Dextran-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>Tampão de actina geral</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Filamentos de actina reformada</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Falodina-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Microesferas TetraSpeck (0.1 mícron)</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>VX10500064</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pen/Step</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pratos de plástico</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>Formaldeído - solução a 10% EM grau</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>Sigma</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>Glicerina</td><td>Sigma</td><td>G2289</td><td>5.1; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4"><reagentes fortes>Tabela 2.</fortes></td></tr></tbody></table>

as amostras de teste para otimizar storm super-resolution microscopy

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM é uma técnica de microscopia de super-resolução recentemente desenvolvido com até 10 vezes melhor resolução do que as técnicas de microscopia de fluorescência padrão. No entanto, como a imagem é adquirida de uma forma muito diferente do que o normal, através da construção de uma molécula molécula-por-imagem, existem alguns desafios significativos para os usuários na tentativa de otimizar a sua aquisição de imagem. Para auxiliar neste processo e ganhar mais conhecimento sobre como funciona STORM apresentamos a preparação de três amostras de teste ea metodologia de aquisição e processamento de imagens STORM super-resolução com resoluções típicas de entre 30-50 nm. Através da combinação das amostras de ensaio com o uso de software de processamento de RainStorm livremente disponível, é possível obter uma grande quantidade de informação sobre a qualidade e resolução de imagem. Usando essas métricas então é possível otimizar o procedimento de imagem a partir da ótica, da preparação da amostra, a escolha da tintura, condições de tampão, e as configurações de aquisição de imagem. Temos ummostram exemplos lso de alguns problemas comuns que resultam em má qualidade de imagem, tais como desvio lateral, onde a amostra move-se durante a aquisição da imagem ea densidade relacionada problemas resultantes do fenômeno &#39;mislocalization&#39;.

Descreve-se a preparação de três amostras de teste e de como eles podem ser utilizados para optimizar e avaliar o desempenho dos microscópios tempestade. Usando esses exemplos que mostram como a aquisição de dados brutos e, em seguida, processá-lo para adquirir imagens de super-resolução em células de aproximadamente 30-50 nm resolução.

As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como obter imagens de super-resolução de alta qualidade usando microscopia STORM. Isso é realizado primeiramente preparando uma amostra-teste marcada com fluoróforos. O segundo passo é preparar o tampão de comutação e, em seguida, preencher a câmara de imagem com o tampão.Em seguida, os dados brutos são adquiridos em um microscópio storm. O passo final é reconstruir imagens de super-resolução a partir dos dados brutos utilizando o software de processamento rainstorm. Em última análise, as amostras-teste são usadas para demonstrar como adquirir dados brutos de alta qualidade, os quais podem então ser processados para gerar imagens de super-resolução storm em células com resoluções entre 30 e 50 nanômetros, representando um aumento de resolução de cinco a dez vezes em comparação com técnicas tradicionais de microscopia de fluorescência, incluindo turf e confocal.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque não percebem a importância de coletar muitos vínculos esparsos de alta qualidade. Isso se torna muito mais fácil usando o corante Alexa 6 4 7 no tampão de comutação correto. Uma demonstração visual desta técnica é essencial, pois a obtenção de dados brutos de alta qualidade é fundamental para produzir imagens de resolução SPR.As sequências de vídeo bruto desta técnica parecem completamente diferentes de qualquer outra forma de microscopia de fluorescência. Para iniciar o procedimento de revestimento de vidro com dextrina fluorescente, adicione 200 microlitros de uma solução de polilisina a 0,01% em cada poço de uma lâmina de vidro com oito câmaras e incube por 10 minutos. Após 10 minutos, remova a solução de polilisina com uma pipeta para garantir que nenhum líquido residual permaneça diluído.0,25 microlitros de uma solução estoque de dextrina a dois miligramas por mililitro. Alexa 6 47 em 25 microlitros de água desionizada para criar uma solução a 20 microgramas por mililitro, visando obter um revestimento denso de dextrina. Solução Alexa 6 47.Dilua 20 microlitros da solução de 20 microgramas por mililitro em um volume total de 200 microlitros de água desionizada. Para uma solução de densidade média, dilua dois microlitros em 200 microlitros de água desionizada. Para uma solução de baixa densidade, dilua 0,2 microlitros.Em 200 microlitros de água desionizada, adicione 200 microlitros das soluções diluídas de dextrina Alexis X 47 a cada poço e incube por 10 minutos. Podem ser utilizados tempos de incubação mais longos, o que pode resultar em um revestimento de dextrina mais denso. Por fim, remova as soluções Dexter Xis X 47 e lave com água três vezes.Para preparar filamentos de actina fluorescentes em lâmina de vidro primeiramente, adicione 200 microlitros de solução de polilisina 0,01% a cada poço de uma câmara de oito compartimentos. Cubra o vidro e incube por 10 minutos. Remova com uma pipeta para garantir que nenhum líquido permaneça.Adicione a cada câmara 90 microlitros de tampão geral de actina previamente reconstituído de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione 10 microlitros de solução de filamentos de actina pré-formados a 10 micromolar e um microlitro de foid e Alexa 647 e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar. Incube por 30 minutos à temperatura ambiente para preparar microesferas fluorescentes como marcadores fiduciais. Dilua um microlitro de microesferas tepec em 200 microlitros de PBS e misture. Adicione as microesferas diluídas à câmara de imagem e aguarde 15 minutos.Após 15 minutos, remova a solução e lave três vezes com PBS antes da aquisição de imagens. As células cultivadas até cerca de 80% de confluência são utilizadas neste experimento. Remova o meio de cultura e lave com PBS. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de formaldeído 4% por 10 minutos.Remova a formaldeído e lave três vezes com PBS. Não permita que as células sequem e use sempre soluções tamponadas com PBS. Para evitar estresse hipotônico, adicione dois microlitros de uma solução estoque de 50 microgramas por mililitro de EGF Alexa 647 a 200 microlitros de solução de BSA 0,1%, e então adicione esta solução às células HeLa.Incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Remova a solução e lave três vezes com PBS. Adicione uma solução bloqueadora de 0,1% de BSA e deixe por 15 minutos à temperatura ambiente.Após isso, remova a solução bloqueadora e lave mais três vezes com PBS antes da aquisição de imagens. Imediatamente antes da aquisição, prepare o tampão de comutação misturando as soluções estoque da enzima glicose e do agente redutor em uma proporção de 50 microlitros, 400 microlitros e 100 microlitros, adicionando PBS para completar o volume final até um mililitro. Remova o PBS da câmara de imagem e, em seguida, encha até o topo com o tampão de comutação.Coloque cuidadosamente uma lamínula sobre a parte superior da câmara, certificando-se de que não haja absolutamente nenhuma bolha e de que toda a câmara esteja coberta. Se forem observadas bolhas, complete com tampão adicional ou PBS. Caso contrário, o desempenho do tampão pode diminuir.A coleta de dados de ligação de alta qualidade e esparsos é essencial para o sucesso deste procedimento; portanto, certifique-se de que os microscópios estejam corretamente focados e de que as configurações corretas de aquisição sejam utilizadas. Localize uma estrutura fluorescente de interesse a ser imageada. Selecione o ângulo desejado de iluminação.Neste caso, recomenda-se um ângulo rasante ou altamente inclinado, pois isso melhora a relação sinal-ruído ao minimizar a luz fora de foco, o que é particularmente benéfico para amostras celulares. Adquira uma imagem de referência com resolução limitada por fração da estrutura antes da aquisição por microscopia STORM. Aumente o laser de excitação para uma potência elevada correspondente a aproximadamente dois quilowatts por centímetro quadrado, enquanto realiza a aquisição com configurações da câmera de 10 milissegundos de exposição e um tempo de ciclo de aproximadamente 50 hertz ou quadros por segundo.Uma vez que os quatro grupos de flora tenham passado para um padrão de piscagem esparsa, colete 10.000 quadros. Para iniciar esta reconstrução, abra o arquivo M RAINSTORM dentro do MATLAB e execute-o na janela rainstorm.Selecione o arquivo de imagem a ser analisado usando o botão de navegação. Este deve ser um arquivo TIF. Altere a largura do pixel para corresponder aos dados brutos do sistema de microscopia utilizado para adquirir os dados.Deixe os outros valores como padrão. Pressione o botão processar imagens e aguarde até que uma imagem preliminar apareça. A duração do processamento dependerá do tamanho do arquivo, da especificação do computador e do número de links candidatos nos dados brutos.Para gerar uma imagem atualizada de super-resolução, pressione o botão abrir revisor e uma segunda janela aparecerá. Pressione o botão ajustar contraste para alterar a exibição da imagem conforme desejado. Em alguns casos em que a imagem é muito escura, o valor máximo deve ser reduzido.Utilize a janela do revisor para gerar métricas úteis de qualidade da imagem e refinar ainda mais a imagem de super-resolução. Mantenha os três primeiros parâmetros de controle de qualidade com os valores padrão de 5.000, 0,1 e de 0,8 a 3,5, respectivamente. Atualize o valor de contagens por fóton.Altere o limite de precisão de localização para equilibrar a otimização da localização média, a precisão e o número de localizações. Na imagem final, recomenda-se valores entre 30 e 50 nanômetros, dependendo da qualidade dos dados e da amostra. O fator de escala de reconstrução padrão é cinco, o que gerará pixels de super-resolução de 32 nanômetros, assumindo que o pixel nas imagens originais seja de 160 nanômetros.Se as imagens brutas tiverem um tamanho de pixel de 100 nanômetros, isso produzirá imagens de super-resolução com pixels de 20 nanômetros. Aumente o fator de escala para produzir pixels de super-resolução menores. Na imagem final, pressione o botão executar revisor para gerar uma imagem de super-resolução atualizada.Pressione o botão exibir histogramas para mostrar as métricas de qualidade da imagem. Por fim, pressione o botão salvar imagem no visualizador para salvar todos esses dados. Inicie este procedimento gerando uma imagem da mesma maneira que demonstrado anteriormente.Pressione o botão de rastreamento da caixa no visualizador e clique e arraste uma caixa sobre o marcador fiducial na imagem analisada. Aguarde até que uma nova imagem apareça, a qual exibirá as posições delimitadas. Salve esta imagem, se desejado, caso o objeto de interesse seja um marcador fiducial.Como é o caso aqui, realize a correção de deriva clicando no botão definir âncora, seguido pelo botão subtrair deriva. Por fim, clique novamente em executar revisor para gerar uma nova imagem de tempestade. Um revestimento bem-sucedido de dextrina deve produzir uma monocamada fluorescente, e dados típicos de dextrina são mostrados nesta figura.As imagens com limite de difração mostram diferentes concentrações de dextrina antes da aquisição por STORM. As reconstruções de super-resolução têm um tamanho de pixel de 25 nanômetros. Foram coletadas 10.000 imagens com um tamanho de quadro de 128 por 128 pixels, e quadros individuais são exibidos a partir dessa sequência.Em alta concentração de dextrina. A monocamada fluorescente deve parecer relativamente uniforme, conforme ilustrado nestas imagens e neste segmento de vídeo. Em concentrações mais baixas, os piscarões aparecerão mais esparsos e em foco.Com nenhum fundo aparente durante esta fase de aquisição de imagens com iluminação a laser constante, o número de piscadelas diminuirá com o tempo, conforme ilustrado pela comparação entre o quadro 2000 e o quadro 8.000 na amostra de alta densidade. A principal diferença entre as imagens de super-resolução das concentrações alta, média e baixa de dextrina é a redução no número de localizações. Este gráfico mostra uma média de três sequências de 10.000 quadros de cada concentração de dextrina, onde as barras de erro indicam o desvio padrão.No entanto, essa relação proporcional entre a concentração das moléculas fluorescentes, o número de piscadelas nos dados brutos e o número de localizações não é uma relação simples e linear, conforme ilustrado neste gráfico do número de localizações aceitas por quadro. Utilizando uma média móvel de 100 quadros em densidades muito altas de moléculas, o software é incapaz de localizar com sucesso as moléculas ao imagens qualquer amostra. Um problema comum pode ser a presença de um halo fluorescente brilhante, mas desfocado, ao longo da imagem, causado pela difusão do fluoro no meio.Essas moléculas fluorescentes destacadas podem ser evitadas ou removidas aumentando o número de etapas de lavagem com PBS antes de adicionar o tampão de comutação ou adicionando tampão de comutação fresco à câmara. O processamento e a comparação dos dados de cada sequência de imagens resultam em imagens de super-resolução muito diferentes. Os painéis C e D são reconstruções de imagens de super-resolução correspondentes aos dados coletados nos painéis A e B, respectivamente. Este gráfico representa o número de localizações aceitas por quadro utilizando uma média móvel de 100 quadros.A linha vermelha corresponde às sequências de tempestade A e C, onde há um fundo alto; a linha azul corresponde às sequências B e D, onde o fundo é baixo. O número aceito de localizações para as imagens correspondentes aos dados de fundo alto e baixo é mostrado no segundo gráfico. Essas três imagens com limite de difração mostram dados típicos de filamentos de actina pré-formados aderidos à superfície do vidro antes da adição do tampão de comutação e da aquisição de imagens por microscopia STORM.Podem ser observados filamentos de comprimentos variáveis. Filamentos muito brilhantes frequentemente consistem em vários filamentos emaranhados. A seleção de filamentos individuais relativamente brilhantes, em vez de áreas emaranhadas, resulta em imagens de melhor qualidade durante a fase de aquisição.Devem ser observados piscamentos brilhantes e em foco ao longo do comprimento do filamento. Deve haver piscamentos esparsos durante a fase de aquisição e posteriormente nos dados processados. Deve estar presente um filamento contínuo e fino nas localizações por quadro, que devem mostrar uma diminuição gradual.Normalmente, a largura total na metade do máximo, ou FWHM, de um filamento é fornecida como uma estimativa empírica de resolução, traçando-se uma linha reta através de uma região ampliada do filamento de actina utilizando a função perfil de plotagem no ImageJ e, posteriormente, realizando um ajuste gaussiano. O FWHM é calculado como 43,2 nanômetros. Pode ocorrer um problema de má localização quando vários filamentos de actina estão se ramificando e/ou cruzando uns aos outros, ao processar subconjuntos de quadros e comparar os primeiros e os últimos 5.000 quadros.Uma imagem diferente é produzida na imagem de super-resolução utilizando os primeiros 5.000 quadros. Muitas localizações são observadas no centro da imagem. No entanto, ao usar os últimos 5.000 quadros, muito poucas dessas localizações são aparentes e apenas os filamentos permanecem, embora de forma parcialmente contínua devido ao baixo número de localizações na imagem.Se for suspeita uma densidade de cintilação excessivamente alta, a comparação das imagens com os dados de localização por quadro pode indicar fortemente que esse problema está ocorrendo durante o primeiro conjunto de quadros. Há um número médio de localizações por quadro superior a 10, comparado ao último conjunto de quadros, onde é aproximadamente quatro. Outro problema potencial na microscopia STORM é a deriva, que ocorre quando a amostra se move em relação à lente objetiva durante a fase de aquisição de dados. Embora seja muito difícil detectar durante a aquisição da imagem, a deriva pode ser identificada em imagens de super-resolução de estruturas conhecidas, como filamentos de actina.O primeiro sinal de que pode ter ocorrido deriva lateral é que a estrutura é maior do que o esperado. Por exemplo, com uma largura total em meia altura relativamente grande em comparação com os dados do limite de precisão de chuva, neste caso 90 nanômetros em comparação com 67 nanômetros. Uma maneira melhor de detectar deriva é comparando as localizações em função do tempo, ou seja, verificando se as localizações em quadros posteriores estão deslocadas em relação àquelas em quadros iniciais.Isso pode ser claramente observado no caso dos filamentos de actina quando exibidos com um código de cores. Usando a função de rastreamento de caixas no rainstorm, conforme mostrado nos painéis B e C, as localizações são exibidas com uma cor correspondente ao número do quadro em que foram adquiridas. Por exemplo, localizações obtidas no início da sequência de aquisição são azuis, enquanto localizações obtidas no final da sequência de aquisição são vermelhas.As cores deslocadas indicam que ocorreu deriva, a fim de medi-la e corrigi-la. Para medir a deriva, esferas fluorescentes de 100 nanômetros de diâmetro podem ser utilizadas como marcadores fiduciais; os números de um a quatro mostram esferas recortadas e ampliadas individualmente. Em um exemplo onde há uma deriva relativamente acentuada de aproximadamente 100 nanômetros ao longo de três minutos e 10 segundos durante a fase de aquisição, a mesma função de rastreamento de caixa pode ser usada para codificar por cores e confirmar a ocorrência da deriva, já que todas as quatro esferas neste exemplo apresentaram deriva quase idêntica. Nesse caso, é possível selecionar uma delas — a esfera dois — como referência e subtrair a deriva das outras esferas.Uma comparação com o painel E mostra que a deriva lateral foi corrigida. Por fim, células HeLa marcadas com fator de crescimento epidérmico podem ser utilizadas para fornecer um exemplo realista de resolução de imagem. Nas células, o painel A mostra uma imagem limitada pela difração de uma parte de uma célula HeLa focalizada na superfície basal da célula, onde as caixas amarelas indicam regiões de interesse ampliadas exibidas nos painéis B e C, em contraste com as regiões de interesse ampliadas indistintas na imagem limitada pela difração.As imagens de super-resolução devem mostrar uma mistura de aglomerados e, ocasionalmente, pixels isolados individuais. Os aglomerados terão aproximadamente 100 nanômetros de diâmetro e provavelmente corresponderão a fossas e vesículas em formação. O caminho pelo qual o EGF é predominantemente desregulado e as localizações de endocitose por quadro de dados do Painel D são apresentados no gráfico G. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar algumas amostras de teste simples, adquirir dados e reconstruir imagens de resolução elevada por microscopia STORM.Esses métodos ajudarão a evitar algumas armadilhas comuns de ajuste, como deriva, e contribuirão para otimizar sua tempestade. Veja os experimentos de resolução.

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Research

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Biology

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