Name: Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprenda a localizar proteínas na retina de larvas de zebrafish combinando microscopia de super-resolução e eletrônica de varredura. Este método correlativo oferece precisão nanométrica para estudar organelas subcelulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiamento de íon e RGB: suíço nacional Science Foundation Ambizione-SCORE concede PZ00P3 142404/1 e PZ00P3 163979.

todos os experimentos foram realizados em conformidade com a instrução de ARVO para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisa e foram aprovados pelas autoridades locais.
 1. preparação de seções ultra-finas de Wafers de silício fixação de amostra <ol><li><ol><li>preparar a fixador solução contendo 0,1% de glutaraldeído, formaldeído de 4% em tampão de cacodylate de 0,1 M. 
		Nota: cuidado! Tenha cuidado ao trabalhar com glutaraldeído, formaldeído e cacodylate buffer, usar equipamento de protecção adequado e trabalhar em uma coifa.</li>
		<li>Eutanásia em 5 dias pós-larvas fertilização (5 dpf) zebrafish com metanosulfonato (Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo, 0,4% p/v em PBS (tampão fosfato pH salino, 7)) como descrito anteriormente 15.</li>
		<li>Corrigir as larvas por imersão em solução de fixador pré-refrigerada no gelo. Retire a cabeça e incubar durante uma noite a 4 ° C, com balanço suave.</li>
		<li>Dissecar os olhos por aparar o tecido ao redor dos olhos, usando a pinça fina e um bisturi microdissection (sob um binóculo) em solução fixador refrigerada no prato com camas agarose 1%. Transfira os olhos para um tubo com fixador pre-refrigerado fresco.</li>
		<li>Lavar duas vezes em PBS (tampão fosfato pH salino, 7,4) por 5 min cada lavagem à temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol></li> <li>Infiltração de gelatina e montagem <ol><li>aquecer 15ml comida local marca gelatina 12% p/v em PB (tampão fosfato, 0,1 M pH 7,4) a 40 ° C. Retire a PBS e adicionar a solução de gelatina para os tubos contendo os olhos. Toque o tubo delicadamente para garantir as infiltrações de gelatina a amostra e incubar por 10-30 min a 40 ° C em uma thermoblock com agitação suave ou em banho-maria.</li>
		<li>Preencher 12 x 5 x 3 mm silicone ou polietileno liso incorporação moldes com gelatina quente em um banho de água de 40 ° C. Adicionar dois olhos por molde utilizando uma pipeta, alinhá-las corretamente sob um binóculo usando uma agulha de dissecação e deixe a gelatina arrefecer à temperatura ambiente por 1 min e endurecer a 4 ° C por 20 min.</li>
		<li>Re-aparar o bloco de gelatina sob o binóculo para caber um olho por bloco usando uma lâmina de barbear.</li>
		<li>Transferir os olhos de gelatina incorporado para 2,3 M de sacarose em PB no gelo. Incubar durante uma noite a 4 ° C.</li>
		<li>Exchange nova solução de sacarose de 2,3 M e loja em 4 ° C ou a-20 ° C; após esta etapa, as amostras estão prontas para corte ou pode ser armazenadas a-20 ° C durante várias semanas a meses.</li>
		<li>Re-apare o bloco de gelatina para quase do tamanho do olho antes de transferir para um crio-pin. Congelamento em nitrogênio líquido e transferência para uma crio-ultramicrotome.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>corte 110 nm de espessura-seções-120 ° c, com uma faca de diamante no cryo-ultramicrotome.</li>
		<li>Escolher as secções com um loop com fios contendo uma gota de metilcelulose 2% (em água) e solução de sacarose de 2,3 M (1:1). Transferi as seções de uma bolacha de silicone 7 x 7 mm. Armazenar as seções em 4 ° C até posterior processamento.</li>
	</ol></li></ol> 2. Encontrava <ol><li>bolachas de lavagem com PBS a 0 ° C por 20 min em quatro gotas colocando as bolachas de cabeça para baixo sobre as gotas. Lavagem em PBS 2 x 2 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar 3 vezes em glicina de 0,15% em PBS, por 1 min cada. Lavar 3 x por 1 min/lavagem com PBS. Pre-incubate com PBG (PBS com BSA de albumina de soro bovino 0,5% e 0,2% gelatina tipo B) 5 min.</li>
	<li>Incubar com coelho anti-Tom20 (veja a Tabela de materiais) em PBG (4 µ g/mL) por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar 6 x 1 min/lavagem de PBG. Pre-incubate com PBG durante 5 min à RT. Incubar com Alexa 647 F(ab&#39;) de anti-coelho 2 (ver a Tabela de materiais) em PBG (7,5 µ g/mL) por 30 min.</li>
	<li>Lavar 6 x 1 min/lavagem de PBG. Lave 3 x 2 min em PBS. Incube com DAPI (4 µ g/mL) em PBS por 10 s. lavagem 2 x 2 min em PBS.</li>
</ol> 3. Microscopia de super-resolução <ol><li>incubar a bolacha brevemente (10 s) por colocá-lo em uma gota de uma solução de 1:1 do glicerol (80%) e imaging tampão contendo oxigênio eliminação sistema (200mm tampão fosfato contendo 10% de glicose, 0,5 mg/mL glucoseoxidase, 40 catalase µ g/mL, beta-mercaptoethylamine cloridrato de 15mm (MEA HCL), pH 8.0).</li>
	<li>Transferir as bolachas (seção voltada para baixo) para um prato de Petri vidro inferior (espessura 170 ± 5 µm) para uma gota fresca da mistura 1:1 do glicerol (80%) e imaging tampão (como na etapa 3.1).</li>
	<li>Remover de todos os lados, com uma pipeta, maior parte do líquido por baixo a bolacha. Use listras do silicone para consertar a bolacha para o fundo da caixa de Petri. 
	Nota: Listras de Silicone são feitas de silicone do dois-componente-cola (3 x 12 mm).</li>
	Seções de <li>imagem em um microscópio invertido usando uma abertura numérica elevada (por exemplo, 160 X / at 1,43; consulte a Tabela de materiais) óleo imersão super resolução dedicado objetivo. Antes da imagem, deixe a amostra equilibrar a temperatura do microscópio, a fim de minimizar/reduzir o desvio lateral e axial.</li>
	<li>Centro da área de interesse e adquirir primeiro widefield epifluorescência imagens de referência. Mudar para o modo de operação do super resolução. Ajustar o tempo de exposição da câmera para 15 ms e definir o elétron ganho (EM) o máximo de 300 a multiplicar-se.</li>
	<li>Amostra de iluminar com o 642 nm onda contínua do laser na potência máxima do laser (correspondente a ~2.8 kW/cm 2) no modo de epifluorescência. Assim que a molécula pisca bem são separados em cada quadro, para que a probabilidade é baixa, que sinais individuais se sobrepõem, definir a potência do laser para ~0.7 kW/cm 2. Gravar a imagem raw no modo de epifluorescência através da aquisição de um mínimo de 30.000 frames. 
	Nota: Todos estes parâmetro pode variar dependendo de espécimes diferentes e rotulagem densidades.</li>
	<li>De dados brutos, gerar uma lista de eventos de reconstrução (localizações de cada molécula blink na imagem raw) usando um limite de deteção de 30 fótons (precisa ser ajustada de acordo com a amostra) clicando &#34; avaliar &#34; no &#39; t-series análise &#39; sob &#39; Tools &#39;.</li>
	<li>Visualizar a imagem de super resolução por encaixe Gaussian 16 aplicando um tamanho de pixel de renderização de 4 nm clicando &#34; criar imagem &#34; no &#39; painel de processamento de lista de evento &#39; sob &#39; ferramentas. &#39; 
	Nota: Para gerar a imagem super resolvida as ferramentas de software integrado do sistema utilizado neste estudo foram utilizadas. No entanto, a imagem descrita super resolução poderia ser executada em qualquer outro sistema de localização baseado única molécula, e os dados poderiam ser processados com ferramentas de software de código aberto como tempestade 17.</li>
</ol> 4. Sombreamento de platina <ol><li>remover listras de silício e adicionar uma gota de PBS perto das bordas do wafer para levantá-la da caixa de Petri. Lave o wafer 2 x 2 min em PBS, então post corrigi-lo com 0,1% de glutaraldeído em PBS por 5 min. Lave 2 x por 2 min/lavagem em PBS.</li>
	<li>Incubar a bolacha duas vezes por 5 min/incubação em 1 gota de metilcelulose 2% na água, no gelo. Inserir a hóstia num tubo de centrífuga e centrifugar a 14.100 x g durante 90 s. montagem-em um esboço de alumínio SEM com realização de cimento carbono.</li>
	<li>Adicionar uma camada de 2 a 10 nm de platina/carbono na amostra pelo sombreamento giratório 8 ° usando um elétron feixe configurações de dispositivo de evaporação: 1,55 kV, 55 mA, com 0,3 nm/s e um ângulo de 8°, nível de rotação 4.</li>
</ol> 5. Microscópio eletrônico de varredura <ol><li>seções de imagem com digitalização em um elétron microscope em 1.5 kV, 2 funcional à distância e com um em lente detector de elétron secundário.</li>
</ol> 6. Alinhamento de luz e microscopia eletrônica de imagens <ol><li>abrir os dois tipos de imagens com Fiji 18 clicando &#34; arquivo | Aberto &#34;. Ajustar o tamanho da tela clicando &#34; imagem | Ajustar | O tamanho da lona &#34; e trazer as duas imagens para uma pilha clicando &#34; imagem | Pilhas | Imagens a pilha &#34;. Salve a pilha como tipo de arquivo tiff.</li>
	<li>Em Fiji, abra uma nova interface de 19 TrackEM2 clicando em &#34; arquivo | novo | TrackEM2 (novo) &#34;. Importar a pilha com ambas as imagens, clique com o botão direito na janela preta e selecionando &#34; pilha Import &#34;.</li>
	Imagem de microscopia <li>luz de alinhar a imagem de microscopia eletrônica manualmente com Marcos usando um clique direito do mouse sobre a imagem e selecionando &#34; Align | Alinhar a camada manualmente com Marcos &#34;.
	<ol><li>Escolher Selecionar ferramenta (seta preta) para adicionar pontos de referência. Use a forma dos núcleos como referência para selecionar as bordas da mesmas em ambas as imagens (complementar a Figura 1). Adicione vários pontos (mínimos três pontos precisam ser selecionados). Aplicar o alinhamento com um modelo afim por direito do mouse, clicando e selecionando &#34; aplicar transformação | Modelo afim &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Alterar a transparência de camada (ver Figura complementar 1) para avaliar a qualidade do alinhamento.</li></ol>

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Fölling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209(2013).</li>
<li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li>
<li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beams+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149(2013).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Gen%22%5BJournal%5D)">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575(2015).</li>
<li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062(2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17947990">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este método combina localização de proteína super resolvido com informações de contexto para determinar a posição exata de proteínas em uma organela. Vamos demonstrar aqui a conclusão do experimento para visualizar a expressão de Tom20 na membrana externa da mitocôndria e sua relação com outros organelos como núcleos ou segmentos exteriores do fotoreceptoras na retina zebrafish larval.
Tokuyasu cryo-seccionamento requer algum treinamento para adquirir seções bem preservadas. No entanto, este é um método utilizado em muitos laboratórios com sucesso demonstrado21. Transferência das seções para o wafer de silício é muito simples e sem considerações especiais são necessárias. O uso de glicerol no buffer de imagem é um passo muito importante para evitar a secagem das seções. Para a imagem latente de super-resolução os melhores resultados são obtidos quando a hóstia é muito perto do fundo do vidro da caixa de Petri. As listras do silicone ajudam mantendo a bolacha nesta posição. Especial tem que ser tomado ao remover as listras para evitar danificar as seções.
A espessura das cryo-seções, cerca de 100 nm, mais fino do que a resolução óptica na dimensão Z, além disso facilita a precisão deste método correlativo como o sinal de microscopia de super-resolução está vindo só esta fina camada e a microscópio eletrônico de varredura sinal está exibindo a topografia da amostra. Esse método também pode ser combinado com imagem multicolor. No entanto, especial deve ter cuidado que a amostra pode ser fotografada nas mesmas condições (por exemplo, buffer de imagem) e conversas cruzadas devem ser impedidas.
Uma limitação do método é sua bidimensional aproximar-se, porque apenas um número limitado de seções seriais (aproximadamente 3 a 7 por bolacha) pode ser coletado. Assim, projetos para lidar com análise de volume não seria o ideais. No entanto, é um método que pode ser aplicado para detectar a expressão da proteína em qualquer tipo de tecido secionando simples da amostra. Nós fornecemos um método sem uso de agentes de contraste clássico como citrato de uranilo acetato ou chumbo. O contraste sombreamento platina fornece contraste topográfico muito informativo, mas em alguns casos, as membranas são difíceis de resolver. Isso pode causar problemas para projetos que precisam, por exemplo, determinar a expressão de proteínas em pequenas vesículas.
Nosso protocolo, baseado em Tokuyasu cryo-seções, usa equipamento padrão para obter resultados correlativos de super-resolução e microscópios de varredura. A coleção de seções em pastilhas de silício e o uso de platina para contraste são passos simples para fornecer estabilidade e reprodutibilidade para a preparação da amostra.

Métodos para determinar a Localização subcellular das proteínas e sua relação com diferentes compartimentos da célula são ferramentas essenciais para entender suas funções e interações possíveis. Microscopia de super-resolução em combinação com microscopia eletrônica fornece tais informações1. Microscopia de depleção do estado fundamental seguida por retorno de molécula individual (GSDIM) é uma tecnologia de super-resolução microscopia compatível com uma vasta gama de orgânicos e geneticamente codificado fluorophores2 e atinge uma resolução lateral até 20 nm 3. a incorporação de métodos com maior resolução do que o padrão de difração limitada microscopia melhora a precisão da correlação4,5,6. Recomenda-se para alcançar a melhor correlação da expressão da proteína com um compartimento subcelular específico e para reduzir o volume de incerteza7 o uso da mesma seção ultrafino de luz e microscopia eletrônica. Entre os diferentes métodos de corte, Tokuyasu cryo-seção protocolo não requer desidratação ou incorporação de resina e, além disso, preserva a antigenicidade de muitos epítopos e fornece bom tecido ultraestrutura8. Vários métodos têm demonstrado a aplicabilidade destas seções no correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM)4,5,9,10.
A retina de zebrafish é um modelo valioso para estudar o desenvolvimento visual e mecanismos de doenças humanas, dados a sua função e estrutura altamente conservada em vertebrados. Na exibição de fotorreceptores da retina, particular a mesma arquitetura de fotorreceptores dos mamíferos, com uma sinapse basal, um núcleo ápico-basalmente alongada, agrupamento de mitocôndrias em segmento apical mais interno e um segmento externo composto de membrana discos na posição mais apical11. A localização da proteína para os diversos compartimentos celulares é conservada entre zebrafish e humana, permitindo que a investigação da função biológica de proteínas humanas relevantes doença12,13.
Aqui nós apresentamos um protocolo para preparar zebrafish larval amostras de retina para resolver a localização da proteína da membrana mitocondrial externa Tom20 pelo correlativo Super-resolução luz e microscopia eletrônica. O método baseia-se na coleta de cryo-seções em pastilhas de silício e contraste de obtenção de informações topográficas produzidas após a aplicação de uma fina camada de platina. Estes passos são técnicas claras melhorias em termos de facilidade de uso, reprodutibilidade e tempo para completar as experiências. Recentemente Demonstramos a aplicabilidade do método para detectar os poros nucleares e mitochondrial proteínas no rato tecido14.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído EM Grau</td><td>EMS, EUA#</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Moldes</td> <td>planos para embutirBEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de marca de alimentos locais</td><td>Dr.Oetker</td><td>Extra Gold</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Merck</td> <td># 1.07687</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina tipo B</td><td>Sigma</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>Bolacha de silício</td><td>Si-Mat Tipo de materiais</td><td></td> de silício: <td>P / Boro; Orientação < 111> EM; Método de crescimento: CZ; Resistividade: 1-30 ohm / cm; Superfície: polido; Corte a laser a 7 x7 mm</td></tr><tr><td>Cryo-pin</td><td>Baltic Preparation</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>Loop com fio "Perfect loop"</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Listras de silicone</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G8270</td><td></td></tr><tr><td>glucoseoxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#C40</tr><tr><td>cloridrato de beta-mercaptoetilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tom20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragmento de burro anti coelho IgG</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, Suíça</td><td>#10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri com fundo de vidro</td><td>Ibidi, Alemanha</td><td>u-Dish 35mm, fundo de vidro alto, #81158</td><td></td></tr><tr><td>SEM ponta de alumínio</td><td>Agar Scientific</td><td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>Cimento de carbono condutor Leit-C</td><td>Plano, Alemanha</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td><td>Diatomáceo</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>Crio-ultramicrótomo</td><td>Leica Microsystems Leica</td><td>EM FCS</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Widefield-TIRF GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>160x 1,43 objetiva TIRF</td><td>Leica Microsystems</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td><td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td><td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

correlativa super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na retina de zebrafish

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Apresentamos um método para investigar a localização Subcellular da proteína na retina zebrafish larval combinando fotomicroscopia Super-resolução e microscopia eletrônica. As capacidades de resolução de limite de difração sub de microscópios de luz super-resolução permitem melhorar a precisão dos dados correlacionados. Brevemente, 110 nanômetros grosso cryo-seções são transferidas para um wafer de silício e, após coloração de imunofluorescência, são fotografadas por microscopia de luz super resolução. Posteriormente, as seções são preservadas em metilcelulose e platina sombreado antes da imagem em um microscópio eletrônico de varredura (MEV). As imagens destas duas modalidades de microscopia são mescladas facilmente usando Marcos de tecido com software de código aberto. Aqui descrevemos o método adaptado para a retina de zebrafish larval. No entanto, este método também é aplicável a outros tipos de tecidos e organismos. Vamos demonstrar que as informações complementares obtidas por esta correlação são capazes de resolver a expressão de proteínas mitocondriais em relação com as membranas e cristas de mitocôndrias, bem como para outros compartimentos da célula.

A expressão da proteína Tom20, uma subunidade da translocase membrana mitocondrial externa complexa20, foi determinada, em seções finas da retina zebrafish larval, por microscopia de luz de super-resolução (Figura 1) e esta informação foi complementado com o sinal topográfico obtido por microscopia eletrônica após platina sombreamento das mesmas seções. Estes dados correlativos confirmam a localização de uma proteína em associação com um compartimento específico, a membrana mitocondrial externa e, além disso, fornecer informações sobre a relação da proteína com outras organelas da célula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
Figura 1: CLEM na retina de zebrafish. R. imagem de widefield baixa ampliação de 5 dpf uma seção da retina de zebrafish, núcleos corados com DAPI (ciano). B. microscopia eletrônica da mesma área. C. imagem de widefield ampliação mais elevada de quadro em B. núcleos corados com DAPI (ciano) e Tom20 mitocondrial mancha aparece em vermelho. M. Widefield imagem de mesma seção no maior ampliação. O padrão de expressão Tom20 é em clusters de mitocôndrias. E. expressão de Tom20 (pontos vermelhos) detectado por microscopia GSDIM. Núcleos corados com DAPI (ciano). F. mesma seção como E combinando correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica. Tom20 coloração (pontos vermelhos) aparece no cluster mitocondrial (M) no exteriores membranas das mitocôndrias. Sinal de fluorescência DAPI nos núcleos (N) corresponde com a topografia da imagem SEM. G. imagem de alta ampliação de quadro em F. A imagem de microscopia eletrônica a digitalização fornece o contexto para a imagem GSDIM (pontos vermelhos). Cristas mitocondriais são claramente visíveis e a coloração de Tom20 está localizada a exterior nas membranas das mitocôndrias. As membranas do segmento externo os fotorreceptores (OS) são claramente resolvidos. Imagem pixel tamanho 5 nm. Barras de escala: A, B e c: 10 µm; D: 2 µm; E e f: 1 µm e g: 0,2 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar Figura 1: alinhamento de imagens de luz e microscopia eletrônica. A. Screenshot da interface TrackEM2 com imagem SEM e Marcos numerados (amarelos) ao longo de diferentes núcleos. B. Screenshot da interface TrackEM2 com imagem de fluorescência e Marcos numerados (amarelo) ao longo de diferente DAPI manchado de núcleos. Para alterar a transparência de camada podem ser usados os controles deslizantes na parte superior esquerda do menu. Barra de escala: 1 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve as etapas necessárias para obter resultados de localização Subcellular da proteína na retina de zebrafish, correlacionando a microscopia de luz super resolução e imagens de microscopia eletrônica de varredura.

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

O objetivo geral deste método de microscopia é localizar com precisão a expressão proteica em relação a diferentes organelas subcelulares na retina de filhotes de peixe-zebra, correlacionando imagens de microscopia de super-resolução e de microscopia eletrônica de varredura. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais nas áreas de desenvolvimento retiniano e de vias celulares, como o estudo da deslocalização proteica em mutantes. A principal vantagem desta técnica é que ela combina super-resolução com microscopia eletrônica de varredura para obter dados altamente precisos de localização proteica dentro do contexto estrutural da amostra.A coleta de cortes de Tokuyasu em lâminas de silicone facilita substancialmente o manuseio, e o uso de sombreamento com platina para contraste fornece uma boa topografia da amostra. Assim, este método pode fornecer informações sobre estudos da retina de larvas de peixe-zebra. Uma de suas principais vantagens é que também pode ser aplicado a muitos outros sistemas biológicos, como a identificação da expressão proteica em tecido de camundongo.Após dissecar os olhos de larvas de peixe-zebra fixadas de acordo com o protocolo descrito no texto, aqueça 15 mililitros de gelatina a 12% da marca local de alimento em PBS a 40 graus Celsius. Em seguida, aspire o PBS dos tubos contendo os olhos e adicione a solução de gelatina. Bata suavemente no tubo para garantir que a gelatina infiltre a amostra e incube por 10 a 30 minutos a 40 graus Celsius em um bloco térmico com agitação suave ou em banho-maria.Em um banho-maria a 40 graus Celsius, preencha moldes planos de inclusão de silicone ou polietileno com 12 por cinco por três milímetros com gelatina morna. Em seguida, usando uma pipeta, adicione dois olhos por molde e, sob um microscópio estereoscópico, utilize uma agulha de dissecação para alinhá-los corretamente. Após deixar a gelatina esfriar à temperatura ambiente por um minuto, coloque-a a quatro graus Celsius por 20 minutos para endurecer.Sob o microscópio estereoscópico, use uma lâmina de barbear para cortar novamente o bloco de gelatina, ajustando-o para acomodar um olho por bloco. Transfira os olhos embutidos em gelatina para sacarose 2,3 molar em PBS sobre gelo. Incube as amostras a quatro graus Celsius durante a noite.Em seguida, substitua as amostras por solução fresca de sacarose 2,3 molar. E armazene o tecido a quatro graus Celsius, ou a menos 20 graus Celsius para armazenamento de até vários meses. Retalhe novamente o bloco de gelatina para um tamanho quase igual ao do olho antes de transferi-lo para um pino criogênico.Em seguida, congele o bloco em nitrogênio líquido e transfira-o para um criomicrotomo ultramicrotômico. Usando uma lâmina de diamante no criomicrotomo ultramicrotômico, corte seções de 110 nanômetros de espessura a menos 120 graus Celsius. Recolha as seções com uma alça metálica contendo uma gota de solução de 2% de metilcelulose e 2,3 molar de sacarose.Em seguida, transfira as seções para uma pastilha de silicone de sete por sete milímetros. Para lavar as pastilhas, pipete quatro gotas e coloque as pastilhas de cabeça para baixo sobre as gotas. Incube as pastilhas sobre as gotas a zero graus Celsius por 20 minutos.Em seguida, lave as pastilhas duas vezes em PBS à temperatura ambiente, durante dois minutos cada vez. Incube as amostras três vezes em glicina 0,15% em PBS, durante um minuto cada vez. Em seguida, use PBS para lavar as amostras três vezes, durante um minuto por lavagem.Pré-incubar o tecido com PBG durante cinco minutos. Em seguida, adicionar anti-Tom20 de coelho em PBG às seções. E incubar as lâminas à temperatura ambiente por 30 minutos.Com o PBG, lave o tecido seis vezes, durante um minuto por lavagem. Em seguida, pré-incube as amostras com PBG à temperatura ambiente por cinco minutos. Substitua o PBG por fragmentos divalentes de Fab anti-coelho conjugados com Alexa 647 em PBG e incube por 30 minutos.Lave as amostras com PBG seis vezes, durante um minuto por lavagem. Em seguida, use PBS para lavar as pastilhas três vezes, durante dois minutos cada. Adicione DAPI e PBS às pastilhas e incube por 10 segundos.Em seguida, use PBS para lavar as amostras duas vezes, durante dois minutos cada. Coloque a pastilha sobre uma gota de uma solução um para um de glicerol 80% e tampão de imagem contendo um sistema de eliminação de oxigênio e incube brevemente. Transfira as pastilhas, com o lado do tecido voltado para baixo, para uma nova gota da mistura um para um de glicerol 80% e tampão de imagem em uma placa de Petri com fundo de vidro.Use uma pipeta por todos os lados para remover a maior parte do líquido sob a lâmina. Em seguida, use tiras de silicone para fixar a lâmina ao fundo da placa de Petri. Coloque as seções montadas em um microscópio invertido com uma objetiva de imersão em óleo de alta abertura numérica.Antes da aquisição de imagens, deixe a amostra equilibrar à temperatura do microscópio para minimizar ou reduzir a deriva lateral e axial. Centralize a área de interesse e adquira imagens de referência de campo amplo em epifluorescência. Altere para o modo de operação de super-resolução.Ajuste o tempo de exposição da câmera para 15 milissegundos e configure o ganho de multiplicação eletrônica no valor máximo de 300. Em seguida, ilumine a amostra em modo epifluorescência com o laser de 642 nanômetros na potência máxima do laser. Assim que os piscamentos de molécula única estiverem bem separados em cada quadro, de modo que a probabilidade de sobreposição de sinais individuais seja baixa, reduza a potência do laser para quase 1/3.Registre a imagem bruta em epifluorescência adquirindo no mínimo 30.000 quadros. A partir dos dados brutos, em Ferramentas, análise de série temporal, utilize um limiar de detecção de 30 fótons. Clique em Avaliar para gerar uma lista de eventos de localização.Em Ferramentas, no painel Processamento da Lista de Eventos, clique em Criar Imagem para visualizar a imagem de super-resolução por ajuste gaussiano, aplicando um tamanho de pixel de renderização de quatro nanômetros. Remova as tiras de silicone e adicione uma gota de PBS próximo às bordas da pastilha para levantá-la da placa de Petri. Após lavar a pastilha duas vezes com PBS, por dois minutos cada, use glutaraldeído 0,1% em PBS para pós-fixá-la por cinco minutos.Em seguida, lave a amostra novamente duas vezes, por dois minutos cada lavagem, em PBS. Incube a pastilha em uma gota de 2% de metilcelulose em água no gelo, duas vezes, por cinco minutos cada incubação. Em seguida, insira a pastilha em um tubo de centrífuga e centrifugue a 14.100 ×g por 90 segundos.Após a centrifugação, utilize cimento condutor de carbono para montar a lâmina em um suporte de alumínio SEM. Usando um equipamento de evaporação por feixe de elétrons, adicione uma camada de dois a 10 nanômetros de carbono de platina na amostra por sombreamento rotativo com as seguintes configurações. Imagem das seções com um microscópio eletrônico de varredura a 1,5 quilovolts, distância de trabalho de dois milímetros e com um detector de elétrons secundários no interior da lente.Use o Fiji para abrir imagens de microscopia óptica e eletrônica clicando em Arquivo, Abrir. Ajuste o tamanho da tela clicando em Imagem, Ajustar, Tamanho da Tela. Em seguida, combine as duas imagens em uma pilha clicando em Imagem, Pilhas, Imagens para Pilha.No Fiji, abra uma nova interface de rastreamento EM2 clicando em Arquivo, Novo, Nova rastreamento EM2. Importe a pilha com ambas as imagens clicando com o botão direito na janela preta e selecionando Importar pilha. Alinhe manualmente a imagem de microscopia de luz à imagem de microscopia eletrônica usando marcos anatômicos, clicando com o botão direito na imagem e selecionando Alinhar, Alinhar camada manualmente com marcos anatômicos.Escolha a ferramenta Selecionar para adicionar marcos. Utilize a forma dos núcleos como referência para selecionar as mesmas bordas em ambas as imagens e adicionar diversos pontos. Aplique o alinhamento com um modelo afim clicando com o botão direito e selecione Aplicar transformação, Modelo Afim.Por fim, altere a transparência da camada para avaliar a qualidade do alinhamento. Este painel mostra uma imagem de campo amplo em baixa ampliação de uma seção retiniana de peixe-zebra com cinco dias pós-fertilização. A mesma área é mostrada aqui por microscopia eletrônica de varredura.Essas imagens com maior aumento mostram marcação de Tom20 em vermelho com aglomerados nas mitocôndrias. A expressão de Tom20 é mostrada aqui conforme detectada por microscopia GSDIM. Nesta imagem, a mesma seção combina microscopia eletrônica de varredura e super-resolução correlativa.A marcação de Tom20 aparece dentro do agrupamento mitocondrial nas membranas externas das mitocôndrias. O sinal de fluorescência de DAPI nos núcleos corresponde à topografia da imagem de MEV. Esta imagem de MEV fornece contexto para a marcação de Tom20 na imagem GSDIM.As cristas mitocondriais são claramente visíveis, e a marcação de Tom20 está localizada nas membranas externas das mitocôndrias. As membranas do segmento externo dos fotorreceptores são claramente resolvidas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de otimizar ao máximo os parâmetros de marcação e de imagem.Apenas amostras rotuladas de forma ideal são adequadas para super-resolução. As amostras nunca devem secar em nenhum momento durante o procedimento de marcação. Este procedimento pode ser estendido à imunofluorescência com dupla marcação, permitindo assim a localização de duas proteínas diferentes dentro de uma estrutura específica.No caso de amostras mais complexas, recomenda-se o uso de marcadores fiduciais para obter um alinhamento preciso das imagens. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar estudos correlativos para localizar proteínas em relação às diferentes organelas da célula em uma amostra de tecido complexa com precisão de super-resolução.

correlative-super-resolution-electron-microscopy-to-resolve-protein

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este artigo descreve uma abordagem para microdissect retinas zebrafish com e sem epitélio pigmentar da retina em anexo, 1-3 embriões dia postfertilization.

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Neste vídeo, técnicas de imagem multicolor de lapso de tempo confocal e ablação de células alvo são fornecidos. Lapso de tempo de imagem é usado para monitorar o comportamento de vários tipos de células de...

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Introduzimos um método eficiente para rotular retrógrados as células ganglionares da retina (RGCs) em peixes-zebra adultos.

Marcação retrógrada de células ganglionares da retina em Zebrafish Adulto com corantes fluorescentes

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

A microscopia eletrônica 2D em larga escala (EM), ou nanotomia, é a aplicação em todo o tecido da resolução em nanoescala. Aqui descrevemos um método universal de nanotomia aplicado para investigar o cérebro larval do peixe-zebra na saúde e em lesões cerebrais não invasivas.

Transmissão de digitalização em grande escala Electron Microscopy (Nanotomy) de saudável e Ofendidos Zebrafish Cérebro

A microscopia de fluorescência de folha de luz é uma excelente ferramenta para imagens do desenvolvimento embrionário. Permite a gravação de filmes de longo lapso de tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas. Demonstramos sua aplicação para o desenvolvimento de imagens do olho do peixe-zebra em amplas escalas espaço-temporais e apresentamos um pipeline para fusão e deconvolução de conjuntos de dados multiview.

Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Estes protocolos foram desenvolvidos para analisar a morfologia da lente cortical, a integridade estrutural das suturas da lente do zebrafish em lentes fixas e vivas e para medir a posição do núcleo da lente do zebrafish ao longo do eixo anterior-posterior.

Avaliação da localização do núcleo da lente de zebrafish e integridade sutural

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.

Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada

Aprenda a localizar proteínas na retina de larvas de zebrafish combinando microscopia de super-resolução e eletrônica de varredura. Este método correlativo oferece precisão nanométrica para estudar organelas subcelulares.

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

Explorar mais vídeos