Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

Este protocolo descreve as etapas necessárias para obter resultados de localização Subcellular da proteína na retina de zebrafish, correlacionando a microscopia de luz super resolução e imagens de microscopia eletrônica de varredura.

O objetivo geral deste método de microscopia é localizar com precisão a expressão de proteínas em relação a diferentes organelas subcelulares na retina larval do peixe-zebra, correlacionando imagens de super-resolução e microscopia eletrônica de varredura. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no desenvolvimento da retina e nos campos da via celular, como o estudo da má localização de proteínas em mutantes. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina super-resolução com microscopia eletrônica de varredura para obter dados de localização de proteínas altamente precisos dentro do contexto estrutural da amostra.

A coleta de seções Tokuyasu em wafers de silicone facilita substancialmente o manuseio e o uso de sombreamento de platina para contraste fornece uma boa topografia da amostra. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre os estudos de retina de larvas-zebra. Uma de suas principais vantagens é que também pode ser aplicado a muitos outros sistemas biológicos, como a identificação da expressão de proteínas no tecido de camundongos.

Depois de dissecar os olhos das larvas fixas de peixe-zebra de acordo com o protocolo de texto, aqueça 15 mililitros de gelatina de marca de alimentos locais a 12% em PBS a 40 graus Celsius. Em seguida, aspire o PBS dos tubos dos olhos e adicione a solução de gelatina. Bata suavemente no tubo para garantir que a gelatina se infiltre na amostra e incube-a por 10 a 30 minutos a 40 graus Celsius em um termobloco com agitação suave ou em banho-maria.

Em um banho-maria de 40 graus Celsius, preencha os moldes de incorporação plana de silicone ou polietileno de 12 por cinco por três milímetros com gelatina quente. Em seguida, usando uma pipeta, adicione dois olhos por molde e, sob um binóculo, use uma agulha de dissecção para alinhá-los adequadamente. Depois de deixar a gelatina esfriar em temperatura ambiente por um minuto, coloque-a a quatro graus Celsius por 20 minutos para endurecer.

Sob o binóculo, use uma lâmina de barbear para aparar novamente o bloco de gelatina para caber em um olho por bloco. Transfira os olhos embebidos em gelatina para sacarose 2,3 molares em PBS no gelo. Incube as amostras a quatro graus Celsius durante a noite.

Em seguida, troque as amostras por uma solução fresca de sacarose 2,3 molares. E armazene o tecido a quatro graus Celsius, ou menos 20 graus Celsius para armazenamento por vários meses. Apare novamente o bloco de gelatina para quase o tamanho do olho antes de transferi-lo para um pino criogênico.

Em seguida, congele o bloco em nitrogênio líquido e transfira-o para um crio-ultramicrótomo. Usando uma faca de diamante no crio-ultramicrótomo, corte seções de 110 nanômetros de espessura a menos 120 graus Celsius. Escolha as seções com um laço de arame contendo uma gota de solução de sacarose a 2% de metilcelulose e 2,3 molares.

Em seguida, transfira as seções para um wafer de silicone de sete por sete milímetros. Para lavar as bolachas, pipete quatro gotas e coloque as bolachas de cabeça para baixo sobre as gotas. Incube as bolachas nas gotas a zero graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, lave os wafers duas vezes em PBS em temperatura ambiente por dois minutos cada. Incube as amostras três vezes em glicina a 0,15% em PBS por um minuto cada. Em seguida, use PBS para lavar as amostras três vezes por um minuto por lavagem.

Pré-incube o tecido com PBG por cinco minutos. Em seguida, adicione coelho anti-Tom20 em PBG às seções. E incube os wafers em temperatura ambiente por 30 minutos.

Com PBG, lave o lenço seis vezes por um minuto por lavagem. Em seguida, pré-incubar as amostras com PBG à temperatura ambiente durante cinco minutos. Substitua o PBG por fragmentos Fab divalentes anti-coelho Alexa 647 em PBG e incube por 30 minutos.

Lave as amostras em PBG seis vezes por um minuto por lavagem. Em seguida, use PBS para lavar as bolachas três vezes por dois minutos. Adicione DAPI e PBS aos wafers e incube por 10 segundos.

Em seguida, use PBS para lavar as amostras duas vezes por dois minutos cada. Coloque o wafer em uma gota de uma solução de um para um de glicerol a 80% e tampão de imagem contendo um sistema de eliminação de oxigênio e incube-o brevemente. Transfira os wafers, com o lado do tecido voltado para baixo, para uma gota fresca da mistura de 80% de glicerol e tampão de imagem em uma placa de Petri com fundo de vidro.

Use uma pipeta de todos os lados para remover a maior parte do líquido por baixo do wafer. Em seguida, use listras de silicone para fixar o wafer no fundo da placa de Petri. Coloque as seções montadas em um microscópio invertido com uma objetiva de imersão em óleo de alta abertura numérica.

Antes da imagem, deixe a amostra se equilibrar à temperatura do microscópio para minimizar ou reduzir o desvio lateral e axial. Centralize a área de interesse e adquira imagens de referência de epifluorescência de campo amplo. Mude para o modo de operação de super-resolução.

Ajuste o tempo de exposição da câmera para 15 milissegundos e defina o ganho de multiplicação de elétrons para o máximo de 300. Em seguida, ilumine a amostra no modo de epifluorescência com o laser de 642 nanômetros na potência máxima do laser. Assim que a molécula piscar estiver bem separada em cada quadro, de modo que a probabilidade seja baixa de que os sinais individuais se sobreponham, reduza a potência do laser para quase 1/3.

Grave a imagem bruta em epifluorescência adquirindo um mínimo de 30.000 quadros. A partir dos dados brutos, em Ferramentas, a Análise t-Series usa um limite de detecção de 30 fótons. Clique em Avaliar para gerar uma lista de eventos de localização.

Em Ferramentas, no painel Processamento da lista de eventos, clique em Criar imagem para visualizar a imagem de super-resolução por ajuste gaussiano, aplicando um tamanho de pixel de renderização de quatro nanômetros. Remova as listras de silicone e adicione uma gota de PBS perto das bordas do wafer para levantá-lo da placa de Petri. Depois de usar PBS para lavar o wafer duas vezes por dois minutos cada, use glutaraldeído a 0,1% em PBS para pós-fixá-lo por cinco minutos.

Em seguida, lave a amostra novamente duas vezes por dois minutos por lavagem em PBS. Incube o wafer em uma gota de 2% de metilcelulose em água com gelo duas vezes por cinco minutos por incubação. Em seguida, insira o wafer em um tubo de centrífuga e centrifugue a 14, 100 vezes g por 90 segundos.

Após a centrifugação, use cimento de carbono condutor para montar o wafer em um topo de alumínio SEM. Usando um dispositivo de evaporação por feixe de elétrons, adicione uma camada de dois a 10 nanômetros de carbono de platina na amostra por sombreamento rotativo com as seguintes configurações. Seções de imagem com um microscópio eletrônico de varredura a 1,5 quilovolts, distância de trabalho de dois milímetros e com um detector de elétrons secundário na lente.

Use Fiji para abrir imagens de microscopia de luz e eletrônica clicando em Arquivo, Abrir. Ajuste o tamanho da tela clicando em Imagem, Ajustar, Tamanho da tela. Em seguida, traga as duas imagens para uma pilha clicando em Imagem, Pilhas, Imagens a serem empilhadas.

Em Fiji, abra uma nova interface EM2 de rastreamento clicando em File, New, Track EM2 new. Importe a pilha com ambas as imagens clicando com o botão direito do mouse na janela preta e selecionando Importar pilha. Alinhe a imagem de microscopia de luz com a imagem de microscopia eletrônica manualmente com pontos de referência usando um clique com o botão direito do mouse na imagem e selecionando Alinhar, Alinhar camada manualmente com pontos de referência.

Escolha a ferramenta Selecionar para adicionar pontos de referência. Use a forma dos núcleos como referência para selecionar as mesmas arestas em ambas as imagens e adicionar vários pontos. Aplique o alinhamento com um modelo afim clicando com o botão direito do mouse e selecione Aplicar transformação, Modelo afim.

Por fim, altere a transparência da camada para avaliar a qualidade do alinhamento. Este painel mostra uma imagem de campo amplo de baixa ampliação de uma seção de retina de peixe-zebra de cinco dias após a fertilização. A mesma área é mostrada aqui por microscopia eletrônica de varredura.

Essas imagens de maior ampliação mostram a coloração de Tom20 em vermelho com aglomerados nas mitocôndrias. A expressão de Tom20 é mostrada aqui como detectada por microscopia GSDIM. Nesta imagem, a mesma seção combina super-resolução correlativa e microscopia eletrônica de varredura.

A coloração de Tom20 aparece dentro do aglomerado mitocondrial nas membranas externas das mitocôndrias. O sinal DAPI de fluorescência nos núcleos corresponde à topografia da imagem SEM. Esta imagem SEM fornece contexto para a coloração Tom20 na imagem GSDIM.

As cristas mitocondriais são claramente visíveis e a coloração Tom20 está localizada nas membranas externas das mitocôndrias. As membranas do segmento externo dos fotorreceptores são claramente resolvidas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar da melhor maneira possível seus parâmetros de rotulagem e imagem.

Somente amostras rotuladas de maneira ideal são adequadas para super-resolução. As amostras nunca devem secar em nenhum momento durante o procedimento de rotulagem. Este procedimento poderia ser estendido para imunofluorescência de dupla marcação e, assim, permitir a localização de duas proteínas diferentes dentro de uma estrutura específica.

No caso de amostras mais complexas, recomenda-se o uso de marcadores fiduciais para obter um alinhamento preciso das imagens. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar estudos correlativos para localizar proteínas em relação às diferentes organelas da célula em uma amostra de tecido complexo com precisão de super-resolução.