Microscopia de Localização de Molécula Única de Proteínas de Membrana usando Marcagem de Único Anticorpo

Minha pesquisa foca na membrana das células T e visa revelar novos insights em escala nanométrica relevantes para a direcionamento terapêutico. Os métodos de imagem existentes normalmente não visualizam diretamente as interações anticorpo-epítopo em nanoescala nas células. Esse protocolo supera essa limitação ao permitir a observação direta dentro do ambiente celular.

Após montar a amostra no microscópio e depositar coloides de ouro na superfície, utilize iluminação em campo claro para verificar se colóides suficientes foram depositados na região de interesse. Confirme que a densidade ideal de 5 a 10 coloides de ouro está presente na região de interesse antes de prosseguir. Para a configuração óptica do fluoróforo da sonda de anticorpos, abra o software de imagem e acesse as configurações ópticas.

Selecione o espelho dicróico apropriado e defina o comprimento de onda e a densidade de potência da excitação do laser. Ajuste o tempo de integração da câmera e selecione o filtro de emissão. Depois, ajuste o binning de pixels da câmera para alcançar um tamanho de pixel de 150 a 160 nanômetros.

Agora, crie uma configuração óptica para a etapa de clareamento fotográfico selecionando um modo de clareamento no software de imagem. Ajuste a potência do laser para 100% e ajuste o tempo de integração da câmera para um segundo. Defina os parâmetros de imagem no software de aquisição de imagem definindo o intervalo de não iluminação, número de quadros e frequência da etapa de clareamento da foto.

Em seguida, prepare o buffer de imagem diluindo o anticorpo CD81 a uma concentração de 1 micrograma por mililitro em 200 microlitros de 5%BSA produzidos em DPBS. A concentração final recomendada de anticorpos é 0,5 nanomolar para células T Jurkat, ou 2 nanomolares para células U-2 OS. Adicione o buffer de imagem preparado ao poço que contém as células e inicie a aquisição de imagem no software para iniciar a coleta de dados.

Use a função de visualização ao vivo no software de imagem configurado para marcação de membrana com anticorpo único para monitorar a ligação de anticorpos em tempo real. Configure os parâmetros de imagem no software de aquisição de imagem para obter pelo menos uma aquisição de 10 quadros e defina o intervalo de não iluminação para cinco segundos. Comece a aquisição e avalie a escassez das localizações de moléculas individuais no filme gravado.

Se múltiplos eventos de ligação de anticorpos sobrepostos forem observados imediatamente após a adição do tampão de imagem, ou se localizações de moléculas individuais se acumularem ao longo do tempo, aborte a aquisição. Reduza a concentração de anticorpos em duas vezes e repita a aquisição em uma nova amostra. Continue reduzindo a concentração de anticorpos em duas vezes e reavaliando o número de eventos por unidade de área até que a densidade desejada de localização de molécula única seja alcançada.

Se a densidade do evento for escassa, aumente a concentração de anticorpos no buffer de imagem em duas vezes. Repita a aquisição em uma nova amostra e continue aumentando a concentração de anticorpos em duas vezes, reavaliando o número de eventos de ligação por unidade de área até que a densidade desejada de localização de molécula única seja alcançada. Para otimização de intervalos sem iluminação, configure os parâmetros de imagem no software de aquisição de imagem para obter uma aquisição de 50 quadros.

Após adicionar o anticorpo e iniciar a aquisição, avalie a densidade e a esparsidade das localizações de moléculas individuais no filme gravado. Determine o menor intervalo não iluminador que gera uma densidade ótima de eventos de molécula única. Por fim, se eventos de ligação espacialmente sobrepostos ocorrerem à medida que a aquisição da imagem avança, introduza uma etapa de clareamento fotográfico em intervalos regulares.

Ajuste a frequência de clareamento fotográfico para que a fluorescência dos anticorpos ligados seja removida antes que eventos sobrepostos se acumulem. Defina o caminho do arquivo no software MATLAB para a pasta que contém o arquivo de valores separados por vírgulas da célula M reconstruído. Execute o código clicando em Executar na barra de ferramentas MATLAB.

Quando solicitado, selecione o arquivo CSV da célula M e clique em Abrir para carregá-lo no programa. Execute a análise usando as entradas previamente definidas como ponto de partida. Avaliando o gráfico de dispersão contendo os dados de localização não agrupados.

Escolha um valor mínimo de pontos que seja maior que o número de localizações de ruído, mas menor que o número de localizações na célula. Avalie a janela que representa os dados agrupados. Confirme que os clusters são mantidos na célula com o fenótipo esperado, enquanto as localizações fora da célula são minimizadas.

Se os parâmetros de agrupamento forem muito restritivos, diminua o valor mínimo de pontos e aumente a épsilão. Se os parâmetros de agrupamento forem muito inclusivos, aumente o valor mínimo de pontos e diminua a épsilão. Finalmente, após ajustar o valor mínimo de pontos e o epsilon, execute novamente o código para obter o agrupamento ideal.

As células T de Jurkat foram imobilizadas com espaçamento suficiente para preservar a integridade da membrana e permitir o acesso dos anticorpos aos epítopos da membrana. Coloides dourados foram visualizados e usados como marcadores fiduciais para correção de deriva lateral durante a aquisição da imagem das células M. A otimização do intervalo sem iluminação mostrou que um intervalo de cinco segundos produzia eventos de ligação de anticorpos com sobreposição espacial mínima, em comparação com intervalos mais curtos ou longos com uma concentração de anticorpos nanomolares.

A aplicação da correção por deriva melhorou a imagem da célula M reconstruída em comparação com a reconstrução não corrigida. O agrupamento baseado em densidade das localizações das células M reduziu as interações de fundo de baixa densidade e destacou eventos de ligação clusterizada de CD81. Podemos observar anticorpos interagindo com seus epítopos membranares em um ambiente celular, fornecendo insights relevantes para anticorpos terapêuticos.

A concentração de anticorpos, o intervalo de não iluminação e as etapas de fotoclareamento são críticas para otimizar. Parâmetros subótimos comprometem os resultados. A marcação de anticorpo único pode ser estendida para avaliar simultaneamente a ligação de proteínas de membrana por múltiplos anticorpos dentro do mesmo ambiente celular.