Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar a expressão e a localização celular de marcadores de fenótipo de macrófagos da microglia após isquemia cerebral. Primeiro, seções criogênicas de cérebros de camundongos isquêmicos são coradas para identificar marcadores de ativação de macrófagos da microglia. As seções coradas são submetidas a imagens confocais tridimensionais.

As imagens resultantes são então processadas para gerar renderizações tridimensionais e a análise de imagem é realizada para localizar a expressão de marcadores em grupos de células. Os dados resultantes demonstram a eficácia da análise confocal tridimensional na atribuição adequada da expressão do marcador a um corpo celular específico Quando dois marcadores são expressos pela mesma célula, mas em diferentes compartimentos subcelulares, a colocalização por si só pode não ser muito informativa. O uso da análise tridimensional, como demonstraremos aqui, permite uma melhor resolução e precisão.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a complexidade da resposta cerebral à lesão isquêmica, ele também pode ser aplicado a outras condições agudas ou crônicas em que foi proposto um papel duplo para os macrófagos da microglia na lesão e no reparo. Ou nos casos em que os sinais precisam ser localizados seletivamente em diferentes planos especiais, Carlo Perigo e Stefan de Magali o guiarão pelas diferentes etapas do procedimento. O protocolo a seguir utiliza tecido cerebral de camundongo no qual a isquemia foi induzida pela oclusão permanente da artéria cerebral média.

Use um criostato para coletar seções coronais seriais de 20 mícrons do cérebro em gelatina. As lâminas cobertas levam todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente antes do uso. Observe que a diluição de trabalho de anticorpos e soro listados em seu documento complementar resultou de testes feitos para obter o melhor desempenho quando diferentes anticorpos e soro são usados.

O protocolo precisa ser validado. Comece circulando as seções na lâmina usando uma caneta bloqueadora de líquidos para minimizar a quantidade de reagentes necessários. Em seguida, coloque as seções cerebrais em uma câmara úmida usando uma pipeta de um mililitro.

Adicione PBS em temperatura ambiente às seções e incube por cinco minutos para lavá-las. Em seguida, usando uma seringa descartável de um mililitro com agulha, remova a solução e repita a lavagem mais uma vez Depois de remover a segunda lavagem, proceda à coloração das amostras usando uma pipeta de um mililitro e uma seringa descartável para todas as trocas de solução. O procedimento de coloração deve ser realizado conforme resumido. Aqui.

Consulte o texto que acompanha para obter detalhes, incluindo as etapas de lavagem. Primeiro, as células são incubadas com peróxido de hidrogênio a 1% após o bloqueio com soro de cabra normal. Eles são incubados com anticorpo primário contra CD 11 B. Em seguida, as lâminas são incubadas com um anticorpo secundário apropriado seguido por triss, tampão tween NACL ou TNT, depois triss, H-C-L-N-A-C-L, tampão de bloqueio ou TNB após a incubação com TNB.

As lâminas são incubadas com estreptavidina HRP seguida de diluente de amplificação contendo cianeto cinco tiro, que amplificará o sinal de imunofluorescência. Em seguida, as lâminas são incubadas com NGS para bloquear locais de ligação não específicos. Em seguida, eles são incubados com um anticorpo primário contra o CD 68.

Após a incubação com o anticorpo primário, as células são então incubadas no anticorpo secundário conjugado com flúor apropriado, seguido por um micrograma por mililitro de ganchos para marcar o DNA. Assim que a coloração estiver concluída, monte as seções criogênicas usando ouro prolongado ao montar as seções, evite gerar bolhas de ar. Armazene as seções a quatro graus Celsius no escuro até que sejam analisadas.

A aquisição do sinal fluorescente deve ser realizada dentro de uma semana. Este protocolo utiliza um microscópio IX 81 equipado com uma unidade de varredura confocal, FV 500 com três linhas de laser: argônio criptônio a 488 nanômetros, hélio neon vermelho a 646 nanômetros e hélio neon verde a 532 nanômetros, além de um diodo UV na gripe do software U 500. Selecione os lasers de excitação e espelhos dicróicos apropriados.

Configure também a resolução da imagem em um mínimo de 800 por 600 pixels. Em seguida, coloque a lâmina no palco do microscópio e, usando epifluorescência, identifique uma área de interesse, aumente progressivamente a ampliação para a objetiva de 40 x. Em seguida, mude para a modalidade de microscopia de varredura a laser e execute varreduras repetitivas enquanto ajusta o nível de potência do fotomultiplicador e o ganho para cada canal.

Isso reduzirá a sobreposição de sinal causada pela excitação contemporânea em diferentes comprimentos de onda. Mantenha o ganho o mais baixo possível para evitar sinais inespecíficos indesejados. Continuando a varredura repetitiva, ajuste o foco e defina os extremos inferior e superior do eixo Z com comprimento total do eixo Z de 10 mícrons.

Em seguida, pare a verificação repetitiva. Em seguida, insira o tamanho da etapa. Deve ser o mais próximo possível do tamanho do pixel, que é de 0,225 mícrons.

Isso fornecerá uma proporção de tamanho padrão de um para um sobre o eixo Z no software Ative o filtro kalman pelo menos duas vezes. O algoritmo de kalman é uma função iterativa que elimina o sinal aleatório, como voxels positivos únicos pertencentes ao ruído de fundo, melhorando assim a relação sinal-ruído. Agora ative o modo de varredura sequencial para evitar efeitos de sangramento.

Vá para o ponto médio do eixo Z e execute uma varredura sequencial XY. Verifique a configuração do PMT e do ganho para garantir uma relação sinal-ruído satisfatória. Execute a aquisição XY, Z após a aquisição.

Exporte os dados como um arquivo multi TIF. Cada arquivo multi TIF normalmente contém três canais de cores e 44 planos focais para processamento. Comece abrindo o software imas.

Primeiro, selecione a visualização de superação e, em seguida, carregue o arquivo multi TIF. Em seguida, no painel de ajuste da tela, selecione a cor desejada para cada canal Aqui. Vermelho representa CD 11 B.Verde representa CD 68 e azul representa a coloração de DNA dos ganchos para remover o ruído do fundo, aumente o valor mínimo no painel de ajuste de exibição para cada canal.

Em seguida, vá para a vista de corte para visualizar um único plano focal XY com projeções ortogonais dos eixos x, Z e YZ. Mova-se ao longo do eixo Z procurando por colocalização, que aparece como pixels amarelos. Clique em uma área amarela para ver se a colocalização está presente ao longo do eixo Z, o que indica que ela pertence a um eixo Z de objeto sólido.

As projeções são visíveis na parte direita e inferior da figura. Tire um instantâneo e volte para a visualização de superação. Em seguida, no menu suspenso de edição, selecione cortar 3D e contorne uma região de interesse para isolar uma célula ou um cluster de células.

Em seguida, no painel de ajuste de exibição, selecione um canal. Selecione o construtor de algoritmos de superfícies de superação. Em seguida, para configurar o algoritmo, primeiro selecione um canal.

Em seguida, defina o limite como o mesmo valor mínimo definido no painel de ajuste de exibição e defina o redimensionamento, se necessário. Em seguida, defina a suavização como 0,200. Selecione o painel de cores e altere a aparência conforme necessário.

Repita a configuração do construtor de algoritmos de superfícies de superação para cada canal. Em seguida, no painel de ajuste de exibição, desmarque os canais de fluorescência e selecione todas as três superfícies. Por fim, mova o volume para encontrar a melhor visualização e tire um instantâneo para determinar o padrão de coexpressão dos marcadores MM.

Os protocolos de imunofluorescência e aquisição confocal descritos neste vídeo foram realizados em um modelo de camundongo de isquemia focal induzida por oclusão permanente da artéria cerebral média. Uma visão bidimensional das imagens adquiridas mostra que, 24 horas após a isquemia, os marcadores lisossômicos CD 68, que são mostrados em verde, são expressos no hipertrófico em meio às células B CD11 positivas, que são vistas em vermelho presentes no núcleo isquêmico. A projeção do eixo Z mostrada no canto inferior direito demonstra que a distribuição do marcador documentada na visualização de plano único também está presente ao longo do eixo Z na zona de borda.

As células positivas para CD 11 B exibem corpos celulares hipertróficos com processos altamente positivos para CD 68, sugerindo que os fagossomos estão ligados à membrana celular. Isso indica o comportamento ácido ativo do PHA das células microgliais para avaliar a co-expressão de CD 68 e YM um, um marcador de M dois polarizado. Mm.As imagens fluorescentes foram submetidas a renderização tridimensional.

A visão tridimensional das imagens adquiridas mostradas aqui indica a presença de células positivas CD 68 mostradas em verde e células positivas YM uma mostradas em voxels fluorescentes vermelhos. Colocando em paralelo, a visão do observador pode produzir um sinal colocalizado visto como amarelo, que pode não estar relacionado à distância real entre os marcadores. Para definir a colocalização.

Uma única vista plana com projeções do eixo Z deve ser gerada movendo-se ao longo do eixo Z. Procurando por colocalização. A projeção do eixo Z é obtida como visto na parte direita e inferior desta imagem.

Voxels fluorescentes podem ser transformados em objetos sólidos por renderização tridimensional com atribuição de expressão de marcador a um corpo celular específico. Após uma alta ampliação e renderização 3D, os dois marcadores parecem pertencer a células diferentes que estão próximas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de imunofluorescência com vários marcadores e corantes e como adquirir e visualizar adequadamente imagens tridimensionais por microscopia confocal.

Além disso, a análise de pós-processamento descreveu que pode ser explorada de forma frutífera para analisar qualquer co-expressão ou colocalização em nível celular, ou nos casos em que os sinais precisam ser localizados seletivamente em diferentes planos espaciais.