Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ

O objetivo geral desses métodos de análise de esqueleto e fractal é medir a morfologia da microglia do tecido preparado para IHC, usando métodos quantitativos de alto rendimento na natureza e sensíveis para detectar pequenas diferenças nas formas das células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo neuroinflamatório, definindo as nuances da forma e função da microglia durante a saúde e a doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela quantifica a morfologia da microglia usando variáveis contínuas em vez de categóricas.

Os métodos descritos aqui não requerem software proprietário e podem ser usados para triagem de regiões cerebrais ou análise célula por célula. Demonstrando o procedimento estará Kimberly Young, uma técnica do meu laboratório. Antes de começar, certifique-se de que o plug-in AnalayzeSkeleton foi baixado para ImageJ ou Fiji.

Em seguida, abra uma pilha Z de 30 mícrons mostrando o cérebro imunomarcado com Iba1. Se estiver usando uma fotomicrografia de fluorescência, certifique-se de que a imagem seja de 8 bits e converta em escala de cinza para visualizar melhor todas as colorações positivas. Use a barra de ferramentas e clique em Imagem, Tabelas de pesquisa, Cinzas.

Se estiver usando uma fotografia de campo claro DAB, primeiro use o plug-in de filtro passa-banda FFT com as configurações padrão. Clique em Processo, FFT, Filtro passa-banda e converta para escala de cinza. Se a imagem estiver muito escura para visualizar o processo da microglia, use a barra de ferramentas e clique em Imagem, Ajustar, Brilho/Contraste.

Ajuste os controles deslizantes mínimo ou máximo conforme necessário, até as bordas do histograma, mas não mais. Ajustar o brilho produz a maior variabilidade na análise de dados e, portanto, é a etapa mais crítica. Em seguida, execute um filtro Máscara de nitidez para aumentar ainda mais o contraste, clicando em Processo, Filtros, Máscara de nitidez.

Execute uma etapa de remoção de manchas para remover o ruído de sal e pimenta gerado pela máscara de nitidez. Use a barra de ferramentas e clique em Processar, Ruído, Remover manchas. Converta a imagem em binária selecionando Imagem, Ajustar, Limiar.

Em seguida, aplique a função Despeckle à imagem binária para remover qualquer ruído de pixel único restante. Em seguida, aplique a função Fechar clicando em Processar, Binário, Fechar, para conectar pixels escuros separados por no máximo dois pixels. Em seguida, remova os valores discrepantes clicando em Processar, Ruído, Remover valores discrepantes.

Depois de salvar a imagem como um arquivo separado para uso futuro, esqueletize a imagem usando a barra de ferramentas, clicando em Processar, Binário, Esqueletizar. Selecione a imagem esqueletizada e execute o plug-in AnalyzeSkeleton clicando em Plugins, Skeleton, Analyze Skeleton e marcando a caixa de informações da ramificação. Copie os dados dos resultados e das saídas de informações de ramificação e cole os dados em uma planilha do Excel.

No Excel, corte os dados para remover fragmentos de esqueleto resultantes do IHC e da aquisição de imagens. Determine qual comprimento de fragmentos será cortado do conjunto de dados abrindo a imagem esqueletizada no ImageJ e selecionando a ferramenta Linha. Meça vários fragmentos, anotando o comprimento médio, e decida sobre um valor de corte, que deve ser consistente em todo o conjunto de dados.

Classifique a planilha do Excel clicando em Classificar e Filtrar, Classificação Personalizada. Classifique por voxels de endpoint do maior para o menor e, em um novo nível, por ramificação Mx PT do maior para o menor. Remova todas as linhas que contêm dois pontos de extremidade com um comprimento máximo de ramificação menor que o valor de corte.

Some os dados na coluna de endpoints para calcular o número total de endpoints coletados da imagem. Repita para dados de informações de ramificação após classificar por comprimento de ramificação. Depois que todos os dados tiverem sido cortados e somados, divida os dados de cada imagem pelo número de somas de microglia na imagem correspondente.

Insira o ponto final e o comprimento da célula e ramificação por dados de célula no software estatístico. Certifique-se de que o plug-in FracLac foi baixado. Em seguida, use a ferramenta retângulo para desenhar o ROI.

Certifique-se de que a caixa seja grande o suficiente para capturar toda a célula e possa permanecer consistente em todo o conjunto de dados. Na janela ROI Manager, selecione Update para bloquear o ROI em uma célula selecionada aleatoriamente na fotomicrografia. Abra a imagem binária que contém a célula selecionada.

Clique duas vezes na ferramenta Pincel, defina a cor para preto e ajuste a largura do pincel conforme necessário. Usando a fotomicrografia correspondente como referência, use o Pincel para remover processos celulares adjacentes, conectar processos fragmentados e isolar a célula de interesse. Depois que a célula binária for isolada, salve o arquivo binário.

Converta a célula binária em um contorno usando a barra de ferramentas, via Processo, Binário, Contorno. Na barra de ferramentas, abra o FracLac usando a barra de ferramentas, clicando em Plugins, Fractal Analysis, FracLac e selecione BC para contagem de caixas. Em Design de grade, defina Num G como quatro.

Em Opções de gráficos, marque a caixa de métricas para analisar o envoltório convexo e o círculo delimitador da célula. Quando terminar, selecione OK e, em seguida, selecione o botão Digitalizar para executar uma verificação de contagem de caixas na imagem selecionada. Na janela Resultados do envoltório e do círculo, copie todos os resultados de dados desejados.

Em seguida, faça o mesmo na janela Resumo da contagem de caixas. Transfira os dados copiados para um arquivo Excel ou software estatístico. Este gráfico mostra dados resumidos dos desfechos da microglia por célula e comprimento processado por célula no tecido cortical não lesionado e lesionado.

Este é o resultado da análise com o protocolo aplicado. Em ambos os casos, a análise estatística foi realizada por meio do Teste T de Student, e três imagens foram analisadas. Deve-se tomar cuidado com a variabilidade interusuário na aplicação do protocolo.

Tais diferenças são resumidas aqui, onde o mesmo conjunto de dados foi analisado por dois usuários independentes aplicando um protocolo idêntico. Embora as tendências sejam semelhantes, a variabilidade entre usuários afeta a significância dos dados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o objetivo é obter um modelo de esqueleto ou contorno que seja representativo da fotomicrografia original.

Isso significa que as etapas podem ser modificadas de acordo com as necessidades específicas do investigador. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar rapidamente a morfologia da micróglia a partir de fotomicrografias de tecido imuno-histoquímico usando software de computador prontamente disponível.