Name: Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda a quantificar a morfologia da microglia em tecido cerebral preparado por imuno-histoquímica usando o ImageJ. Este método de alta vazão emprega análise de esqueleto e fractal para detectar diferenças subtis na forma celular durante estados de neuroinflamação.

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Este estudo recebeu apoio financeiro da NINR (F32NR013611). Nós gostaríamos de reconhecer e agradecer os desenvolvedores de AnalyzeSkeleton(2D/3D) e FracLac (Arganda-Carreras et al e Karperien et al, respectivamente) sem que a análise aqui descrita não seria possível.

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection(2013).</li>
<li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+microglia%3A+a+morphological+definition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096(2014).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients%2C+Impairs+Microglial+Motility%2C+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis%2FMicroglial+Phagocytosis+Uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466(2016).</li>
<li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection(2017).</li>
<li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211(2017).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li>
<li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li>
<li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+response+to+Alzheimer%27s+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li>
<li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li>
<li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections%3A+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Karperien, A. FracLac for ImageJ. , Available from:
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<li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+microglia+activation%3A+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576(2017).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2014).</li>
<li>Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractal%2C+Multifractal%2C+and+Lacunarity+Analysis+of+Microglia+in+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection(2015).</li>
<li>Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/283055226_3D_quantitative_analysis_of_microglial_morphology">3D quantitative analysis of microglial morphology.</a> available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).</li>
<li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

As células da micróglia são finamente sintonizadas com a fisiologia e patologia dentro de seus domínios-micro e exibir uma gama diversificada de morfologias2 em sutil7,14 e prejuízo bruto8. O uso de protocolos ImageJ faz a quantificação de morfologia microglia acessível a todos os laboratórios como a plataforma e plugins são uma imagem de open source software de processamento. Enquanto o protocolo descrito é focado em processamento de imagem e análise usando este software, a consistência da coleta de dados, validade e confiabilidade começa com excelente IHC e microscopia. Este protocolo é usado para melhorar o binário, esqueleto e representações de contorno de toda fotomicrografias e células únicas, mas não pode tomar o lugar do pobre IHC coloração e microscopia que resulta em baixo contraste, borradas ou distorcidas imagens. Como uma consideração adicional, tenha cuidado para não achatar o tecido cerebral durante o armazenamento, antes do corte, o que altera irrevogavelmente microglia morfologia. Por último, dentro de cada experimento, microglia deve ser fotografada usando a mesma escala, bem como o mesmo microscópio. Instrumentação, objectivos e software variam entre microscópios que resultará em diferentes tamanhos fotomicrografias apesar de objectivos semelhantes e mudar os detalhes, bem como o número de células dentro de cada quadro. Por exemplo, aquisição de imagem usando um objectivo X 40 em uma Leica SPII resulta em duas vezes o número de células e menos detalhes do que usando um Zeiss 880 de aquisição. Isto é particularmente importante célula ramificação da recolha de dados de todo o quadro, ao invés de uma única célula, como isto se torna uma questão de amostragem de dados.
Em geral, análise de esqueleto que utiliza a Fotomicrografia toda precede a análise fractal única célula por dois motivos. Ramificação de célula determinante de todas as células em uma Fotomicrografia é rápida quando comparada à análise fractal de célula única e pode ser considerado como uma ferramenta de rastreio, se o tempo é um fator. Além disso, as imagens binárias derivadas durante a análise do esqueleto são utilizadas para análise fractal. Uma vez que a criação da imagem, há uma série de passos críticos que podem influenciar os resultados da análise de esqueleto e introduzir o usuário-influência. As etapas de protocolo que são a maioria das variáveis entre usuários estão etapa 4.2 (brilho crescente da imagem) em 4.5 (determinação do limiar). Sempre que possível, um número ideal para aumentar a luminosidade (max ou min controle deslizante entre 0-255) é determinado e mantido constante para todos os usuários e imagens. Onde a variabilidade de imagem é grande, o usuário pode escolher em vez de um brilho que pode variar entre imagens. Como alternativa, se as imagens são brilhantes e contraste é alta, então aumentar o brilho pode ser omitido e limiarização pode ser padronizada, usando um filtro de limiar de especialidade (ex., Huang) em vez do padrão mais variável. Uma vez otimizado, os parâmetros devem ser observados a fim de minimizar a influência-usuário adicional.
Um exemplo de variabilidade de usuário é apresentado na Figura 5. Valores de dados foram aumentados em usuário 1 contra 2 do usuário e, portanto, variabilidade seria aumentada se tanto usuário 1 e 2 do usuário contribuíram para a coleta de dados. Um exemplo das diferenças no usuário 1 e 2 do usuário binárias e esqueletizadas imagens são destacados por círculos coloridos (Figura 5). Neste caso, ambos os usuários foram brevemente treinados estudantes com experiência limitada no microglia. Supervisão regular e orientação por um microglia perito juntamente com protocolo maior formação2 podem reduzir a variabilidade inter-user. Embora não avaliados aqui, análise fractal é menos sujeito a variabilidade inter usuário porque células binárias são manualmente e individualmente isoladas uma Fotomicrografia ao invés de depender exclusivamente de limiarização para determinar formas de micróglia. No entanto, todos os métodos possuem uma variabilidade entre os usuários. Portanto, um único usuário (idealmente, treinado por alguma experiência nas células da microglia) deve concluir a coleta de dados para um dataset inteiro.
Modificações adicionais podem ser facilmente feitas ao presente protocolo e dependerão a qualidade da imagem e os esforços desenvolvidos para reduzir o ruído e garantir a ligação de processo. Por exemplo, se o contraste for adequada, máscara de nitidez não é necessária e pode ser omitida. É prudente otimizar e finalizar o protocolo para um conjunto específico de imagens, ambos os casos experimentais e controles, antes da coleta de dados de um conjunto inteiro. Por fim, plugins adicionais pode ser usado no lugar de outros para clarificar ou aguçar imagens que não foram descritas no presente protocolo como dilatar ou aguçar.
Vantagens do presente protocolo são sua disponibilidade universal e adaptabilidade. Além disso, avaliar a ramificação de célula usando AnalyzeSkeleton é rápida e aplicável a uma Fotomicrografia inteira. Uma vantagem da abordagem de análise de várias células é o foco de toda uma região, ao invés de células únicas. Portanto, é possível avaliar rapidamente a ramificação média (em termos de pontos de extremidade e comprimento de processo) de micróglia todos dentro da imagem. Análise de esqueleto fornece uma análise de várias células: uma amostragem de dados em termos de números de celular que não podem ser igualadas por análise fractal devido o investimento de tempo necessário para isolar células únicas de fotomicrografias. Uma instância que possa ser mais adequado seria no rastreio microglia morfologias nas proximidades de uma lesão focal. Uma limitação é o processamento de imagem de todo campo para criar modelos de esqueleto de fotomicrografias IHC é imperfeito quando comparado com a abordagem única célula mais demorada. Além disso, uma análise da região não é adequada às circunstâncias onde morfologias microglia são drasticamente diferentes dentro do mesmo campo. Por último, este método de análise é dependente da contagem de células, um parâmetro que pode ser diferente entre as condições experimentais.
Análise fractal é realizado em uma única célula e, portanto, complementa a saída de dados de ramificação de célula média resultante da análise de esqueleto. Embora muito mais demorada, este investimento produz uma ampla gama de dados morfométricos. Por exemplo, célula de densidade, relação de extensão, e dados de circularidade descrevem o tamanho, alongamento e forma de contorno da célula, respectivamente. Lacunarity e dimensão fractal resumem a célula complexidade e heterogeneidade de forma, respectivamente. É fornecido um resumo mais profundo de como cada parâmetro é calculado e como os dados podem ser interpretados no manual interativo16 e tal detalhe deve ser considerado em relação à questão específica de pesquisa. O protocolo descrito resulta em sensíveis ferramentas para quantificar pequenas mudanças em 2D microglia morfologias que podem ocorrer em condições fisiológicas e patológicas. Análise morfométrica adicionais como solidez, convexidade e fator de formulário16,20 pode ser possível se gerando formas 3D.
Adaptação e desenvolvimento de protocolo é contínuo e controlado pelo usuário. Isso foi estendido de fluorescência8 DAB/brilhante-campo imagens7 , mas ainda não tecido incorporado de parafina. -Além disso, pode ser usada em conjunto com software proprietário como hottie para análise adicional. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de Fisiologia e não está limitado a microglia, mas pode ser aplicado a qualquer célula ou tecido com padrões particulares ou formas que podem ser identificadas usando métodos IHC. Por último, com tamanho de amostra suficiente, uma análise multivariada ou cluster pode ser aplicada para estratificar microglia de acordo com a morfologia de12,21; Isto é informações significativas como morfologia microglia é um indicador vital da microglia funções e respostas a seus arredors. O apreço pela diversidade morfológica microglial é importante para compreender inteiramente interações neurônio-glia-vascular durante a saúde e a doença e em expansão. Crescimento neste campo é reforçado por protocolos bem desenvolvidos, fácil de usar e pode ser reproduzidos para quantificar e resumir microglia morfologia usando múltiplas variáveis contínuas.

Microglia têm uma resposta morfológica imediata e diversa alterações no cérebro fisiologia1 ao longo de um continuum de possibilidades que variam de hiper-ramificação e altamente complexas morfologias a eliminação ramificadas e ameboides morfologias2 . Microglia também pode tornar-se polarizada e de forma cilíndrica3. Ramificação de célula microglia é comumente definida como uma forma complexa, tendo vários processos e muitas vezes é relatada como o número de pontos de extremidade por célula e a duração dos processos celulares. Desde microglia são finamente ajustados a função neuronal e glial através do celular contínua cross-talk e na vivo motilidade4,5, microglia morfologias podem servir como indicadores de célula diversas funções e disfunções no cérebro. Uma abordagem quantitativa é necessária para descrever adequadamente a diversidade dessas alterações morfológicas e de distinguir as diferenças entre células ramificadas que ocorrem com sutis perturbações fisiológicas (como epilepsia5,6 e concussão7) Além de prejuízo bruto (tais como acidente vascular cerebral8). Um aumento da utilização de morfologia quantificação7,8,9,10,11,12,13,14 revelará a completa diversidade de morfologias microglia durante saúde e doença. O presente estudo detalhes o uso gradual do ImageJ plugins necessários para resumir microglia morfologia de fotomicrografias fluorescentes ou não-fluorescente de micróglia adquirido em tecido de roedor fixo depois de imuno-histoquímica (IHC).
Central para as técnicas de análise descritas aqui são o ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, desenvolvido em 2010 para quantificar a grandes estruturas mamárias e FracLac16, desenvolvido em 2014 para integrar a análise ImageJ e fractal para quantificar as formas individuais microglia. Esses plugins fornecem uma análise rápida da microglia ramificação dentro fotomicrografias inteiras ou microglia múltiplas de um ROI definido dentro uma Fotomicrografia. Esta análise pode ser usada sozinho ou em complemento com análise fractal. A análise fractal de célula única (FracLac) requer um investimento de tempo, mas fornece várias saídas de morfologia em relação a tamanho, forma e complexidade microglia. O uso de ambas as ferramentas não é redundante, como célula ramificação é complementar à complexidade da célula, e a combinação de vários parâmetros pode ser utilizada para distinguir microglia diversas morfologias dentro de conjuntos de dados12,17.

<table><tbody><tr><td>anticorpo primário anti-IBA1</td><td>Wako&nbsp;</td><td>019-19741</td><td>coelho hospedeiro</td></tr><tr><td>Vectashield montagem macia</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>hospedeiro de burro</td></tr><tr><td>frasco de vidro de 4 mL</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>lamínula de vidro</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificar a microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o imagej

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia são os fagócitos de cérebro que continuamente seu ambiente por doença, lesão e disfunção de vistoria e participarem na homeostase do cérebro. Como as socorristas, microglia têm funções importantes para atenuar a disfunção do neurônio e glia, e nesse processo, passam por uma ampla gama de alterações morfológicas. Microglia morfologias podem ser categorizadas de forma descritiva ou, alternativamente, podem ser quantificadas como uma variável contínua para parâmetros como ramificação de célula, complexidade e forma. Enquanto métodos para quantificar a microglia são aplicados a células únicas, algumas técnicas se aplicam a microglia múltiplos em uma Fotomicrografia inteira. A finalidade desse método é quantificar múltiplo e única células usando protocolos ImageJ prontamente disponíveis. Este protocolo é um resumo das etapas e plugins ImageJ recomendado para converter fotomicrografias de fluorescência e brilhante-campo em imagens binárias e esqueletizadas representante e analisá-los usando o software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) e FracLac morfologia recolha de dados. As saídas desses plugins resumem morfologia celular em termos de pontos de extremidade do processo, junções e comprimento, bem como complexidade, forma da célula e descritores de tamanho. O protocolo de análise esqueleto aqui descrito é bem adequado para uma análise regional de micróglia múltiplos dentro de uma Fotomicrografia toda ou a região de interesse (ROI), Considerando que FracLac fornece uma análise complementar célula individual. Combinado, o protocolo fornece um objetivo, uma ferramenta de avaliação sensível e abrangente que pode ser usada para estratificar entre microglia diversas morfologias presentes no cérebro saudável e ferido.

Os protocolos de análise de morfologia microglia aqui descritos resumem passos útil no processamento de lâmpadas fluorescentes e DAB fotomicrografias para Análise morfométrica. Visualmente, estas etapas são resumidas na Figura 2 e Figura 3. O objetivo dessas etapas é criar uma imagem representativa de binária e esqueletizada que modela adequadamente a Fotomicrografia original, tal que os dados acumulados são válidos. Após a aplicação do protocolo, o plugin AnalyzeSkeleton resulta em uma imagem do esqueleto marcada do que o número de pontos de extremidade e filial (i. e., processos) lengthcan ser resumido de arquivos de saída resultante. Pontos de extremidade e processar dados de comprimento são usados para estimar a extensão da microglia ramificação na Fotomicrografia ou ROI. A Figura 4 resume os dados resultantes (comprimento/célula/célula de pontos de extremidade e processo) coletados com e sem a aplicação do protocolo. Embora existam tendências similares, os dados resumidos na Figura 4F são menos variável do que aqueles em Figura 4E. Além disso, esses dados ilustram o aumento da sensibilidade para detectar diferenças entre os grupos quando o protocolo é aplicado. Por último, deve ter cuidado sobre variabilidade inter usuário na aplicação do protocolo. Tais diferenças são resumidas pela Figura 5 , onde o mesmo conjunto de dados foi analisado por dois usuários independentes aplicando um protocolo idêntico como resumidos acima.
Morfologia adicionais dados são coletados de simples células isoladas a partir das imagens binárias criadas durante a aplicação do protocolo. As etapas do protocolo para analisar a morfologia microglia antes e usando o plugin FracLac estão resumidos na Figura 6. Podemos ilustrar esta análise em ambos ilesos (figura 6A) e ferido o tecido (Figura 6B). Imagens representativas de binário, esboçado, convexo de casco/encapsular círculo e exemplos de contagem de caixa para cada célula analisados com e sem o protocolo de aplicação são mostrados na Figura 6–F. Estas imagens ajudam a ilustrar as origens das diferenças nos dados de morfologia quais são resumidas na Figura 6.
<img alt="Diagrama de traçado neuronal; soma circular vs. origem única; sobreposição fluorescente; mapeamento de redes neurais." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1. Ilustrações de esqueletizada microglia com uma soma circular (qualidade inferior) versus uma soma de origem única (ideal) e a correspondente sobreposição entre a célula esqueletizada e a original Fotomicrografia. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Etapas de processamento de imagem: microscopia original para esqueleto marcado, incluindo escala de cinza, mancha, binário." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2. Protocolo de aplicativo para fluorescentes fotomicrografias. Ilustrações do protocolo esqueleto análise aplicada a uma Fotomicrografia fluorescente com uma única célula cortada para mostrar os detalhes. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Sequência de processamento de imagem para análise da estrutura neuronal; Filtro FFT; escala de cinza; diagrama de esqueleto." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3. Aplicação de protocolo para campo claro DAB fotomicrografias. Ilustrações do esqueleto análise protocolo aplicado a uma Fotomicrografia DAB brilhante-campo com uma única célula cortada para mostrar os detalhes. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise de processos neuronais; imagens de microscopia, comparação de protocolos, gráfico mostrando endpoints/célula." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4. Análise de dados com e sem a aplicação do protocolo. (A) uma fotomicrografia de exemplo de IHC fluorescente e recortada célula que corresponde a caixa amarela em (B). Imagens de exemplo binárias e esqueletizadas com (C) e sem (D), o protocolo aplicado conforme descrito. Dados de Resumo de micróglia pontos de extremidade/célula e processo comprimento/célula em ileso (branco) e feridos (cinza) tecido cortical com (E) e sem (F), o protocolo aplicado. Análise estatística utilizando o teste t de student e n = 3, * * denota p &lt; 0,01. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise da morfologia dos neurônios; processamento de imagens e gráficos de dados; binário, diagramas de esqueleto, resultados estatísticos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5. Diferenças do usuário com a aplicação do protocolo. Um exemplo de uma conversão de imagem e protocolo original para imagens binárias e esqueletos pelo usuário 1 e 2 do usuário. Diferenças entre as duas imagens são realçadas com correspondência de círculos coloridos. Gráficos de Resumo de dados de comprimento/célula/célula de pontos de extremidade e processo microglia em regiões do cérebro ileso e feridos pelo usuário 1 e 2 do usuário. Análise estatística com ANOVA e amostra tamanho é n = 3; p &lt; 0.05, * *p &lt; 0,01, * * *p &lt; 0,001. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise de lesão neuronal com comparação morfológica; Efeito de aplicação do protocolo na microglia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6. Análise fractal com e sem a aplicação do protocolo. Exemplo de fotomicrografias recortadas da microglia no ileso (A) e feridos (B) córtex com binário correspondente (C) e imagens de estrutura de tópicos (D) que resultam com e sem o protocolo aplicado. A superfície convexa associada (azul) e encerrando o círculo (rosa) para formas de contorno correspondente (E) são usados para calcular a densidade de forma, proporção e circularidade (G) de calibração. A caixa contando método é ilustrada em (F) e usada para cálculos de lacunarity (λ) (G) e a dimensão fractal (DB). Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Microglia são células imunes do cérebro que pesquisa e reagem a fisiologia do cérebro alteradas através de alterações morfológicas que podem ser avaliadas quantitativamente. Este protocolo descreve um ImageJ com base em protocolo de análise para representar microglia morfologia como dados contínuos de acordo com métricas como ramificação de célula, complexidade e forma.

Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

O objetivo geral desses métodos de análise de esqueleto e fractal é medir a morfologia da microglia do tecido preparado para IHC, usando métodos quantitativos de alto rendimento na natureza e sensíveis para detectar pequenas diferenças nas formas das células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo neuroinflamatório, definindo as nuances da forma e função da microglia durante a saúde e a doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela quantifica a morfologia da microglia usando variáveis contínuas em vez de categóricas.Os métodos descritos aqui não requerem software proprietário e podem ser usados para triagem de regiões cerebrais ou análise célula por célula. Demonstrando o procedimento estará Kimberly Young, uma técnica do meu laboratório. Antes de começar, certifique-se de que o plug-in AnalayzeSkeleton foi baixado para ImageJ ou Fiji.Em seguida, abra uma pilha Z de 30 mícrons mostrando o cérebro imunomarcado com Iba1. Se estiver usando uma fotomicrografia de fluorescência, certifique-se de que a imagem seja de 8 bits e converta em escala de cinza para visualizar melhor todas as colorações positivas. Use a barra de ferramentas e clique em Imagem, Tabelas de pesquisa, Cinzas.Se estiver usando uma fotografia de campo claro DAB, primeiro use o plug-in de filtro passa-banda FFT com as configurações padrão. Clique em Processo, FFT, Filtro passa-banda e converta para escala de cinza. Se a imagem estiver muito escura para visualizar o processo da microglia, use a barra de ferramentas e clique em Imagem, Ajustar, Brilho/Contraste.Ajuste os controles deslizantes mínimo ou máximo conforme necessário, até as bordas do histograma, mas não mais. Ajustar o brilho produz a maior variabilidade na análise de dados e, portanto, é a etapa mais crítica. Em seguida, execute um filtro Máscara de nitidez para aumentar ainda mais o contraste, clicando em Processo, Filtros, Máscara de nitidez.Execute uma etapa de remoção de manchas para remover o ruído de sal e pimenta gerado pela máscara de nitidez. Use a barra de ferramentas e clique em Processar, Ruído, Remover manchas. Converta a imagem em binária selecionando Imagem, Ajustar, Limiar.Em seguida, aplique a função Despeckle à imagem binária para remover qualquer ruído de pixel único restante. Em seguida, aplique a função Fechar clicando em Processar, Binário, Fechar, para conectar pixels escuros separados por no máximo dois pixels. Em seguida, remova os valores discrepantes clicando em Processar, Ruído, Remover valores discrepantes.Depois de salvar a imagem como um arquivo separado para uso futuro, esqueletize a imagem usando a barra de ferramentas, clicando em Processar, Binário, Esqueletizar. Selecione a imagem esqueletizada e execute o plug-in AnalyzeSkeleton clicando em Plugins, Skeleton, Analyze Skeleton e marcando a caixa de informações da ramificação. Copie os dados dos resultados e das saídas de informações de ramificação e cole os dados em uma planilha do Excel.No Excel, corte os dados para remover fragmentos de esqueleto resultantes do IHC e da aquisição de imagens. Determine qual comprimento de fragmentos será cortado do conjunto de dados abrindo a imagem esqueletizada no ImageJ e selecionando a ferramenta Linha. Meça vários fragmentos, anotando o comprimento médio, e decida sobre um valor de corte, que deve ser consistente em todo o conjunto de dados.Classifique a planilha do Excel clicando em Classificar e Filtrar, Classificação Personalizada. Classifique por voxels de endpoint do maior para o menor e, em um novo nível, por ramificação Mx PT do maior para o menor. Remova todas as linhas que contêm dois pontos de extremidade com um comprimento máximo de ramificação menor que o valor de corte.Some os dados na coluna de endpoints para calcular o número total de endpoints coletados da imagem. Repita para dados de informações de ramificação após classificar por comprimento de ramificação. Depois que todos os dados tiverem sido cortados e somados, divida os dados de cada imagem pelo número de somas de microglia na imagem correspondente.Insira o ponto final e o comprimento da célula e ramificação por dados de célula no software estatístico. Certifique-se de que o plug-in FracLac foi baixado. Em seguida, use a ferramenta retângulo para desenhar o ROI.Certifique-se de que a caixa seja grande o suficiente para capturar toda a célula e possa permanecer consistente em todo o conjunto de dados. Na janela ROI Manager, selecione Update para bloquear o ROI em uma célula selecionada aleatoriamente na fotomicrografia. Abra a imagem binária que contém a célula selecionada.Clique duas vezes na ferramenta Pincel, defina a cor para preto e ajuste a largura do pincel conforme necessário. Usando a fotomicrografia correspondente como referência, use o Pincel para remover processos celulares adjacentes, conectar processos fragmentados e isolar a célula de interesse. Depois que a célula binária for isolada, salve o arquivo binário.Converta a célula binária em um contorno usando a barra de ferramentas, via Processo, Binário, Contorno. Na barra de ferramentas, abra o FracLac usando a barra de ferramentas, clicando em Plugins, Fractal Analysis, FracLac e selecione BC para contagem de caixas. Em Design de grade, defina Num G como quatro.Em Opções de gráficos, marque a caixa de métricas para analisar o envoltório convexo e o círculo delimitador da célula. Quando terminar, selecione OK e, em seguida, selecione o botão Digitalizar para executar uma verificação de contagem de caixas na imagem selecionada. Na janela Resultados do envoltório e do círculo, copie todos os resultados de dados desejados.Em seguida, faça o mesmo na janela Resumo da contagem de caixas. Transfira os dados copiados para um arquivo Excel ou software estatístico. Este gráfico mostra dados resumidos dos desfechos da microglia por célula e comprimento processado por célula no tecido cortical não lesionado e lesionado.Este é o resultado da análise com o protocolo aplicado. Em ambos os casos, a análise estatística foi realizada por meio do Teste T de Student, e três imagens foram analisadas. Deve-se tomar cuidado com a variabilidade interusuário na aplicação do protocolo.Tais diferenças são resumidas aqui, onde o mesmo conjunto de dados foi analisado por dois usuários independentes aplicando um protocolo idêntico. Embora as tendências sejam semelhantes, a variabilidade entre usuários afeta a significância dos dados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o objetivo é obter um modelo de esqueleto ou contorno que seja representativo da fotomicrografia original.Isso significa que as etapas podem ser modificadas de acordo com as necessidades específicas do investigador. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar rapidamente a morfologia da micróglia a partir de fotomicrografias de tecido imuno-histoquímico usando software de computador prontamente disponível.

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Etienne, F. et al. Imagem de dois fótons da atração de processos microgliais por ATP ou serotonina em fatias cerebrais agudas. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o uso da microscopia de dois fótons para estudar a atração de processos microgliais em direção a um composto injetado em fatias cerebrais. Ele fornece uma visão geral da preparação de fatias de cérebro de camundongo, injeção de um composto de teste quimioatraente e imagens de microglia marcada com fluorescência para...

Microscopia de dois fótons para estudar a atração do processo microglial em direção a um composto em uma fatia de cérebro de camundongo

Uma maneira de ganhar novos insights sobre a complexidade da resposta inflamatória do cérebro é apresentado. Descrevemos protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional para investigar o padrão de co-expressão de marcadores fenotípicos microglia / macrófagos em um modelo de rato de isquemia focal.

Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

Microglia são as células do sistema imunológico residentes do sistema nervoso central (SNC), com uma elevada capacidade de fagocitar ou engolir o material no seu ambiente extracelular. Aqui, um ensaio amplamente aplicável, confiável e altamente quantitativa para visualizar e medir engulfment mediada por microglia de componentes sinápticas é descrito.

Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Dois algoritmos de análise de imagem, "Drosophila MNJ morfometria" e "Drosophila MNJ Bouton morfometria" foram criados, para quantificar automaticamente nove características morfológicas da junção neuromuscular Drosophila (MNJ).

Dois Algoritmos para métodos de alta capacidade e Multi-paramétrico Quantificação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Junção Neuromuscular Morfologia

Este protocolo foi desenvolvido para identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em resecções do paciente com glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ.

Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a costainização imunofluorescente de IBA1 e TMEM119, além da análise da densidade microglial, distribuição e morfologia, bem como infiltração periférica de células mieloides no tecido cerebral do rato.

Imunofluorescência Manchausando IBA1 e TMEM119 para densidade microglial, morfologia e análise periférica de infiltração de células mieloides no cérebro do rato

Apresentamos um método, que utiliza uma abordagem de análise de imagem generalizada baseada em área para identificar a contagem de células. A análise de diferentes populações celulares explorou as diferenças significativas de altura celular e estrutura entre tipos de células distintas dentro de um algoritmo adaptativo.

Algoritmo de análise de imagem baseado em área para quantificação de coculturas de macênfago-fibroblasto

Este protocolo descreve o processo de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em células semelhantes à micróglia para experimentação in vitro . Também incluímos um procedimento detalhado para gerar sinaptossomos humanos a partir de neurônios motores inferiores derivados de iPSC que podem ser usados como substrato para ensaios de fagocitose in vitro usando sistemas de imagem de células vivas.

Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

O parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) é um problema de saúde global urgente com opções de prevenção e tratamento abaixo do ideal. Apresentamos um modelo de camundongo de parto prematuro induzido por infecção bacteriana vaginal ascendente e descrevemos como analisar a morbidade e mortalidade neonatal resultante.

Modelagem de infecção vaginal ascendente, parto prematuro e morbidade neonatal em camundongos

O Software de Mapeamento de Parâmetros Microgliais (MMPS) é uma pipeline de análise amigável que não requer conhecimento em codificação e semiautomatiza a análise de morfologia microglial de célula única a partir de imagens de imunofluorescência. Validado em um modelo de neuroinflamação induzido por lipopolissacarídeos de roedores, o MMPS detecta reprodutivamente alterações morfológicas associadas à ativação e possibilita a fenotipagem microglial padronizada e escalável.

Software de Mapeamento de Parâmetros Microgliais (MMPS): Uma ferramenta de código aberto e fácil de usar para análise quantitativa de morfologia da microglia

Aprenda a quantificar a morfologia da microglia em tecido cerebral preparado por imuno-histoquímica usando o ImageJ. Este método de alta vazão emprega análise de esqueleto e fractal para detectar diferenças subtis na forma celular durante estados de neuroinflamação.

Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ

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