Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

O objetivo geral deste procedimento é descobrir interações proteicas com moléculas isca imobilizadas. Isso é realizado primeiramente adquirindo e imobilizando a isca. O segundo passo é introduzir a biblioteca de fagos a ser triada na isca sob condições que promovam a ligação.

Em seguida, os fagos não ligados são removidos por lavagens rigorosas. Enquanto isso, os fagos ligados são utilizados para infectar as bactérias antes de serem recuperados. O passo final consiste em amplificar os fagos ligados para a próxima iteração de seleção por afinidade.

No final, quando o título do fago atinge uma platô, placas individuais são selecionadas e sequenciadas para mostrar quais proteínas possuem maior afinidade pelo retardamento imobilizado nas condições experimentais de ligação. Esse processo pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre interações entre proteínas. Este procedimento começa com a proteína recombinante purificada sendo colocada no fundo de placas de microtitulação conforme descrito no protocolo textual.

O próximo passo é inocular 50 mililitros de meio Luria burani com 100 microgramas por mililitro de ampicilina em um frasco erlenmeyer de 250 mililitros com uma única colônia que tenha sido previamente cultivada conforme descrito no protocolo textual, incubando a 37 graus Celsius, a 200 RPM em um agitador horizontal, e usar um espectrofotômetro para monitorar a densidade celular até que uma densidade óptica em 600 nanômetros de 0,5 a 0,6 seja obtida. Em seguida, despeje as células em um tubo Falcon de 50 mililitros ou similar e mantenha a quatro graus Celsius até o uso; as células geralmente permanecem viáveis por aproximadamente uma semana. No dia um, prepare-se para a seleção por afinidade conforme descrito no protocolo textual na manhã do dia dois.

Coloque nove frascos erlenmeyer de 250 mililitros vazios e autoclavados nas garras de um agitador incubador, inocule 500 mililitros de caldo LB com 500 microlitros de uma das culturas noturnas de células BLT5403 infectadas com fago iniciadas na noite anterior. Após colocar o frasco no incubador, ligue o espectrofotômetro e configure-o para ler a absorbância em 600 nanômetros. Enquanto isso, retire a placa de microtitulação de quatro graus Celsius e remova o filme plástico. Remova qualquer proteína não ligada da placa lavando 10 vezes com 200 microlitros por poço de solução salina tamponada com Tris 1X ou TBS pH 7,5, batendo a placa de cabeça para baixo sobre uma toalha de papel entre cada lavagem.

Bloqueie com 200 microlitros por poço do reagente bloqueador a 5% em TBS durante uma hora. Com a placa envolta em filme plástico, remova a solução bloqueadora com 10 lavagens de 200 microlitros de TBS-T 1X, batendo a placa de cabeça para baixo em quatro camadas de papel-toalha entre cada lavagem.

A partir daqui, utilize ponteiras com barreira de filtro para evitar contaminação cruzada por fagos. Pipete 100 microlitros da biblioteca de fagos junto com as proteínas. Sobre-selar a placa com filme plástico e incubar à temperatura ambiente por uma hora.

Após uma hora, remova a película plástica da placa e, imediatamente, descarte o fago no resíduo biologicamente perigoso agitando a placa. Em seguida, use um pipetador múltiplo para adicionar rapidamente 200 microlitros de um X-T-B-S-T a cada poço. Acerte um cronômetro para um minuto.

Após um minuto, agite o tampão para o resíduo biologicamente perigoso, bata a placa de cabeça para baixo em papel toalha e coloque-a novamente sobre a bancada. Repita as etapas de lavagem 10 vezes após a 10ª lavagem. Retire 200 microlitros de células BLT 5 4 0 3 do tubo cônico de 50 mililitros a quatro graus Celsius e transfira para o fundo de cada um dos nove poços dos quais a última lavagem foi removida.

Envolva as placas com filme plástico e coloque-as a 37 graus Celsius por 20 minutos para permitir que qualquer fago ainda aderido à isca infecte as bactérias. Após 20 minutos, desenrole as placas. Em seguida, remova 10 microlitros de bactérias do poço de replicação BSA a 25 graus Celsius e transfira para os 990 microlitros de meio marcado como um.

Repita este processo mais duas vezes para esse poço, resultando em três triplicatas de uma diluição de 1:100 do fago a partir desse poço; esta é a replicação de BSA amostrada três vezes. Essas diluições serão usadas para estimar a titulação média mais ou menos o erro padrão da média para essa replicação de BSA. Faça o mesmo para a replicação dois e três de BSA, para os três poços replicados da proteína isca envenenada e para o conjunto da proteína isca. Coloque esses 27 tubos EOR de lado. Se as bactérias no frasco apresentarem uma densidade óptica entre 0,6 e 1,0, decante 50 mililitros das células do frasco Erlenmeyer para cada um dos 9 frascos Erlenmeyer de 250 mililitros.

Retire os 170 microlitros restantes de bactérias BLT 5 4 0 3 infectadas com fago na poça de replicação BSA e adicione-os aos 50 mililitros de células marcadas como BSA rep.One. Faça isso para todas as nove poças antes de agitar os frascos no incubador a 37 graus Celsius. Enquanto isso, realize diluições a partir das 27 diluições iniciais, retirando 100 microlitros do LB com bactérias do tubo Einor um e adicionando-os aos 900 microlitros de LB no tubo einor.

Quatro para a diluição de 10 à potência de menos três, descarte a ponteira com barreira filtrante e use uma nova antes de retirar 100 microlitros do LB com bactérias do tubo einor quatro e adicioná-los aos 900 microlitros de LB no tubo eph. Sete para a diluição de 10 à potência de menos quatro, continue a diluição para todas as triplicatas de todas as replicações de todas as proteínas e tratamentos. Deve haver um total de 135 tubos uma vez que as células tenham lisado.

Leve o cultivo a 0,5 molar de cloreto de sódio adicionando cinco mililitros de um estoque de cloreto de sódio cinco molar e transferindo a amostra para um frasco de centrífuga rotulado. Centrifugue a 8.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, decante o sobrenadante contendo o vírus para um tubo cônico estéril e limpo de 50 mililitros. Adicione algumas gotas de clorofórmio ao sobrenadante decantado no tubo cônico.

O sobrenadante pode ser armazenado a quatro graus Celsius para a próxima rodada de seleção por afinidade no terceiro dia; pipete 250 microlitros de células VLT 5 4 0 3 de quatro graus Celsius para cada um dos tubos de ensaio de borossilicato numerados previamente preparados. Em seguida, pipete 100 microlitros da diluição no tubo einor um para os 250 microlitros de células no tubo de ensaio de borossilicato um. Aqueça brevemente os primeiros cinco centímetros da pipeta sobre a chama e mergulhe-a no agarose superior fundido.

Pipete três mililitros e adicione rapidamente no tubo de ensaio sobre as células e o fago. Misture batendo com o dedo enquanto segura o tubo com a outra mão e, em seguida, despeje o conteúdo na placa. Incline a placa e use o tubo de ensaio para remover bolhas e áreas secas até que toda a superfície esteja coberta pelos ágares superiores.

Deixe-o em pé sobre a bancada para esfriar. Descarte o tubo de borossilicato. Ejecte a ponteira com barreira de filtro e pegue uma nova, continuando até que todas as diluições tenham sido plaqueadas.

Retire as placas preparadas do incubador à medida que forem sendo esgotadas, mas não mais do que seis de cada vez, pois elas esfriam e o ágar superior solidifica muito rapidamente. Examine as placas formadas nas placas e descarte aquelas com lise confluente. Determine quais das diluições seriadas restantes produziram um número suficientemente baixo de placas para permitir uma contagem precisa. Registre o número de placas dessas placas e prossiga para calcular o título conforme descrito no protocolo textual no final da seleção por afinidade. Na quarta rodada, selecione 18 colônias individuais de placas bem definidas utilizando uma ponteira estéril amarela.

Umedeça o interior da ponteira com cloreto de tris pH 8,5 em um tubo einor. Em seguida, retire os núcleos dessas placas a partir das placas de titulação empurrando a ponteira através de uma placa bem isolada diretamente até a placa de Petri de plástico abaixo e aspire o núcleo; expulse o núcleo em 100 microlitros de cloreto de tris pH 8,5 no tubo apropriado antes de vórtex. Breve aquecimento de 20 microlitros deste volume a 65 graus Celsius por 10 minutos e prossiga com a PCR e o sequenciamento conforme descrito no protocolo textual mostrado aqui são resultados típicos de titulação por amostragem várias vezes; as contagens finais estimadas não são tão suscetíveis a erros de pipetagem e fornecem uma estimativa mais precisa da titulação real e da variação em torno desta.

Estimativas de poço a poço são obtidas com aumento do título de fagos preferencialmente para a isca não envenenada à medida que aumenta o número de rodadas de seleção por afinidade. Isso também fornece confiança de que a técnica está funcionando. A retenção de uma porcentagem crescente de fagos contendo inserção em poços com isca não envenenada, à medida que aumenta o número de seleções por afinidade, também é auspiciosa após rodadas avançadas de seleção por afinidade.

Um aumento no número de fagos recuperados independentemente que possuem inserção em relação à primeira rodada, e a estabilização desses amplicons em algumas poucas bandas de tamanho idêntico, é um bom indicativo de que clones específicos estão sendo selecionados na seleção por afinidade seguindo este procedimento. Outros métodos, como o teste de duplo híbrido, podem ser realizados para validar as interações descobertas por meio da exibição em fago.