Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

O objetivo geral deste procedimento é descobrir interações proteicas com moléculas de isca imobilizadas. Isso é feito primeiro adquirindo e imobilizando a isca. O segundo passo é introduzir a biblioteca de fagos a ser rastreada na isca sob condições que promovam a ligação.

Em seguida, o fago não ligado é removido por lavagem rigorosa. Enquanto os fagos ligados são usados para infectar as bactérias antes de serem recuperados. A etapa final é amplificar o fago ligado para a próxima iteração da seleção de afinidade.

Em última análise, quando o título do fago se estabiliza, placas únicas são selecionadas e sequenciadas para mostrar quais proteínas têm a maior afinidade pelo atraso imobilizado sob as condições experimentais de ligação. Esse processo pode ajudar a responder a perguntas-chave nas interações proteína-proteína. Este procedimento começa com a proteína recombinante purificada sendo colocada no fundo das placas de microtitulação, conforme descrito no protocolo de texto.

O próximo passo é inocular 50 mililitros de meio Luria burani com 100 microgramas por mililitro de ampicilina em um frasco erlenmeyer de 250 mililitros com uma única colônia previamente cultivada conforme descrito no protocolo de texto, incubar a 37 graus Celsius, 200 RPM em um agitador horizontal e usar um espectrofotômetro para monitorar a densidade celular até obter uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,5 a 0,6. Em seguida, despeje as células em um tubo Falcon de 50 mililitros ou similar e mantenha a quatro graus Celsius até que as células de uso geralmente permaneçam viáveis por aproximadamente uma semana no primeiro dia. Prepare-se para a seleção de afinidade conforme descrito no protocolo de texto na manhã do segundo dia.

Coloque nove frascos erlenmeyer vazios de autoclave de 250 mililitros nas pinças de um agitador de incubação, inocule 500 mililitros de lal burani com 500 microlitros de uma das culturas noturnas de células BLT 5 4 0 3 infectadas por fagos iniciadas na noite anterior após a colocação do frasco na incubadora, ligue o espectrofotômetro e ajuste-o para ler a absorbância em 600 nanômetros. Enquanto isso, remova a placa de microtitulação de quatro graus Celsius e retire o filme plástico. Remova qualquer proteína não ligada do prato lavando 10 vezes com 200 microlitros por poço de um X tris tamponado com solução salina ou TBS pH 7,5 e batendo o prato de cabeça para baixo na toalha de papel entre as lavagens.

Bloco com 200 microlitros por poço de reagente bloqueador a 5% em TBS por uma hora. Com o prato embrulhado em filme plástico, lave a solução de bloqueio 10 vezes com 200 microlitros de um X-T-B-S-T batendo o prato de cabeça para baixo em quatro camadas de papel. Toalha entre as lavagens.

A partir daqui, use pontas de barreira de filtro para evitar a contaminação cruzada de fagos. Pipete 100 microlitros da biblioteca de fagos com as proteínas. Feche novamente a placa com filme plástico e incube em temperatura ambiente por uma hora.

Ao final de uma hora, remova o filme plástico do prato e lave imediatamente, sacudindo o fago no resíduo de risco biológico. Em seguida, use um pipetador múltiplo para adicionar rapidamente 200 microlitros de um X-T-B-S-T a cada um. Bem, defina um cronômetro para um minuto.

Após um minuto, sacuda o tampão para os resíduos de risco biológico, bata o prato de cabeça para baixo em papel toalha e coloque-o de volta na bancada. Repita as etapas de lavagem 10 vezes após a 10ª lavagem. Pegue 200 microlitros de células BLT 5 4 0 3 do tubo de falcão de 50 mililitros a quatro graus Celsius e transfira para o fundo de cada um dos nove poços dos quais a última lavagem foi removida.

Embrulhe os pratos em filme plástico e coloque-os a 37 graus Celsius por 20 minutos para que qualquer fago ainda esteja preso à isca para infectar as bactérias ao final de 20 minutos. Desembrulhe os pratos. Em seguida, remova 10 microlitros de bactérias do BSA a 25 graus Celsius de replicação de um poço e transfira para os 990 microlitros de meio marcado.

Repita este processo mais duas vezes para aquele poço, resultando em três triplicatas de um a 100 diluidos do fago daquele poço, esta é a replicação BSA uma amostra três vezes. Essas diluições serão usadas para estimar o título médio mais ou menos o erro padrão da média para essa replicação de BSA, faça o mesmo para a replicação dois e três de BSA para os três poços replicados da proteína de isca envenenada e para a proteína de isca reserve esses 27 tubos EOR. Se as bactérias no balão tiverem uma densidade óptica de 0,6 a 1,0, decantar 50 mililitros das células do balão de fetos para cada um dos 9 balões de erlenmeyer de 250 ml.

Pegue os 170 microlitros restantes de bactérias BLT 5 4 0 3 infectadas por fagos no poço de replicação BSA e adicione-o aos 50 mililitros de células marcadas como representante BSA. Um. Faça isso para todos os nove poços antes de agitar os frascos na incubadora de 37 graus Celsius. Enquanto isso, realize diluições das 27 diluições iniciais pegando 100 microlitros do LB com bactérias do tubo Einor um e adicionando-o aos 900 microlitros de LB no tubo einor.

Quatro para a diluição de 10 a menos terço, descarte a ponta da barreira do filtro para uma nova antes de obter 100 microlitros de LB com bactérias do tubo einor quatro e adicioná-lo aos 900 microlitros de LB no tubo eph. Sete para a diluição de 10 a menos quarta, continuar a diluição para todos os triplicados de todas as replicações de todas as proteínas e tratamentos. Deve haver 135 tubos no total, uma vez que as células tenham mentido.

Leve a cultura a 0,5 molar de cloreto de sódio adicionando cinco mililitros de um estoque de cloreto de sódio de cinco molares e transferindo a amostra para uma centrífuga de frasco de centrífuga rotulada a 8.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transvase o sobrenadante contendo o vírus em um tubo de falcão limpo e estéril de 50 mililitros. Adicione algumas gotas de clorofórmio ao sobrenadante decantado no tubo Falcon.

O sobrenadante pode ser armazenado a quatro graus Celsius para a próxima rodada de seleção de afinidade no terceiro dia, pipetar 250 microlitros de células VLT 5 4 0 3 de quatro graus Celsius em cada um dos tubos de ensaio de bo silicato numerados previamente preparados. Em seguida, pipete 100 microlitros da diluição no tubo einor um para os 250 microlitros de células no tubo de ensaio de silicato. Um. Aqueça brevemente os primeiros cinco centímetros da pipeta sobre a chama e mergulhe-a no aros superior derretido.

Puxe três mililitros e entregue rapidamente no tubo de ensaio em cima das células e do fago. Misture sacudindo com um dedo enquanto segura o tubo com a outra mão e, em seguida, despeje o conteúdo no prato. Incline a placa e use o tubo de ensaio para perseguir bolhas e manchas secas até que toda a placa esteja coberta pelos agros superiores.

Coloque-o de lado na vertical no banco para esfriar. Descarte o tubo de silicato boros. Ejetar a ponta da barreira do filtro e obter uma nova e continuar até que toda a diluição tenha sido plaqueada.

Recupere as placas preparadas da incubadora à medida que se esgotam, mas não mais do que seis de cada vez ou esfriam e os agros superiores solidificam muito rapidamente, examine a placa formada nas placas e descarte aquelas com lise confluente. Determine quais das diluições seriadas restantes produziram poucas placas suficientes para permitir um registro preciso do número de placas dessas placas e prossiga para calcular o título conforme descrito no protocolo de texto no final da seleção de afinidade. Na quarta rodada, selecione 18 colônias de placas individuais bem definidas usando uma ponta de pipeta amarela estéril.

Molhe o interior da ponta com cloridrato de tris pH 8,5 em um tubo einor. Em seguida, retire o núcleo dessas placas das placas de titulação, empurrando a ponta através de uma placa bem isolada diretamente para a placa de Petri de plástico abaixo e aspirando o núcleo, expulse o núcleo em 100 microlitros de cloridrato de tris pH 8,5 no tubo apropriado antes do vórtice. Resumidamente, aqueça 20 microlitros deste volume a 65 graus Celsius por 10 minutos e prossiga com PCR e sequenciamento conforme descrito no protocolo de texto mostrado aqui são resultados típicos de titulação por amostragem várias vezes as contagens finais estimadas não são tão suscetíveis a erros de pipetagem e uma estimativa mais precisa do título real e a variação em torno disso.

Estimativas de poço a poço são obtidas aumentando o título de fago preferencialmente para a isca não envenenada à medida que o número de rodadas de seleção de afinidade aumenta. Também fornece confiança de que a técnica está funcionando. A retenção de uma porcentagem crescente de inserção de fagos contendo em poços de isca não envenenados à medida que o número de seleções de afinidade aumenta também é auspiciosa após rodadas avançadas de seleção de afinidade.

Um aumento no número de fagos recuperados independentemente que se inseriram em relação à primeira rodada e o assentamento desses amplicons em algumas bandas de tamanho idêntico é uma boa indicação de que clones específicos estão sendo selecionados na seleção de afinidade após este procedimento. Outros métodos, como a facilidade dois híbridos, podem ser realizados para validar as interações descobertas pela exibição de fagos.