Name: Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Aprenda a técnica de exibição fágica para identificar interações proteínicas usando moléculas isca imobilizadas. Este protocolo detalhado permite a seleção por afinidade eficiente e amplificação de fagos ligados.

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Este projeto foi parcialmente financiado por um IOS NSF (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Grant Seed (2011-04375), e Sir Frederick McMaster Bolsa de Investigação para ABD.

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Os autores não têm nada a revelar.

Ao executar o experimento em três poços replicados, fago adquirida independentemente de a mesma ligação com a proteína de isca pode ser distinguida, mesmo se eles são o mesmo clone (isto é, não houve diferença na sequência de nucleótidos da região de CDS que foi adquirido, mas estes têm sido recuperado a partir de poços independentes). Caso contrário, a única maneira de diferenciar entre o fago que codifica para a mesma ligação com a proteína isco é, se eles são independentemente inverter regiões transcritas qu...

Por que usar de apresentação de fagos e seleção de afinidade em vez de uma miríade de outras técnicas disponíveis para descobrir e investigar as interações de proteínas com outras moléculas? Phage display pode reivindicar algumas vantagens únicas em relação a outros métodos de detecção de interações proteína-ligante 1-3 incluindo o seguinte: Muito amplo repertório de moléculas de isca A principal razão é na diversidade de moléculas capazes de actuar como isco na selecção por afinidade 4. A exibição em fagos é um meio muito poderoso para isolar fragmentos de proteínas que interagem com outras proteínas, hidratos de carbono, nucleótidos, etc 5 Essencialmente, se um polímero / molécula pode ser ligada a um suporte recuperável, que podem ser rastreados para afinidade com as proteínas apresentadas em fagos. Além disso, a molécula de isca pode ser acedido para determinar se ele retém a actividade biológica quando imobilizada 6, se as condições usadas para reduce / eliminar a sua actividade são eficazes ou 6, para introduzir as modificações pós-tradução para o isco antes da selecção de afinidade. Resistência aos fagos a fatores externos Uma segunda razão para a utilização de apresentação de fagos, é que é possível que alguns iscos pode exigir esforço ambiental (calor, altas concentrações de agente osmótico, co-factores específicos, etc.) Para capturar as proteínas que interagem com, ou as proteínas apresentadas em fagos pode necessitar ser de alguma forma alterados antes da selecção de afinidade. O factor principal a ser estudado é a interacção entre o isco e proteína, não a condição que permite a interacção ocorrer, ou se é letal para o organismo de teste. O fago T7 é particularmente bem adequada para estes estudos porque pode suportar condições experimentais agressivos tanto intacta e viável (por exemplo, o máximo térmico publicado para a viabilidade de T7 é ~ 60 ° C 7). Como um exemplo de alteração fago exibido próproteínas, ao analisar o proteoma semente Arabidopsis thaliana para substratos de proteínas da enzima de reparação, Proteína Isoaspartyl Metil Transferease (PIMT), o vírus utilizado nestes estudos foi &quot;idade&quot;, durante uma semana, antes de cada seleção afinidade rodada, para incentivar a introdução de isoaspartate (isoAsp) resíduos de proteínas suscetíveis 6 que não é possível em organismos que podem reconhecer e reparar / metabolizam essas anormalidades. Metabolicamente inerte Além disso, os fagos são geralmente resistentes aos venenos metabólicos e interferindo pequenas moléculas que, no mínimo, resultar em efeitos pleiotrópicos sobre organismos de teste metabolicamente activas. Após as lavagens de rigor, o veneno é removido antes de uma grande quantidade de bactérias são introduzidos por infecção de modo que o veneno é diluída a uma gama inócuo para a bactéria ou a replicação do fago subsequente. Ao investigar alvos da proteína do reparo PIMTenzima, de S-adenosil-metionina (AdoMet) foi usado para activar a enzima de micro-titulação de placa-bem imobilizada para permitir a captura de proteína alvo, baseando-se S-adenosil-homocisteína (AdoHcy) para inactivar a enzima e proporcionar um controlo negativo útil fixar em do conhecimento que o vírus não seria influenciada negativamente por qualquer AdoMet ou AdoHcy 6. Além disso, os membros de certas famílias Abundante embriogénese tardia (LEA), proteína investigados neste laboratório, são conhecidos para alterar a sua forma, na presença de aditivos tais como sacarose, 8, que podem atingir concentrações tão elevadas como 200 mM em sementes de soja, no ponto de maturidade fisiológica 9. O vírus não está prevista para ser influenciado pela adição de 200 mM de sacarose em cada fase de selecção de afinidade, possivelmente necessário para certas interações proteína LEA-cliente, o que não é o caso de organismos de teste de forma autônoma viáveis ​​10. Este laboratório tem se concentrado em DESCOBERTAg interações proteína-proteína em, sementes desidratadas ou germinando maduros que fundamentam o mecanismo de proteção proteoma armazenadas durante 11 desidratação ou reparação de componentes do proteoma armazenado que são suscetíveis à formação isoAsp uma vez que a semente tem absorvido 6. Assim, a produção e purificação de proteínas recombinantes exigidos como isca em um estado ativo, e garantir que eles permaneçam assim, antes e depois de serem imobilizados, embora freqüentemente difícil, é um dos pilares para o nosso trabalho. No entanto, como cada um dos cenários de produção de proteína recombinante é diferente, as condições para a optimização da produção de proteína recombinante não será abordada aqui. Os utilizadores são convidados a tentar, sempre que possível, para determinar se a proteína imobilizada é funcional (por exemplo, se se trata de uma enzima, fazer um ensaio de enzima nos poços da placa de microtitulação). Isto irá fornecer alguma confiança de que a isca é biologicamente ativo e, portanto, que todas as interações são descobertosum pouco mais propensos a ter relevância biológica.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Becton Dickinson Co.</td><td></td><td></td>Extrato</tr> de <tr><td>levedura</td> 211705 <td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de bloqueio</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>69064</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BLT5403</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>BLT5403</td><td>Genótipo: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)</td></tr><tr><td>Ampicilina, </td><td></td> Brometo de Etídio <td>Fisher</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>BP102-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>Penta-HIS anticorpo primário</td><td>Qiagen Inc.</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado de fosfata alcalina anti-rato de cabra</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-5153</td><td></td></tr><tr><td>para-nitrofenilfosfato</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>N-7653</td><td></td></tr><tr><td>T7-UP primer</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5' - GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN</td></tr> <tr><td>primeira demão</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick</td></tr> <tr><td>PCR kit de purificação</td><td>Qiagen Inc.</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit de extração de gel </td><td>Qiagen Inc.</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Sequenciamento de Ciclo Big Dye Terminator v3.1</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>4336917</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de Aquecimento</td><td>Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)</td><td>18780</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Células de 96 poços</td><td>Corning</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Incubator Forno</td><td>Pipetas Pasteur</td><td>516D</td><td></td>da Fisher</tr><tr><td>Scientific, 5 &#190; em</td><td>Transiluminador ChromaView</td><td>13-678-20A</td><td></td>da Fisher</tr><tr><td></td><td>Scientific UVP Inc.</td><td>TS-15</td><td></td></tr><tr><td>UV Shield</td><td>Oberon</td><td>071AF</td><td></td></tr><tr><td>Luvas, Nitrilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-170-010C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estéreis de 1,5 ml</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de borosilicato de 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25E</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura de borosilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-27</td><td></td></tr><tr><td>Uniskan I, leitor de placas ELISA</td><td>Labsystem and Flow Laboratories, Helsinque, Finlândia</td><td>Tipo 362</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo para exibição fago e affinity seleção usando iscas proteína recombinante

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Usando fago recombinante como um andaime para apresentar várias porções de proteínas codificadas por uma biblioteca de cDNA direcionalmente clonado para moléculas imobilizadas isca é um meio eficiente para descobrir interações. A técnica tem sido largamente usado para detectar interacções proteína-proteína, mas a molécula do isco a ser desafiados não precisa ser restrito a proteínas. O protocolo aqui apresentado foi optimizada para permitir que um pequeno número de iscos para ser exibido em repetições para maximizar a identificação de clones independentes que apresentam a mesma proteína. Isto permite uma maior confiança de que as proteínas que interagem identificados são interagentes legítimos da molécula isca. Monitorando a título de fagos depois de cada selecção de afinidade rodada fornece informações sobre a forma como a selecção por afinidade está progredindo, bem como sobre a eficácia dos controlos negativos. Um meio de titulação do fago, e como eo que se preparar com antecedência para permitir que este processo avance de forma tão eficiente comopossível, é apresentada. Atributos de amplicões obtidos após isolamento de placas independentes são destacadas que pode ser utilizado para determinar quão bem a selecção de afinidade progrediu. Problemas técnicas para minimizar falsos positivos ou de contornar persistentemente recuperado fago tiro são explicados. Meios de reduzir a contaminação viral surto são discutidos.

Ser capaz de prejudicar a capacidade de o isco para interagir com proteínas exibidas em fagos (metabolicamente envenenando o isco) proporciona um controlo negativo potente para esta técnica. Também é aconselhável para determinar se o isco,, quando ligados à placa de microtitulação, mantém a sua função. Ambos os cheques aumentará a confiança que interagem, proteínas exibida de fagos recuperados pela isca nonpoisoned são legítimos. Amostragem de três triplicados de cada cavidade aumenta consid...

A exibição em fagos é uma técnica poderosa para captura de proteínas ou fracções de proteínas que interagem com uma molécula de interesse imobilizada. Uma vez tomada uma decisão sobre o tipo de biblioteca de cDNA de fagos para criar e tela, o protocolo descrito aqui permite a seleção de afinidade eficiente levando à identificação de interagentes.

Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

O objetivo geral deste procedimento é descobrir interações proteicas com moléculas isca imobilizadas. Isso é realizado primeiramente adquirindo e imobilizando a isca. O segundo passo é introduzir a biblioteca de fagos a ser triada na isca sob condições que promovam a ligação.Em seguida, os fagos não ligados são removidos por lavagens rigorosas. Enquanto isso, os fagos ligados são utilizados para infectar as bactérias antes de serem recuperados. O passo final consiste em amplificar os fagos ligados para a próxima iteração de seleção por afinidade.No final, quando o título do fago atinge uma platô, placas individuais são selecionadas e sequenciadas para mostrar quais proteínas possuem maior afinidade pelo retardamento imobilizado nas condições experimentais de ligação. Esse processo pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre interações entre proteínas. Este procedimento começa com a proteína recombinante purificada sendo colocada no fundo de placas de microtitulação conforme descrito no protocolo textual.O próximo passo é inocular 50 mililitros de meio Luria burani com 100 microgramas por mililitro de ampicilina em um frasco erlenmeyer de 250 mililitros com uma única colôni

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

AVEXIS é uma alta taxa de ensaio interação proteína desenvolvida para a tela de forma sistemática para novas extracelular do receptor-ligante pares envolvidos em processos de reconhecimento celular. Ele é projetado especificamente para detectar interações protéicas transitórios que são difíceis de identificar com outras abordagens de alto rendimento.

Avidez baseado Triagem Interação Extracelular (AVEXIS) para a detecção escalável de baixa afinidade Extracelular receptor-ligante Interações

Neste vídeo, demonstramos a técnica de exibição de fagos para isolar fagos pré-projetados que expressam proteínas com alta afinidade com a proteína-alvo.

Usando a exibição de fagos para selecionar proteínas com alta afinidade com uma proteína-alvo

Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para a descoberta dos reagentes de afinidade do peptide, uma alternativa robusta para anticorpos. O método de classificação semi-automatizadas aqui simplificou biopanning para diminuir a ocorrência de falsos positivos. Aqui ilustramos o processo de pensamento e técnicas aplicadas na avaliação de candidatos e minimizando a análise a jusante.

Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

Os protocolos descritos permitem a construção, caracterização e seleção (contra o destino de escolha), de uma biblioteca de "domainome", feita a partir de qualquer fonte de DNA. Isto é conseguido por um pipeline de pesquisa que combina diferentes tecnologias: a exibição do fago, repórter dobrável e sequenciamento de próxima geração com uma ferramenta web para análise de dados.

Interactome-Seq: Um protocolo para a construção da biblioteca de Domainome, a validação e a seleção por Phage Display e a próxima geração de sequenciamento

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para a construção de uma biblioteca de anticorpo sintético do fago-exibido com diversidade sob medida. Anticorpos sintéticos têm aplicações amplas de pesquisa básica para o diagnóstico da doença e terapêutica.

Construção do fago sintética exibida Fab biblioteca com diversidade sob medida

Aqui nós apresentamos um método para selecionar para variantes novas do ligase BirA da biotina-proteína de E. coli que biotinylates um peptide específico do alvo. O protocolo descreve a construção de um plasmídeo para a exposição bacteriana do peptídeo alvo, geração de uma biblioteca BirA, seleção e caracterização de variantes de BirA.

Exposição bacteriana do peptide para a seleção de enzimas Biotinylating novas

Criar sistemas quimicamente induzidos da dimerização da proteína com afinidade e especificidade desejadas para toda a ligand pequena da molécula dada teria muitas aplicações biológicas da detecção e do atuação. Aqui, descrevemos um método eficiente e generalizável para a engenharia de novo de sistemas de dimerização quimicamente induzidos através da seleção manada de uma biblioteca de anticorpos combinatorial de domínio combinatório exibida por fago.

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

Este estudo teve como objetivo apresentar uma estratégia para identificar interações medicamentosa-peptídeos. A estratégia envolve o biopanning de peptídeos curtos que reconhecem drogas com base em um biosensor de microequilísã de quartzo-cristal (QCM), seguido de análise bioinformática para avaliação quantitativa das informações obtidas para o reconhecimento de medicamentos e anotação dos locais de ligação medicamentosa em proteínas.

Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

Este artigo fornece uma metodologia detalhada para a dosagem de isolevuglandinas em tecidos por imunofluorescência usando o anticorpo ScFv D11 conjugado à fosfatase alcalina. Modelos de hipertensão em camundongos e humanos são usados para explicar os procedimentos passo a passo e os princípios fundamentais associados à dosagem de isolevuvolina em amostras de tecido.

Detecção direta de isolevuvolinas em tecidos usando uma proteína de fusão D11 scFv-fosfatase alcalina e imunofluorescência

A ubiquização é uma modificação pós-translacional de proteínas críticas, que tem sido implicada em inúmeras doenças humanas. Este protocolo detalha como o display phage pode ser utilizado para isolar novas variantes de ubiquitina que podem ligar e modular a atividade de ligaduras E3 que controlam a especificidade, eficiência e padrões de ubiquização.

Usando o Phage Display para desenvolver moduladores variantes de Ubiquitin para Ligases E3

Aprenda a técnica de exibição fágica para identificar interações proteínicas usando moléculas isca imobilizadas. Este protocolo detalhado permite a seleção por afinidade eficiente e amplificação de fagos ligados.

Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

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