Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas
December 1st, 2020
Este estudo teve como objetivo apresentar uma estratégia para identificar interações medicamentosa-peptídeos. A estratégia envolve o biopanning de peptídeos curtos que reconhecem drogas com base em um biosensor de microequilísã de quartzo-cristal (QCM), seguido de análise bioinformática para avaliação quantitativa das informações obtidas para o reconhecimento de medicamentos e anotação dos locais de ligação medicamentosa em proteínas.
A identificação de interações proteicas de pequenas moléculas é essencial para a pesquisa e desenvolvimento de medicamentos, bem como para promover nossa compreensão dos mecanismos patológicos subjacentes aos DTCs de vírus. Este método facilita a biopanning de alto rendimento de peptídeos de reconhecimento de medicamentos e a validação global de locais de ligação de medicamentos em proteínas para medicamentos de moléculas pequenas de interesse. Para preparar um chip sensor QCM, conecte um chip sensor de cerâmica ao oscilador de um aparelho QCM de 27 megahertz e registre a frequência intrínseca na fase aérea antes da imobilização de pequenas moléculas.
Após a gravação, retire o chip e adicione cuidadosamente uma gota de 20 microlitros de uma solução derivada de molécula pequena de um milimolar em etanol a 70% para criar uma camada mono automontada no eletrodo de ouro do chip do sensor. Coloque o chip em uma placa de Petri forrada com tecido umedecido, proteja-o da luz por uma hora em temperatura ambiente antes de lavar suavemente a superfície do eletrodo com água ultrapura. Seque o chip com uma aplicação suave de ar e carregue o chip no aparelho QCM.
Após uma hora, registre a redução da frequência na fase aérea para medir a quantidade da pequena molécula que foi imobilizada. Para T7 Phage Library Biopanning, coloque uma cubeta com um agitador magnético dedicado no biossensor QCM ajustado para 1000 rotações por minuto e adicione oito mililitros de tampão de reação à cubeta Enquanto o buffer está sendo agitado, conecte o chip do sensor QCM ao oscilador Mantenha pressionado o braço do oscilador para mergulhar o chip no buffer e comece a monitorar a frequência do QCM. Quando o grama do sensor se equilibrar em cerca de três Hertz por minuto de desvio de frequência, injete oito microlitros de uma biblioteca de fagos T7 na cubeta e marque o ponto de injeção no sensor.
Monitore a redução de frequência causada pela ligação dos fagos T7 à pequena molécula imobilizada na superfície do eletrodo de ouro. Após 10 minutos, pare o monitor de frequência QCM e levante rapidamente o oscilador para remover o chip do sensor do lote, desconecte o chip do sensor do oscilador e remova o buffer do chip. Coloque o chip sensor seco em uma placa de Petri úmida e adicione uma gota de 20 microlitros de células hospedeiras de E-coli em fase logarítmica no eletrodo de ouro.
Incube o prato em um misturador de microplacas de 96 poços a 37 graus Celsius e 1000 a 1500 rotações por minuto por 30 minutos, protegido da luz para melhorar a recuperação dos sete fagos T7 ligados. No final da incubação, transfira os 20 microlitros de suspensão de E-coli para 200 microlitros de meio LB. De acordo com o procedimento geral, conduza o isolamento da placa do fago no meio e o sequenciamento de DNA que codifica as sequências peptídicas de reconhecimento da droga exibidas em cada capsídeo do fago.
Como após a manutenção do chip do sensor, use um cotonete embebido em solução de dodecil sulfato de sódio a 1% para limpar a superfície do eletrodo, lave a superfície dourada com água ultrapura e seque o eletrodo com ar. Em seguida, trate a superfície do eletrodo com cinco microlitros de solução paranaense recém-preparada por cinco minutos, seguida de uma lavagem com água ultrapura e secagem ao ar duas vezes. Para realizar a análise de bioinformática usando o RELIC, descompacte o programa RELIC autônomo em um PC com sistema operacional Windows e use as sequências de aminoácidos de peptídeos de 15 mer selecionados por drogas ou proteínas únicas ou múltiplas em cada arquivo de texto com formato A rápido.
Coloque os arquivos de texto necessários na pasta AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con ou fast A scan. Clique em cada arquivo executável na pasta independente para abrir a versão pessoal do FTN 95 e insira o nome e a extensão do arquivo apropriados na linha de comando para executar cada programa e obter o arquivo de formato de texto resultante. Os arquivos de formato de texto resultantes obtidos são mostrados aqui.
Em seguida, exporte o arquivo de texto resultante para uma planilha para gerar um gráfico de conteúdo de informações ou pontuações de similaridade cumulativas calculadas usando um golpe de cerca de 62. Usando essa estratégia, locais de ligação de moléculas pequenas únicas e múltiplas nas proteínas-alvo foram identificados com sucesso para seis medicamentos de moléculas pequenas. Por exemplo, 29 peptídeos que reconhecem o medicamento clinicamente aprovado Irinotecano imobilizado como uma monocamada auto-montada foram identificados por biossensor QCM baseado em biopanning de um ciclo O alinhamento subsequente dos pares dos 29 peptídeos e da acetilcolinesterase produziu pontuações máximas para resíduos de aminoácidos específicos que eram consistentes com aqueles que compõem o local de ligação do irinotecano.
Este mesmo subconjunto de peptídeos também foi identificado com sucesso nas proximidades da tríade catalítica na carboxilesterase, indicando que esses aminoácidos formam um andaime para o reconhecimento do irinotecano durante a desesterificação. Os 27 peptídeos que reconhecem o medicamento antigripal Oseltamivir cobrindo a superfície do eletrodo de ouro do chip do sensor QCM detectaram com sucesso o local de ligação do oseltamivir na neuraminidase. Este sítio de ligação consiste em alças peptídicas não estruturadas que potencialmente sofrem movimento dinâmico durante a acoplação com oseltamivir.
Medicamentos, regiões, produtos químicos, bacteriófagos recombinantes e bactérias são carros funerários biológicos e devem ser manuseados de acordo com o protocolo de ganho de cultura. Lembre-se de sempre usar luvas, óculos de proteção e jaleco por segurança. Após esse procedimento, as proteínas-alvo de vários medicamentos podem ser validadas globalmente em humanos, vírus patológicos e até plantas para entender os mecanismos moleculares e a potencial eficácia terapêutica dos medicamentos de interesse.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma estratégia para identificar interações entre drogas e peptídeos usando um biossensor de microbalança de cristal de quartzo (QCM). O método envolve biopanning de peptídeos que reconhecem drogas e análise bioinformática para avaliar o reconhecimento e os sítios de ligação de drogas em proteínas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Desenvolvimento de Medicamentos
- Biotecnologia
Fundamentos
- Entender as interações entre pequenas moléculas e proteínas é crucial para a pesquisa de medicamentos.
- Métodos de alto rendimento são necessários para o biopanning de peptídeos.
- Os biossensores QCM fornecem uma plataforma para estudar a ligação de medicamentos.
- Identificar sítios de ligação auxilia no desenvolvimento terapêutico.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para identificar peptídeos que se ligam a medicamentos.
- Validar sítios de ligação de medicamentos em proteínas alvo.
- Aprimorar a compreensão das interações medicamentosas em nível molecular.
Métodos Utilizados
- Preparação de chips de sensor QCM para imobilização de moléculas pequenas.
- Biopanning usando bibliotecas de fagos T7 para identificar peptídeos de ligação.
- Monitoramento de mudanças de frequência em QCM para avaliar interações de ligação.
- Análise bioinformática para avaliação da sequência de peptídeos.
Principais Resultados
- Identificação bem-sucedida de peptídeos que reconhecem medicamentos como Irinotecan e Oseltamivir.
- Caracterização de sítios de ligação em proteínas como acetilcolinesterase e neuraminidase.
- Método comprovado como eficaz na validação de interações medicamentosas.
Conclusões
- A estratégia identifica efetivamente os sítios de ligação de medicamentos em proteínas.
- Pode ser aplicada a vários medicamentos para insights terapêuticos.
- Aprimoras a compreensão dos mecanismos moleculares na ação dos medicamentos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This biosensor-based high throughput strategy enables rapid global validation of drug-protein interactions, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying drug-recognizing peptides and mapping binding sites on target proteins, the method enhances predictive confidence in lead selection and reduces biological uncertainty in preclinical development. The approach applies to diverse small molecules, offering a reusable capability for assessing ADMET-relevant interactions across therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying peptide sequences that recognize drug-binding sites on proteins.
- Operational Value: Supports functional target validation through high throughput biopanning of T7 phage-displayed peptides immobilized on QCM biosensors.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by highlighting amino acid residues consistent with known drug-binding sites, such as the catalytic triad in carboxylesterase for irinotecan recognition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative frequency shift data from QCM biosensor to measure small molecule immobilization and phage binding kinetics.
- Operational Value: Establishes a reproducible, label-free assay format for monitoring biomolecular interactions in real time with minimal sample consumption.
- Scalability: Enables parallel processing of phage libraries and bioinformatics analysis via RELIC suite for high throughput peptide screening and motif identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro binding data to biological relevance by validating drug recognition in pathogenic contexts, such as neuraminidase for oseltamivir.
- Disease-Relevant System: Applies to target proteins in humans, viruses, and plants, supporting cross-species validation of drug mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement and binding site fidelity before investing in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing orthogonal confirmation of drug-target interactions that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating drug-recognizing peptides and clarifying binding site topology on target proteins.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized peptide outputs suitable for downstream epitope mapping and antibody development.
- Analytics: Yields quantifiable binding metrics (frequency shifts) and bioinformatics-derived similarity scores to rank peptide candidates and validate binding specificity.
- Translational Research: Connects molecular binding data to functional outcomes by linking peptide sequences to enzyme inhibition or viral replication assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for repeated application across drug classes, targets, and model systems without reformatting core workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct evidence of drug-peptide interaction and binding site mapping.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized QCM sensor preparation and phage recovery protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed targets through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of drug candidates based on validated target engagement and interaction topology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in QCM biosensor operation, phage display techniques, and bioinformatics analysis using RELIC suite.
- Depends on access to 27 MHz QCM apparatus, magnetic stirrer cuvettes, and compatible sensor chips for small molecule immobilization.
- Necessitates standardized buffer conditions and incubation parameters to ensure consistent phage binding and recovery across runs.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different protein targets or small molecule chemistries beyond the demonstrated irinotecan and oseltamivir models.
- Includes practical limitations such as the need for careful surface regeneration between cycles to maintain sensor sensitivity and avoid cross-contamination.
