Avidez baseado Triagem Interação Extracelular (AVEXIS) para a detecção escalável de baixa afinidade Extracelular receptor-ligante Interações

O objetivo geral deste procedimento é descobrir novas interações de proteínas extracelulares envolvidas em processos de reconhecimento celular, em particular proteínas receptoras incorporadas à membrana. A abordagem AveXis foi projetada para contornar as afinidades de interação muito fracas que tipificam essa classe de interações proteicas e o fato de que as proteínas de membrana são difíceis de manipular bioquimicamente. Isso é feito compilando primeiro uma biblioteca de proteínas recombinantes das regiões extracelulares dos receptores da superfície celular.

Isso é conseguido projetando plasmídeos de expressão para produzir as regiões do domínio ecto dos receptores como fragmentos solúveis como iscas monoméricas biotiniladas e elogios marcados com enzima pentâmero. O segundo passo é expressar e normalizar as proteínas para estarem prontas para a triagem de interação. Todas as proteínas são produzidas em células de mamíferos para garantir que modificações pós-traducionais, como diss, sulfeto, ligações e glicosilação, sejam adicionadas.

Uma etapa crucial no protocolo é garantir que as proteínas de isca e presa dentro da biblioteca sejam normalizadas para dentro dos níveis limite. Em seguida, vem a parte emocionante, a triagem de novas interações. Os Bates são dispostos em poços individuais de uma placa de microt e, em seguida, sondados para interações usando o elogio.

Em seguida, uma etapa de lavagem é executada. A etapa final é adicionar o substrato para a enzima detectar qualquer elogio capturado nas matrizes de proteínas de isca. Em última análise, os resultados de uma triagem VEX podem mostrar quais receptores de surfistas celulares são capazes de formar parceiros de ligação e, portanto, podem estar envolvidos nos processos de reconhecimento e comunicação entre as células.

A principal vantagem desta técnica de métodos populares de extração de proteínas, como a levedura de duas purificações híbridas ou bioquímicas, é que ela é projetada especificamente para detectar interações extracelulares de proteínas e proteínas. É especialmente adequado para descobrir novas interações entre proteínas receptoras ligadas à membrana. Essas interações são difíceis de detectar usando outras técnicas porque as proteínas de membrana são bioquimicamente difíceis de manipular e, normalmente, suas interações com contra-receptores são extremamente fracas.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas a como as células se reconhecem e se comunicam umas com as outras. No nível molecular, pode ser usado para responder a perguntas relacionadas a processos biológicos básicos, como quais proteínas receptoras exibidas na superfície de óvulos e espermatozóides se combinam, ou quais interações de ligantes de receptores são responsáveis por comportamentos celulares, como fusão de miócitos ou formação de crista neural. O principal desafio com essa abordagem é compilar as bibliotecas de proteínas de isca e oração para rastrear as interações.

Também é muito importante certificar-se de que as proteínas da isca e da presa sejam normalizadas dentro dos níveis limite exigidos para o ensaio. Isso reduz a frequência de falsos negativos e falsos positivos. Tive a ideia desse método pela primeira vez durante meu doutorado, quando estava tentando identificar um parceiro de ligação para a proteína de superfície celular CD 200.

Essencialmente, eu estava fazendo a pergunta: qual é o padrão de ligação para esse receptor de superfície celular específico? Ainda hoje? Esta continua sendo uma pergunta tecnicamente difícil de responder naquela época, no entanto, o genoma humano estava quase completo e percebi que, como agora tínhamos uma lista completa de todos os receptores de superfície celular no genoma, poderíamos agora perguntar dentro deste conjunto de proteínas receptoras que podem interagir tecnicamente.

Esta é uma pergunta muito mais fácil de responder, e o AveXis foi o método que desenvolvemos para respondê-la. Uma vez estabelecida uma biblioteca de vetores de isca e pré-expressão, prepare-se para transfectá-los em células HEC 2 9 3 E comece semeando as células no dia anterior à transfecção a uma densidade de 250.000 células por mililitro em 50 mililitros de meio freestyle 2 9 3 para garantir uma biotina eficiente. Suplementar o meio usado para produzir proteínas de isca, não proteínas de presa com d biotina com todas as placas preparadas, incubar as células durante a noite em condições padrão.

Como a biotina tem baixa solubilidade e solução precisa, preferimos pesar a biotina adicional e, em seguida, adicionar à mídia e agitar vigorosamente no dia seguinte. Transfect 50 mililitros de células cultivadas com 25 microgramas do plasmídeo de isca ou presa usando um reagente de transfecção adequado para produzir iscas biotiniladas cot transfect. A isca é construída em uma proporção de 10 para um com plasmídeos que codificam uma forma secretada da proteína ELI biotina ligase por uma colheita.

As culturas cinco dias após a transfecção, primeiro empalidecendo as células por centrifugação a 3000 vezes a gravidade por 20 minutos e, em segundo lugar, filtrando o sobrenadante S através de um filtro de 0,22 mícron. Uma das principais características do AveXis é que, como as proteínas recombinantes são secretadas, elas podem ser diluídas ou concentradas dentro das atividades limiares. Descobrimos que as proteínas recombinantes têm expressão variável de até quatro ordens de magnitude, portanto, a etapa de normalização reduz a ocorrência de falsos positivos durante as etapas de triagem.

Para iniciar a normalização da isca, a biotina não conjugada deve ser removida do meio por diálise, pois competirá pela proteína da isca biotinilada para se ligar ao strept nos locais de ligação, começando prendendo a isca em um tubo de diálise. Para garantir uma diálise eficaz das proteínas recombinantes, descobrimos que é importante fornecer excesso de área de superfície ao tubo de diálise. Normalmente, fornecemos duas a três vezes mais tubos do que o realmente necessário para o volume que está sendo dilisado.

Durante um período de 24 horas, dialisou a isca extensivamente contra um tampão adequado, como o PBS, após a realização da diálise. Um ELIZA começa bloqueando os poços de uma placa de microt codificada por estreptococos com PBST contendo BSA por 15 minutos. Enquanto isso, em um prato limpo, faça uma série de quatro diluições de um a três das proteínas da isca em PBST com 2% BSA.

Após a incubação de 15 minutos, transfira a diluição para a placa codificada de estreptococos TTR e incube a placa por uma hora em temperatura ambiente após uma hora, lave os poços e, em seguida, a cada um, adicione bem 100 microlitros de dois microgramas por mililitro OX 68. Incube a placa em temperatura ambiente por mais uma hora. Após a segunda incubação, faça outra série de lavagens e carregue a placa com fosfatase alcalina anti-US.

Incube a placa por uma terceira hora em temperatura ambiente. Agora lave a placa três vezes em PBST e dê uma lavagem final PBS. Para remover qualquer detergente residual, adicione 100 microlitros de um miligrama por mililitro de substrato 1 0 4 em tampão de dietanolamina após uma hora.

À temperatura ambiente, medindo a absorbância de 4 0 a 5 nanômetros, uma série de diluição de quatro iscas dialisadas diferentes supinadas foi detectada por Eliza usando um anticorpo monoclonal anti CD de quatro marcas. Se as proteínas de isca expressa não diluídas forem insuficientes para saturar todos os locais de ligação à biotina de uma placa revestida com ENC ávida por estreptococos, concentre a proteína usando um concentrador de spin Viva. Caso contrário, use a proteína da isca em uma concentração diluída em PBST com 2% de BSA.

Isso é apenas o suficiente para saturar o local de ligação da biotina do ensaio. Quantifique os níveis relativos nos quais as pré-proteínas são expressas usando a atividade da enzima beta lactamase. Comece fazendo uma série de diluições do supinato contendo as paraproteínas em tampão PBST 2% BSA.

Em seguida, adicione 20 microlitros da diluição a 60 microlitros de uma solução de passo nitroso carregada em uma placa. Transfira imediatamente a placa para um leitor de placas e meça a absorbância de 4 a 85 nanômetros uma vez a cada minuto durante os próximos 20 minutos usando concentradores centrífugos ou PBST de diluição com 2% BSA. Defina a concentração final das amostras para hidrolisar todos os nitros no ensaio em cerca de sete minutos, o que equivale a cerca de dois ol nitros turnover por minuto.

Comece a tela AveXis lavando uma placa revestida com estreptococos TAVR ENC em PBST e batendo a placa contra uma toalha de papel. Em seguida, adicione PBST com BSA a cada poço e incube a placa por 30 minutos. Isso bloqueia um local de ligação de proteína espúrio.

Dentro de cada um, remova bem a solução de bloqueio com um movimento inteligente da placa sobre uma pia e adicione 100 microlitros de isca monomérica biotinilada normalizada aos poços apropriados. Incube a placa por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova as amostras de isca da placa com outro movimento e lave-a três vezes com PBST.

Em seguida, seque após a terceira lavagem. Agora adicione 100 microlitros da construção de presa pentâmero normalizada a cada poço e incube a placa em temperatura ambiente por uma hora. Depois de uma hora, dê mais três lavagens à placa com PBST e uma lavagem final apenas com PBS.

Finalmente, adicione 60 microlitros de solução nitrosa sete a cada poço e incube a placa em temperatura ambiente por duas horas ou, de preferência, incube as placas por 16 horas a quatro graus SIUs. No dia seguinte, as interações positivas terão ficado vermelhas. Tire uma fotografia da placa para um registro visual e, em seguida, quantifique as reações em uma absorbância de 4 a 85 nanômetros usando um leitor de placas.

Após cerca de 10 minutos do início da reação de triagem do AveXis, foram observadas mudanças de cor amarela a vermelha no controle de captura de presas mediado por anticorpos e também na interação de controle positivo. Esta mudança de cor indica hidrólise do nitroso no substrato. Algumas interações positivas são observáveis nesta escala de tempo, mas a maioria levou algumas horas para aparecer.

Normalmente, foi observada uma taxa de acerto de cerca de 0,4 a 0,6% de positivos. Uma vez que as bibliotecas de proteínas são preparadas, a parte de triagem desta técnica pode ser feita rapidamente. É bem possível rastrear até 12 placas em um dia após identificar uma interação.

O próximo passo mais importante é, em primeiro lugar, mostrar que a interação pode ser repetida usando preparações proteicas independentes frescas. Em segundo lugar, sempre determinamos se a interação é independente da orientação da presa da isca, ou seja, ela pode ser recíproca? Isso envolve a clonagem dos domínios do vetor de isca no vetor da presa e vice-versa.

As interações que podem ser repetidas e recíprocas são consideradas de alta confiança e sempre se mostraram positivas. Usando outras técnicas, como ressonância de plasma de superfície, gostamos de usar plasma de superfície em ressonância para validar adicionalmente quaisquer interações que reidentificamos. É importante ressaltar que isso fornece uma demonstração de que os dois componentes purificados podem interagir diretamente e também podem ser usados para mostrar que a ligação é sat e, portanto, específica.