Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos
5 de setembro de 2013
Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras.
Este experimento de microscopia de fluorescência avalia a viabilidade de bactérias individuais associadas a células hospedeiras e determina a viabilidade bacteriana em diferentes localizações subcelulares. Primeiro, para identificar bactérias externas, exponha as células infectadas a um reagente fluorescente específico para a permease bacteriana, o hospedeiro infectado na presença de corantes fluorescentes que discriminam bactérias viáveis de não viáveis com base na integridade da membrana bacteriana. Em seguida, para indicar onde as bactérias estão localizadas no interior das células hospedeiras, incube as células infectadas com um anticorpo conjugado com fluorescência contra um marcador de interesse.
As imagens de imunofluorescência resultantes podem determinar a porcentagem de bactérias viáveis dentro e fora das células hospedeiras, bem como a localização subcelular de bactérias viáveis versus não viáveis no interior da célula. Diferentemente dos ensaios de contagem de colônias, ensaios de proteção com gentamicina e microscopia eletrônica, este método permite a avaliação direta da viabilidade de bactérias individuais. Além disso, pode revelar se bactérias em diferentes compartimentos subcelulares apresentam diferenças em sua viabilidade.
Demonstrará este procedimento Brittany Johnson, aluna de pós-graduação do meu laboratório. A células cultivadas em lamínulas circulares de vidro em placas de 24 poços, adicione as bactérias de interesse e incube pelo tempo desejado. Lave as células infectadas uma vez suavemente. Em seguida, adicione o anticorpo conjugado com Alexa Fluor 6 4 7 ou uma lectina específica para bactérias para detectar as bactérias externas e incube por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente.
Após duas lavagens, aspire o meio e adicione 0,5 mililitros de solução de coloração vital contendo citro nove e iodeto de propídio. Incube as células por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro, depois lave duas vezes em cloreto de magnésio mops. Inverta as lamínulas com a face voltada para baixo sobre lâminas de vidro.
Selar com esmalte incolor. Adquirir as imagens dentro de 30 minutos utilizando um microscópio de fluorescência com conjuntos de filtros descritos no protocolo textual para rotular as bactérias. Adicionar 10 microgramas por mililitro de DPI em meio definido mors e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro.
Agora, infecte as células aderentes com bactérias marcadas com DPI. Não fixe as células com aldeídos ou solventes orgânicos. Lave as células uma vez.
Em seguida, adicione o anticorpo ou lectina conjugado com Alexa Fluor 647 e incube por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após duas lavagens com tampão mops, adicione um anticorpo conjugado com Alexa Fluor 555 contra o marcador subcelular de interesse e incube por 20 minutos. Após duas lavagens com tampão mops, lave as células uma vez com tampão mops cloreto de magnésio. Em seguida, aspire o meio e adicione citogreen 0,4 micromolar; incube as células por cinco minutos à temperatura ambiente no escuro e lave as células duas vezes com tampão mops cloreto de magnésio.
Em seguida, lave as células mais uma vez em MOPS com cloreto de magnésio por cinco minutos. Inverta as lamínulas com a face para baixo sobre lâminas de vidro e selar com esmalte incolor, adquirindo imagens das lâminas em até 30 minutos no microscópio de fluorescência.
Neste experimento, neutrófilos humanos foram infectados com gonorréia. A lectina de soja conjugada com Alexa Fluor 647 detecta a gonorréia extracelular. Em seguida, o corante verde fluorescente de viabilidade e o iodeto de propídio fluorescente vermelho foram adicionados na presença de saponina, que sequestra o colesterol para permeabilizar preferencialmente as membranas plasmáticas da célula hospedeira, mas não permeabiliza a membrana da gonorréia em células infectadas; o núcleo da célula eucariótica cora com ambos o citotina e o iodeto de propídio.
Essas imagens de neutrófilos infectados por gonorréia foram geradas usando os corantes de viabilidade cyt talk screen e dpi. O corante iodeto de propídio não foi utilizado, pois apresenta fluorescência tanto no canal vermelho quanto no ultravioleta no microscópio de fluorescência. Todas as gonococos se coram com dpi, mas somente as bactérias com membranas comprometidas se coram com ox green.
A bactéria intracelular não viável apresenta um anel de marcação para CD63 ao redor da bactéria. Esse anel indica que grânulos primários estão enriquecidos nesse fagossomo. A bactéria intracelular viável não apresenta marcação para CD63, indicando que grânulos primários não estão enriquecidos em seu fagossomo. Retirado.
Em conjunto, os dados mostram uma correlação entre a viabilidade da gonorréia e os residentes em um fagossomo negativo para grânulos primários. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a viabilidade de bactérias em células hospedeiras. Além disso, você será capaz de determinar a viabilidade de bactérias localizadas em diferentes compartimentos nas células hospedeiras utilizando anticorpos direcionados contra esses compartimentos subcelulares.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo descreve protocolos para avaliar a viabilidade de bactérias individuais associadas a células hospedeiras utilizando microscopia de fluorescência. Os métodos detalhados permitem a determinação da viabilidade bacteriana em diversas localizações subcelulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Patogênese bacteriana
- Microscopia de fluorescência
- Interações celulares
Contexto
- Compreender a sobrevivência bacteriana em células hospedeiras é fundamental para o estudo de infecções.
- Corantes fluorescentes podem diferenciar bactérias viáveis de não viáveis.
- Métodos tradicionais podem não fornecer avaliações diretas da viabilidade bacteriana individual.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar a compreensão do comportamento bacteriano dentro de células hospedeiras.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para avaliar a viabilidade bacteriana em células hospedeiras.
- Explorar a localização de bactérias viáveis versus não viáveis.
- Fornecer uma alternativa mais precisa aos métodos existentes de avaliação de viabilidade.
Métodos Utilizados
- Exposição de células infectadas a reagentes fluorescentes específicos para permease bacteriana.
- Uso de corantes fluorescentes para discriminar bactérias viáveis de não viáveis.
- Incubação com anticorpos conjugados com fluorescência para identificar localizações bacterianas.
- Análise de imagens imunofluorescentes para determinar a viabilidade bacteriana.
Resultados Principais
- O método permite a avaliação direta da viabilidade bacteriana individual.
- Os resultados indicam diferenças na viabilidade com base na localização subcelular.
- A imagem imunofluorescente fornece visualização clara das bactérias.
- Essa abordagem supera os métodos tradicionais na avaliação da viabilidade bacteriana.
Conclusões
- O método desenvolvido é eficaz para estudar a viabilidade bacteriana em células hospedeiras.
- A microscopia de fluorescência pode revelar informações importantes sobre a patogênese bacteriana.
- Este estudo aprimora a compreensão das estratégias de sobrevivência microbianas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação direta da viabilidade bacteriana individual dentro de células de mamíferos aborda uma lacuna crítica na pesquisa de doenças infecciosas e nos estudos de interação entre hospedeiro e patógeno. Este fluxo de trabalho de microscopia de fluorescência permite o mapeamento preciso de bactérias viáveis versus não viáveis ao nível subcelular, apoiando a desmistificação mecanicista e a validação de alvos na fase inicial de descoberta. A abordagem aumenta a confiança preditiva para pesquisas translacionais e orienta decisões de portfólio ajustadas ao risco em P&D de agentes anti-infecciosos.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos de sobrevivência bacteriana dentro de compartimentos celulares do hospedeiro.
- Apoia a validação funcional de alvos de interação hospedeiro-patógeno.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao distinguir bactérias intracelulares viáveis de não viáveis.
- Aprimora a confiança preditiva para a priorização de alvos anti-infecciosos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara ensaios de imagem quantitativos validados para fluxos de trabalho de triagem downstream.
- Padroniza a avaliação de viabilidade ao nível de bactéria individual para garantir reprodutibilidade.
- Permite comparação robusta dos efeitos de compostos sobre a viabilidade bacteriana em contextos de hospedeiro.
- Permite adaptação escalável a diversos modelos bacterianos e de células hospedeiras.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha leituras de viabilidade com sistemas hospedeiro-patógeno relevantes para a doença.
- Oferece continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica de estratégias anti-infecciosas.
- Permite avanço ajustado ao risco com base em dados de localização subcelular e sobrevivência.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais para desfechos de infecção.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de microscopia de fluorescência integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico para programas de doenças infecciosas, conectando estudos mecanicistas iniciais e validação translacional.
- Biologia do Descobrimento: Apoia testes de hipóteses sobre mecanismos de sobrevivência bacteriana e defesa do hospedeiro.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas e reprodutíveis de viabilidade para avaliação de compostos.
- Análises: Fornece dados de imagem de alto conteúdo para comparação estatística de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos celulares relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável adaptável a múltiplas espécies bacterianas e tipos de células hospedeiras.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de interação entre hospedeiro e patógeno.
- Valor Operacional: Padroniza a avaliação de viabilidade e melhora a reprodutibilidade entre experimentos.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não prosseguir e otimiza a alocação de recursos em portfólios de agentes anti-infecciosos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e intervenções candidatas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e análise quantitativa de imagens.
- Necessita de acesso a instrumentação avançada de imagem e reagentes fluorescentes validados.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de coloração e parâmetros de aquisição de imagens.
- Adaptável a diversos modelos de células bacterianas e mamíferas mediante otimização do protocolo.
- Depende de cronometragem e manipulação cuidadosas para preservar as leituras de viabilidade.
