Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos
September 5th, 2013
Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras.
Este experimento de microscopia de fluorescência avalia a viabilidade de bactérias individuais associadas às células hospedeiras e determina a viabilidade bacteriana em diferentes locais subcelulares. Primeiro, para identificar bactérias externas, exponha as células infectadas a um reagente fluorescente específico para a permeada bacteriana, o hospedeiro infectado na presença de corantes fluorescentes que discriminam bactérias viáveis de não viáveis com base na integridade da membrana bacteriana. Em seguida, para indicar onde as bactérias são encontradas dentro das células hospedeiras, incube as células infectadas com um anticorpo acoplado fluorescentemente a um marcador de interesse.
As imagens imunofluorescentes resultantes podem determinar a porcentagem de bactérias viáveis dentro e fora das células hospedeiras e a localização subcelular de bactérias intracelulares viáveis versus não viáveis. Ao contrário dos ensaios de contagem de colônias, ensaios de proteção com gentamicina e microscopia eletrônica, este método permite a avaliação direta da viabilidade de bactérias individuais. Também pode revelar se as bactérias em diferentes compartimentos subcelulares têm diferenças em sua viabilidade.
Demonstrando este procedimento estará Brittany Johnson, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório, Atory para células cultivadas em lamínulas de vidro circulares em 24, placas de poço adicionam bactérias de interesse e incubam pelo tempo desejado. Enxágue as células infectadas uma vez suavemente. Em seguida, adicione o anticorpo acoplado Alexa Fluor 6 4 7 ou uma lectina específica bacteriana para detectar bactérias externas e incubar por 10 minutos no escuro em temperatura ambiente.
Após dois enxágues, aspire o meio e adicione 0,5 mililitros de solução de coloração de mortos-vivos contendo citonove e iodo de propídio. Incube as células por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro e depois enxágue duas vezes em esfregões de cloreto de magnésio. Inverta as lamínulas viradas para baixo nas lâminas de vidro.
Sele com esmalte transparente. Adquira as imagens em 30 minutos usando um microscópio fluorescente com conjuntos de filtros detalhados no protocolo de texto para rotular as bactérias. Adicione 10 microgramas por mililitro de DPI em meio definido e incube por 20 minutos em temperatura ambiente no escuro.
Agora infecte as células aderentes com bactérias marcadas com DPI. Não fixe as células com aldeídos ou solventes orgânicos. Enxágue as células uma vez.
Em seguida, adicione o anticorpo acoplado Alexa Fluor 6, 4, 7 ou lectina e incube por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após dois enxágues com tampão de esfregões, adicione um anticorpo acoplado Alexa Fluor 5 5, 5 contra o marcador subcelular de interesse e incube por 20 minutos Após dois, RINs com tampão de esfregões, lave as células uma vez com cloreto de magnésio de esfregões. Em seguida, aspire o meio e adicione 0,4 células incubadas verdes de cyt micromolar por cinco minutos à temperatura ambiente no escuro, rin as células duas vezes em esfregões, cloreto de magnésio.
Em seguida, lave as células. Mais uma vez em esfregões cloreto de magnésio por cinco minutos. Inverta as lamínulas viradas para baixo nas lâminas de vidro, sele com esmalte transparente, adquira imagens das lâminas em 30 minutos no microscópio de fluorescência.
Neste experimento, neutrófilos humanos foram infectados com gonorreia. A lectina de soja acoplada Alexa Fluor 6 4 7 detecta gonorreia extracelular. Em seguida, a viabilidade fluorescente verde morre e o iodeto de propídio fluorescente vermelho foi adicionado na presença de saponina, que sequestra o colesterol para permear preferencialmente as membranas plasmáticas da célula hospedeira, mas não permeia a membrana da gonorreia nas células infectadas, o núcleo da célula eucariótica cora com citonove e iodeto de propídio.
Essas imagens de neutrófilos infectados com gonorreia foram geradas usando os corantes de viabilidade cyt talk screen e dpi. O corante iodeto de propídio não foi usado, pois fluoresce em canais vermelhos e ultravioletas no microscópio de fluorescência. Todas as gonorreias se coram com dpi, mas apenas bactérias com membranas comprometidas se coram com verde boi.
A bactéria intracelular inviável tem um anel de coloração para CD 63 ao redor da bactéria. Este anel indica que os grânulos primários são enriquecidos neste fagossomo. A bactéria intracelular viável não possui coloração para CD 63, indicando que os grânulos primários não são enriquecidos em seu fagossomo. Tomado.
Juntos, os dados mostram uma correlação entre a viabilidade da gonorreia e os residentes em um fagossomo negativo para grânulos primários. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a viabilidade das bactérias nas células hospedeiras. Além disso, você poderá determinar a viabilidade de bactérias localizadas em diferentes compartimentos nas células hospedeiras usando anticorpos direcionados contra esses compartimentos subcelulares.
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Visão geral
Este artigo descreve protocolos para avaliar a viabilidade de bactérias individuais associadas a células hospedeiras usando microscopia de fluorescência. Os métodos detalhados permitem a determinação da viabilidade bacteriana em várias localizações subcelulares.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Patogênese bacteriana
- Microscopia de fluorescência
- Interações celulares
Fundamentos
- Compreender a sobrevivência bacteriana em células hospedeiras é crucial para o estudo de infecções.
- Corantes fluorescentes podem diferenciar entre bactérias viáveis e não viáveis.
- Métodos tradicionais podem não fornecer avaliações diretas da viabilidade bacteriana individual.
- Este estudo visa melhorar a compreensão do comportamento bacteriano dentro das células hospedeiras.
Objetivo do estudo
- Desenvolver um método para avaliar a viabilidade bacteriana em células hospedeiras.
- Explorar a localização de bactérias viáveis versus não viáveis.
- Fornecer uma alternativa mais precisa aos métodos existentes de avaliação de viabilidade.
Métodos utilizados
- Exposição de células infectadas a reagentes fluorescentes específicos para permease bacteriana.
- Uso de corantes fluorescentes para discriminar bactérias viáveis de não viáveis.
- Incubação com anticorpos fluorescentemente acoplados para identificar localizações bacterianas.
- Análise de imagens imunofluorescentes para determinar a viabilidade bacteriana.
Principais resultados
- O método permite a avaliação direta da viabilidade bacteriana individual.
- Os resultados indicam diferenças na viabilidade com base na localização subcelular.
- A imagem imunofluorescente fornece visualização clara das bactérias.
- Esta abordagem supera os métodos tradicionais na avaliação da viabilidade bacteriana.
Conclusões
- O método desenvolvido é eficaz para estudar a viabilidade bacteriana em células hospedeiras.
- A microscopia de fluorescência pode revelar insights importantes sobre a patogênese bacteriana.
- Este estudo melhora a compreensão das estratégias de sobrevivência microbiana.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Direct quantification of individual bacterial viability within mammalian cells addresses a critical gap in infectious disease research and host-pathogen interaction studies. This fluorescence microscopy workflow enables precise mapping of viable versus non-viable bacteria at the subcellular level, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The approach enhances predictive confidence for translational research and informs risk-adjusted portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of bacterial survival mechanisms within host cell compartments.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable intracellular bacteria.
- Improves predictive confidence for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative imaging assays for downstream screening workflows.
- Standardizes viability assessment at the single-bacterium level for reproducibility.
- Enables robust comparison of compound effects on bacterial viability in host contexts.
- Supports scalable adaptation to diverse bacterial and host cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viability readouts with disease-relevant host-pathogen systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective strategies.
- Enables risk-adjusted advancement based on subcellular localization and survival data.
- Supports translational biomarker development for infection outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence microscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for infectious disease programs, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on bacterial survival and host defense mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible viability outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content imaging data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple bacterial species and host cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes viability assessment and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidate interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and validated fluorescent reagents.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various bacterial and mammalian cell models with protocol optimization.
- Dependent on careful timing and handling to preserve viability readouts.
