Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um endotélio transversal circular de profundidade múltipla vive microcanais em um chip, que imita a geometria 3D de microvasos in vivo e funciona sob fluxo de profusão contínuo controlado. Isso é feito pela primeira foto, fabricando litograficamente um molde mestre com uma rede de microcanais de seção transversal semicircular usando fotorresistor refluível positivo. O segundo passo é usar o molde mestre para replicar dois microcanais de poli dimetil soano, alinhá-los e ligá-los para criar uma rede de microcanais cilíndricos.

Em seguida, as células endoteliais primárias da veia umbilical humana são assentadas dentro da rede de microcanais antes de cultivar as células sob condições controladas de perfusão média contínua por um período de tempo entre quatro dias e duas semanas. Em última análise, uma monocamada de células de confluência indicada por membrana em pé e núcleos em pé sob os microscópios é desenvolvida ao longo da superfície interna da rede de microcanais Cálculo de micro vasos funcionais em que poderia fornecer uma plataforma para o estudo de fenômenos vasculares complexos. No entanto, os ensaios convencionais de microvasos individuais, como os ensaios de migração de células anso, e os ensaios de dois ensaios de formação e os ensaios de anel direito e mostico são limitados a recriar microvasos individuais em relação à geometria tridimensional e controle de fluxo contínuo.

A principal vantagem de nossas técnicas, nosso método de microfabricação existente, é que ele pode fabricar convencionalmente uma rede de canais microfluídicos de várias profundidades que imita as geometrias 3D complexas de microvasos in vivo com seções transversais arredondadas. Também permite projetar sistemas biomagnéticos microvasculares, que obedecem aproximadamente mais lento e mantêm o fluxo de fluido em um nível necessário, de modo que a resistência geral do canal seja baixa e o fluxo que perdemos seja mais uniforme em toda a rede, demonstrando que o procedimento será um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Este procedimento começa com a fabricação de um molde mestre fotorresistente consistindo em microcanais com diâmetros entre 30 mícrons e 60 mícrons, conforme detalhado no protocolo de texto, transfira brevemente o fotorresistor de refluxo da geladeira a quatro graus Celsius para a sala limpa 24 horas antes do uso e deixe-o aquecer até a temperatura ambiente.

Comece girando o revestimento da camada fotorresistente de refluxo positivo em um substrato de silício pré-limpo seguindo o procedimento no protocolo de texto. Em seguida, exponha o fotorresistente à luz UV através de uma máscara padronizada antes de desenvolver os microcanais padronizados. Finalmente, após o refluxo, crie uma rede de microcanais de seção transversal semicircular.

Assim que o molde mestre estiver pronto, prepare a solução de polimetil soano ou PDMS na proporção de peso de 10 para uma base para o agente de cura e misture bem usando um misturador centrífugo planetário. Moldar a solução PDMS no molde mestre fotorresistente refluído. Coloque o PDMS fundido em um dessecador por 15 minutos para desgaseificação.

Use gás nitrogênio para remover quaisquer bolhas restantes, se necessário. Asse o PDMS em um forno a uma temperatura de 60 graus Celsius por três horas para permitir que ele cure. Em seguida, remova a camada de PDMS curada do molde mestre.

Use um perfurador afiado para criar furos de entrada e saída fazendo furos na rede de canais. Limpe a superfície do PDMS usando gás nitrogênio. Trate duas camadas de PDMS com plasma de oxigênio por 30 segundos dentro de um limpador de plasma a uma pressão operacional de 45 milato e uma taxa de fluxo de oxigênio de 3,5 pés cúbicos por minuto.

Em seguida, alinhe as superfícies do PDMS manualmente sob um microscópio óptico. Use uma gota de água, se necessário, para melhor controle do alinhamento. Por fim, asse o dispositivo em forno a 60 graus Celsius por 30 minutos para obter uma cultura de colagem permanente.

Células endoteliais primárias da veia umbilical humana ou VE em meio de cultura com L-glutamina suplementada com soro bovino fetal a 10%. Trate o dispositivo com plasma de oxigênio por cinco minutos com uma pressão operacional de 45 milit e uma taxa de fluxo de oxigênio de 3.5 pés cúbicos por minuto. Em seguida, carregue o dispositivo com água deionizada e trate com luz ultravioleta por oito horas em uma capela laminar de biossegurança para esterilização.

Um dia antes de as células estarem prontas, lave o dispositivo com uma solução salina tamponada com fosfato ou PBS e, em seguida, cubra com fibronectina. Incube na geladeira a quatro graus Celsius durante a noite. Uma vez que as células estejam confluentes, colha-as primeiro enxaguando as células com uma solução salina tamponada e, em seguida, tratando as células com tripsina EDTA após a adição de tripsina.

Incube as células por dois a seis minutos a 37 graus Celsius. Após a tripsina estar completa, neutralizar a tripsina EDTA com uma solução neutralizante de tripsina. Conte as células e centrifugue-as antes de resus.

A suspensão em meio de cultura com 8% de dextrina dextrina é usada para aumentar a viscosidade do meio para ajudar a melhorar o assentamento e a fixação das células após o revestimento FI enc ENC. Lave o dispositivo com um XPBS e, em seguida, carregue o dispositivo com meio de cultura antes de incubar a uma temperatura de 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, as células em meio de cultura de dextrina a 8% em uma concentração de três a 4 milhões de células por mililitro são carregadas no dispositivo.

Coloque uma gota de células de 20 microlitros em uma entrada do dispositivo e incline-a para introduzir as células no canal microfluídico. Após 15 a 20 minutos, as células começarão a se fixar nas paredes laterais dos canais. Gire o dispositivo a cada 15 minutos para criar uma distribuição mais uniforme de células.

Se necessário, cargas adicionais podem ser realizadas. Após cinco a seis horas de cultura estática, as células anexadas começarão a se espalhar completamente. Configure a perfusão de longo prazo usando um sistema de bomba de seringa controlado remotamente com um fluxo constante de 10 microlitros por hora, a perfusão pode ser ajustada para uma taxa de fluxo mais alta e pode durar um período de tempo entre quatro dias e duas semanas.

Quando as células atingirem a confluência dentro do dispositivo, primeiro lave o dispositivo com um XPBS para remover completamente o meio. Em seguida, carregue o dispositivo com corante vermelho diluído após incubação do dispositivo no escuro por cinco minutos em temperatura ambiente. Lave-o com meio de cultura para parar a mancha.

A longa incubação do corante pode causar toxicidade celular e desadesão. Em seguida, carregue o dispositivo com corante azul diluído com um XPBS incube no escuro por cinco minutos em temperatura ambiente antes de lavar bem o dispositivo com um XPBS. Examine a coloração celular sob um microscópio óptico invertido.

Se a coloração for boa, carregue os microcanais com meio de fixação, mergulhe o dispositivo no meio de fixação e cubra-o completamente com papel alumínio. Armazene o dispositivo na geladeira a uma temperatura de quatro graus Celsius para evitar que o dispositivo seque e branqueie o dispositivo fixo agora está pronto para imagens confocais, que podem ser feitas por um microscópio confocal de varredura a laser, microscopia eletrônica de varredura e microscopia óptica. Foram utilizados para caracterizar o fotorresistente de refluxo e o canal PDMS replicado antes e depois do progresso do refluxo.

As características geométricas da rede de microcanais PDMS foram caracterizadas e mostradas aqui. As seções transversais circulares dos moldes PDMS mostram as dimensões do canal em cada nível de ramificação. Os resultados mostram que a técnica de refluxo fotorresistente pode criar redes de canais ramificados de múltiplas profundidades em uma abordagem mais conveniente por técnicas de refluxo fotorresistente e permitir o projeto dos sistemas biomiméticos microvasculares, que obedecem aproximadamente à lei de Murray, mostrados aqui são imagens de microscopia usando corante de membrana celular fluorescente em vermelho e corante nuclear celular em azul.

As vistas transversais circulares revelaram que o VE revestia a superfície interna de uma rede de microcanais cilíndricos em diferentes regiões de ramificação. Devido às geometrias complexas da microvasculatura in vivo, o monitoramento em tempo real desses pequenos vasos é difícil. O chip baseado em P DM S desenvolvido oferece boas propriedades ópticas e permite imagens de alta qualidade e em tempo real dos microcanais endoteliais, como mostrado neste filme confocal do revestimento celular ao longo da rede de canais circulares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar o refluxo para esse modo de massa. Crie uma rede de microcanais PDMS de seção transversal circular, carregue as células endo nos dispositivos e configure a profusão de mídia de longo prazo. Em resumo, os microcanais serializados endo desenvolvidos em um chip fornecem uma abordagem rápida e reprodutível para criar redes de microcanais de múltiplas profundidades de seção transversal circular, que imitam a geometria dos microvasos InVivo.

Este procedimento ilustra o uso de recursos exclusivos em microfabricação avançada e tecnologias microalimentares para criar um modelo microvascular com controle de perfusão contínua de longo prazo, bem como alta qualidade e capacidade de imagem em tempo real com a crescente utilidade de canais microalimentares para aplicações de biologia celular, engenharia de tecidos e bioengenharia. Os microcanais serializados endo em um chip são um ensaio potencial para pesquisa microvascular.