Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver microcanais endoteliais vivos com seção transversal circular e múltiplas profundidades em um chip, que imita a geometria tridimensional de microvasos in vivo e opera sob fluxo de perfusão contínuo controlado. Isso é realizado primeiramente pela fabricação litográfica por luz de um molde-mestre com uma rede de microcanais de seção transversal semicircular, utilizando uma resistência fotossensível positiva refluível. O segundo passo consiste em usar o molde-mestre para replicar dois microcanais de poli-dimetilsiloxano, alinhá-los e uni-los para criar uma rede de microcanais cilíndricos.

Em seguida, as células endoteliais primárias da veia umbilical humana são semeadas dentro da rede de microcanais antes do cultivo das células sob condições controladas de perfusão contínua do meio por um período entre quatro dias e duas semanas. Por fim, forma-se uma monocamada celular confluente, indicada pela marcação da membrana e marcação do núcleo sob microscópios, ao longo da superfície interna da rede de microcanais. O cálculo de microvasos funcionais pode fornecer uma plataforma para o estudo de fenômenos vasculares complexos. No entanto, ensaios convencionais de microvasos individuais, como ensaios de migração de células anso, ensaios de formação de anSo dois e ensaios de anel mos tico direito, têm limitações para recriar microvasos individuais com relação à geometria tridimensional e ao controle de fluxo contínuo.

A principal vantagem das nossas técnicas, o nosso método existente de microfabricação, é que ele pode convencionalmente fabricar uma rede de canais microfluídicos com múltiplas profundidades que imita as geometrias tridimensionais complexas dos microvasos in vivo, que possuem seções transversais arredondadas. Também permite projetar sistemas biomagnéticos microvasculares, que aproximadamente obedecem a fluxos mais lentos e mantêm o fluxo de fluido em um nível necessário, de modo que a resistência total do canal seja baixa e o fluxo perdido seja mais uniforme em toda a rede. A demonstração do procedimento será realizada por um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Este procedimento começa com a fabricação de um molde mestre de fotoresina, composto por microcanais com diâmetros entre 30 mícrons e 60 mícrons, conforme detalhado no protocolo textual. Resumidamente, transfira a fotoresina de refluência do refrigerador a quatro graus Celsius para a sala limpa 24 horas antes do uso e permita que aqueça até a temperatura ambiente.

Inicie aplicando, por centrifugação, a camada de resistência fotográfica positiva com refluência sobre um substrato de silício previamente limpo, seguindo o procedimento descrito no protocolo textual. Em seguida, exponha a resistência fotográfica à luz UV através de uma máscara com padrão definido, antes de revelar os microcanais padronizados. Por fim, após o refluência, crie uma rede de microcanais com seção transversal semi-circular.

Uma vez que o molde mestre esteja pronto, prepare a solução de polimetil siloxano ou PDMS na proporção de peso de 10 para 1, base para agente de cura, e misture-a completamente usando um misturador centrífugo planetário. Despeje a solução de PDMS sobre o molde mestre de resistência fotossensível refluída. Coloque o PDMS moldado em um dessecador por 15 minutos para desgaseificação.

Use gás nitrogênio para remover quaisquer bolhas remanescentes, se necessário. Aqueça o PDMS em uma estufa a uma temperatura de 60 graus Celsius por três horas para permitir que ele cure. Em seguida, remova a camada de PDMS curada do molde mestre.

Use um perfurador afiado para criar orifícios de entrada e saída perfurando furos na rede de canais. Limpe a superfície do PDMS usando gás nitrogênio. Trate duas camadas de PDMS com plasma de oxigênio por 30 segundos dentro de um limpador de plasma a uma pressão operacional de 45 milatorr e uma taxa de fluxo de oxigênio de 3,5 pés cúbicos por minuto.

Em seguida, alinhe manualmente as superfícies do PDMS sob um microscópio óptico. Utilize uma gota de água, se necessário, para melhor controle do alinhamento. Por fim, aqueça o dispositivo em uma estufa a 60 graus Celsius por 30 minutos para obter a ligação permanente da cultura.

Células endoteliais primárias de veia umbilical humana ou VE em meio de cultura com L-glutamina suplementado com 10% de soro bovino fetal. Trate o dispositivo com plasma de oxigênio por cinco minutos com uma pressão operacional de 45 miliTorricelli e uma taxa de fluxo de oxigênio de 3,5 pés cúbicos por minuto. Em seguida, carregue o dispositivo com água desionizada e trate com luz ultravioleta por oito horas em uma capela de biossegurança laminar para esterilização.

No dia anterior ao preparo das células, lave o dispositivo com solução salina tamponada com fosfato ou PBS e, em seguida, recubra com fibronectina. Incube na geladeira a quatro graus Celsius durante a noite. Assim que as células atingirem confluência, recolha-as primeiramente lavando com solução salina tamponada com HEPES e, então, tratando as células com tripsina EDTA após a adição da tripsina.

Incube as células por dois a seis minutos a 37 graus Celsius. Após a isenção de tripsina estar completa, neutralize a tripsina EDTA com solução neutralizante de tripsina. Conte as células, depois as centrifugue antes da ressuspensão.

Suspender no meio de cultura com 8% de dextrina, pois a dextrina é usada para aumentar a viscosidade do meio, auxiliando na melhor acomodação e adesão celular após o revestimento com FI enc ENC. Lave o dispositivo com um XPBS e, em seguida, carregue o dispositivo com meio de cultura antes de incubar a uma temperatura de 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, células em meio de cultura com 8% de dextrina, numa concentração de três a quatro milhões de células por mililitro, são carregadas no dispositivo.

Coloque uma gota de 20 microlitros de células em uma entrada do dispositivo e incline-o para introduzir as células no canal microfluídico. Após 15 a 20 minutos, as células começarão a aderir às paredes laterais dos canais. Gire o dispositivo a cada 15 minutos para criar uma distribuição mais uniforme das células.

Se necessário, pode-se realizar uma carga adicional. Após cinco a seis horas de cultivo estático, as células aderidas começarão a se espalhar completamente. Configure uma perfusão de longo prazo utilizando um sistema de bomba de seringa controlada remotamente com um fluxo constante de 10 microlitros por hora; a perfusão pode ser ajustada para uma taxa de fluxo mais alta e pode durar um período entre quatro dias e duas semanas.

Quando as células atingirem confluência dentro do dispositivo, primeiro, lave o dispositivo com um XPBS para remover completamente o meio. Em seguida, carregue o dispositivo com corante vermelho diluído após a incubação do dispositivo no escuro por cinco minutos à temperatura ambiente. Lave com meio de cultura para interromper a coloração.

A longa incubação do corante pode causar toxicidade celular e desadesão. Em seguida, carregue o dispositivo com corante azul diluído em um XPBS, incube no escuro por cinco minutos à temperatura ambiente antes de lavar completamente o dispositivo com um XPBS. Examine a coloração celular em um microscópio óptico invertido.

Se a coloração for boa, carregue os microcanais com meio de fixação, em seguida, submerja o dispositivo em meio de fixação e cubra-o completamente com folha de alumínio. Armazene o dispositivo na geladeira a uma temperatura de quatro graus Celsius para evitar que o dispositivo seque e sofra desbotamento. O dispositivo fixado agora está pronto para a imagem confocal, que pode ser realizada por microscopia confocal de varredura a laser, microscopia eletrônica de varredura e microscopia óptica. Foram utilizadas para caracterizar o fotoresiste de refluxo e o canal PDMS replicado antes e após o progresso do refluxo.

As características geométricas da rede de microcanais de PDMS foram caracterizadas e são apresentadas aqui. As seções transversais circulares dos moldes de PDMS mostram as dimensões dos canais em cada nível de ramificação. Os resultados demonstram que a técnica de refluxo de fotoresina pode criar redes de canais ramificados com múltiplas profundidades de maneira mais conveniente por meio de técnicas de refluxo de fotoresina e permitem o projeto de sistemas biomiméticos microvasculares, que aproximadamente obedecem à Lei de Murray. As imagens mostradas aqui foram obtidas por microscopia usando corante fluorescente de membrana celular em vermelho e corante nuclear em azul.

As vistas transversais circulares revelaram que o VE revestia a superfície interna de uma rede microcanal cilíndrica em diferentes regiões de ramificação. Devido às geometrias complexas da microvasculatura in vivo, o monitoramento em tempo real desses pequenos vasos é difícil. O chip desenvolvido com base em PDMS oferece boas propriedades ópticas e permite a obtenção de imagens de alta qualidade e em tempo real dos microcanais endoteliais, conforme mostrado neste filme confocal do revestimento celular ao longo da rede de canais circulares.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar o reflow para este modo de massa. Criar uma rede de microcanais PDMS com seção transversal circular, carregar as células endoteliais nos dispositivos e estabelecer a perfusão prolongada de meio. Em resumo, os microcanais endoteliais em série desenvolvidos em um chip fornecem uma abordagem rápida e reprodutível para criar redes de microcanais com seção transversal circular e múltiplas profundidades, que mimetizam a geometria dos microvasos in vivo.

Este procedimento ilustra o uso de capacidades únicas em microfabricação avançada e tecnologias microfluídicas para criar um modelo microvascular com controle de perfusão contínua de longo prazo, bem como alta qualidade e capacidade de imagem em tempo real, com a crescente utilidade de canais microfluídicos para aplicações em biologia celular, engenharia de tecidos e bioengenharia. Os microcanais serializados em um chip representam um ensaio potencial para pesquisas microvasculares.