Name: Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T19:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprenda a desenvolver microcanais circulares com reendotelização em chip para pesquisa vascular usando células endoteliais humanas. Esta plataforma microfluídica permite imagem em tempo real e perfusão controlada.

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Esta pesquisa foi parcialmente financiado pela National Science Foundation (NSF 1227359), WVU programa EPSCoR financiado pela National Science Foundation (EPS-1003907), WVU escritório ADVANCE patrocinado pela National Science Foundation (1.007.978), e WVU PSCoR, respectivamente. O trabalho foi feito em microfabricação WVU compartilhados Instalações de pesquisa (instalações de salas limpas) e Microfluidic Integrative Research celular no Laboratório Chip (microchip Lab) na West Virginia University. A imagem confocal foi feito em WVU Microscópio Facility Imaging.

1. Fotolitografia Fabricação de Moldes Mestre Photoresist O protocolo seguinte ilustra o processo para fabricar os microcanais com diâmetros entre 30-60 um. Para obter um microcanal com um diâmetro mais pequeno (inferior a 30 um), numa única rotação de revestimento de material fotosensitivo é necessário. <ol><li> Transferir o material fotosensitivo de refluxo do frigorífico a 4 ° C e a sala limpa 24 horas antes da utilização e permitir que aqueça até à temperatura ambiente. </li><li> Limpar uma bolacha de silício e cozê-la durante uma hora a 150 ° C, para permitir que a desidratar. A desidratação irá ajudar a adesão fotossensível à base de silício. </li><li> Spin-revestir a primeira camada de material fotosensitivo utilizando a seguinte receita: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Tempo (segundos) </td><td> Velocidade (rpm) </td><td> Aceleração </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 &lt;/ Td&gt; <td> 300 </td><td> maior </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 300 </td><td> maior </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 60 </td><td> 600 </td><td> maior </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td> maior </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 600 </td><td> maior </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Em seguida, coze a bolacha numa placa de aquecimento com uma temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Após a cozer suave da espessura do material fotosensitivo será de 20-30 ^ m. </li><li> Girar revestimento de uma segunda camada de material fotosensitivo seguindo a mesma receita utilizada para a primeira camada. </li><li> Assar a bolacha Mole novamente, colocando-o numa placa de aquecimento com uma temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Após este coza suave da espessura do material fotosensitivo será de 40-60 ^ m. </li><li> Gerar padrões de mestre positivos expondo o photoresist à luz UV com uma dose de exposição de 14.500 mJ / cm 2, por meio de uma máscara de filme. </li><li> Dilui-se com o desenvolvedor desionizada (DI), água (1:2 (v / v)). Lavar a bolacha repetidamente na solução até que o padrão está completamente desenvolvido. Em seguida, lave o wafer com água DI e seque-o com gás nitrogênio. </li><li> Refluxo: Coloque a bolacha numa placa de aquecimento com uma temperatura de 120 ° C durante 4 min e com uma tampa de uma placa de Petri de vidro para evitar a evaporação do solvente. Retire o wafer do fogão e deixe esfriar à temperatura ambiente. A espessura do material fotosensitivo após o refluxo será de 50-60 ^ m. </li></ol> 2. Fabricação de litografia suave de PDMS Microcanal Rede <ol><li> Preparar a solução de polidimetilsiloxano (PDMS) com a proporção em peso de 10:01 (base: agente de cura) e misture bem utilizando um misturador planetário centrífuga. </li><li> Lançai a solução PDMS para o molde mestre photoresist refluído. Colocar o PDMS fundido num exsicador durante 15 min para desgaseificar. Use azoto gasoso para remover quaisquer bolhas restantes, se necessário. </li><li> Asse o PDMS numa estufa a uma temperatura de 60 ° C durante 3 horas para permitir a cura. Em seguida, retire a camada de PDMS curada do molde mestre. </li><li> É um perfurador aguçado para criar os orifícios de entrada / saída por furos de perfuração na rede de canais. Limpar a superfície do PDMS usando gás azoto. </li><li> Trate duas camadas de PDMS com plasma de oxigênio por 30 segundos dentro de um aspirador de plasma a uma pressão de operação de 4,5 x 10 -2 Torr e uma taxa de fluxo de oxigênio de 3,5 pés 3 / min. Em seguida, alinhar as superfícies do PDMS manualmente sob um microscópio óptico. Use uma gota de água se necessário, para um melhor controlo do alinhamento. </li><li> Asse o dispositivo num forno a 60 ° C durante 30 min para conseguir a ligação permanente. </li></ol> 3. Cultura HUVEC e propagação no Chip <ol><li> Cultura das HUVECs com meio de cultura com L-glutamina, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). Por diaforam usadas passagens electrónicos experimentais entre 2 e 5. </li><li> Uma vez que as HUVECs são confluentes, a contagem das células e colhem-lhes, em primeiro lugar a lavagem das células com solução salina tamponada com HEPES (HEPES-BSS) e, em seguida, tratar as células com tripsina / EDTA e incubar durante 2-6 min a 37 ° C. Após a tripsinização é completa, neutralizar a tripsina / EDTA com uma solução de neutralização de tripsina. Centrifugar e suspender as células em meio de cultura com 8% de dextrano para recolhê-las. Dextrano foi usada para aumentar a viscosidade média para ajudar na melhor semeadura de células e do acessório. </li><li> Tratar o dispositivo com plasma de oxigénio durante 5 min com uma pressão de serviço de 4,5 x 10 -2 Torr e uma taxa de fluxo de oxigénio de 3,5 ft 3 / min. Em seguida, carregar o dispositivo com água DI e tratar com luz UV por 8 horas em um laminar capa de biossegurança para a esterilização. </li><li> Um dia antes das células estão prontas, o dispositivo de lavagem com 1 x tampão fosfato salino (PBS 1x) e depois o revestimento com fibronectina (100 ug / ml, dilbuído com PBS 1x) e incubar no frigorífico a 4 ° C durante a noite. </li><li> Depois do revestimento com a fibronectina, o dispositivo de lavagem com 1x PBS, em seguida, carregar com meio de cultura. Incubar o dispositivo a uma temperatura de 37 ° C durante 15 min. </li><li> Carregar as células HUVEC em meio de cultura de 8% de dextrano com uma concentração celular de 3-4 x 10 6 células / ml. Coloque uma gota de 20 ul de células a uma entrada do dispositivo e inclinar-se a introdução das células no interior do canal microfluídico. Depois de 15-20 minutos as células começarão a anexar as paredes laterais dos canais. Girar o dispositivo a cada 15 minutos para criar uma distribuição mais uniforme das células. Se necessário, uma carga adicional pode ser executada. </li></ol> 4. Configuração de perfusão de longo prazo Depois de 5-6 horas de cultura estática, os HUVECs anexados vai começar a espalhar totalmente. Configure perfusão usando um sistema de bomba de seringa controle remoto com um fluxo constante de 10 mL / h. A perfusão pode ser ajustada fou uma taxa de fluxo mais elevada, e pode durar por um período de tempo entre 4 dias a 2 semanas. 5. Coloração celular e Caracterização Microscópio <ol><li> Quando as células atingem confluência no interior do dispositivo, em primeiro lugar, o dispositivo de lavagem com 1x PBS para remover completamente o meio. Em seguida, carregar o aparelho com corante vermelho diluído com diluente (4 ul-1 ml). Carregar o corante semelhante ao procedimento de carregamento da célula. Incubar o dispositivo no escuro durante 5 min à temperatura ambiente, e, em seguida, o dispositivo de lavagem com meio de cultura para parar a coloração. Comprida incubação do corante pode causar toxicidade celular e disadhesion. </li><li> Carregar o dispositivo com o corante azul diluída com PBS 1x (2 gotas por ml). Incubar no escuro durante 5 min à temperatura ambiente e depois lavar com o dispositivo de 1x PBS. </li><li> Examine a coloração de células em microscópio óptico invertido. Se a coloração era bom, carregar os microcanais com meio de fixação (3,5% paraformaldeído diluído com PBS 1x), em seguida submergiro dispositivo de fixação no suporte e cobri-lo completamente com folha de alumínio. Armazenar o dispositivo no frigorífico a uma temperatura de 4 ° C para evitar que o dispositivo de secagem e fotobranqueamento. O dispositivo fixo está agora pronto para imagiologia confocal, o que pode ser feito por um microscópio de varrimento de laser confocal. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

<html> 1. Fabricação de moldes Mestre Um dos princípios orientadores para a concepção e morfometria vascular é conhecida como lei de Murray, 16, que afirma que a distribuição dos diâmetros dos vasos em toda a rede é regida por contrapartida mínima de energia. Afirma também que o cubo dos diâmetros de um navio-mãe a uma bifurcação é igual à soma dos cubos dos diâmetros dos vasos filha ( <img alt="Equação 1" fo:content-width="0.9in" fo:src="/files/ftp_upload/50771/50771eq1.jpg" src="/fi...

Microvasos, como uma parte do sistema de circulação, medeiam as interacções entre o sangue e os tecidos, suporta as actividades metabólicas, definir microambiente do tecido, e desempenham um papel fundamental em muitos estados patológicos e de saúde. Recapitulação de microvasos funcionais in vitro pode fornecer uma plataforma para o estudo de fenômenos vasculares complexos. No entanto, em ensaios convencionais microvasos in vitro, tais como ensaios de migração de células endoteliais, ensaios de formação de tubos endoteliais e de rato e ensaios de anel da aorta do rato, são incapazes de recriar o microvasos in vivo no que diz respeito à geometria tridimensional (3D) e controlo de fluxo contínuo 1-8. Estudos de microvasos com modelos animais e em ensaios in vivo, tais como o ensaio de angiogénese da córnea, pinto corioalantóico ensaio de angiogénese da membrana e ensaio de tampão de Matrigel, são mais demorado, alto custo, um desafio no que diz respeito à observação e quantificação, elevantar questões éticas 1, 9-13. Avanços em Microfabricação e tecnologias de chips microfluídicos têm permitido uma variedade de insights sobre ciências biomédicas, enquanto reduzindo os altos custos experimentais e as complexidades associadas com animais e estudos in vivo de 14, como condições biológicas de forma fácil e rigidamente controlada e ambientes fluidos dinâmicos, que não teriam foi possível com as técnicas convencionais macroescala. Aqui, apresentamos uma abordagem para a construção de uma reendotelizados microcanais-on-a-chip que imita a geometria 3D in vivo microvasos e é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada usando a combinação da técnica de fotolitografia reflowable photoresist, litografia macia e microfluídica.

<table><tbody><tr><td>Reagent/Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reflow Photoresist</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZP4620</td><td></td></tr><tr><td>Desenvolvedor</td><td>AZ Electronic Materials AZ</td><td>400K</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Meio de Cultura</td><td>Invitrogen</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Coloração de núcleos NacBlue</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>PKH Mancha vermelha</td><td>Sigma</td><td>MINI26 e PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponado solução salina</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Solução Neutralizante de Tripsina</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Agente de Cura PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana Primária</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>Diluente C</td><td>Sigma</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Invitrogen, pontas de prova moleculares</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma</td><td>95771</td><td></td></tr><tr>3,5% ciência <td>15710-S</td><td></td> da <td>microscopia eletrônica</td><td>do paraformaldeído de 3,5%</td></tr> <tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Corporação</td><td>WS-400BZ-6NPP/ das tecnologias de Laurell </td> Dessecador LITE <td></td></tr><tr><td></td><td>Produtos BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Sistema de</td> Bomba de Seringa Nikon <td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aparelho Harvard Aparelho</td><td>PHD Capuz de</td> Biossegurança Ultra <td></td></tr><tr><td>Laminar</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Misturador Centrífugo Planetário</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Forno Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-246-516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Óptico</td><td>Zeiss</td><td>Invertoskop 40C</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de Plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Placa Quente</td><td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td><td>SP131635</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Varredura a Laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr></tbody></table>

procedimento para o desenvolvimento da multi-profundidade circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Os esforços têm sido focados no desenvolvimento de ensaios in vitro para o estudo de microvasos porque estudos em animais in vivo é mais demorado, caro e de observação e quantificação são muito desafiante. No entanto, em ensaios in vitro convencional microvasos têm limitações quando representar microvasos in vivo no que diz respeito a geometria tridimensional (3D) e fornecer o fluxo de fluido contínuo. Usando uma combinação de técnicas de fotolitografia reflowable photoresist, litografia macia e microfluídica, temos desenvolvido um multi-profundidade reendotelizados transversais circulares microcanais-on-a-chip, que imita a geometria 3D in vivo microvasos e é executado sob perfusão contínua controlada fluxo. Um fotosensitivo refluído positivo foi usada para fabricar um molde mestre, com uma rede de microcanais transversal semicircular. No alinhamento e união das duas (PDMS) microcanais polidimetilsiloxano replicated do molde mestre, uma rede de microcanais cilíndrico foi criado. Os diâmetros dos microcanais pode ser bem controlada. Além disso, as células primárias endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) semeadas dentro do chip mostraram que as células revestidas a superfície interior dos microcanais em perfusão controlada duradouro durante um período de tempo entre 4 dias a 2 semanas.

A nossa abordagem para fabricar a rede de microcanais múltiplos profundidade imita as geometrias complexas 3D de microvasos in vivo, em que os microcanais têm secções transversais arredondadas 15. Além disso, os diâmetros dos canais de ramificação-mãe e os canais filha aproximadamente obedecem à lei de Murray, para manter o fluxo do fluido em um nível requerido de modo que a resistência global do canal é baixa e velocidades de fluxo são mais uniforme em toda a rede de 16-18. Os processos e...

Uma plataforma de microcanais-on-a-chip foi desenvolvido pela combinação da técnica fotolitográfica refluído fotossensível, litografia macia, e microfluidos. A plataforma de microcanais reendotelizados imita a geometria tridimensional (3D) de microvasos in vivo, é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada, permite a imagem de alta qualidade e em tempo real, e pode ser aplicado para a pesquisa microvascular.

Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver microcanais endoteliais vivos com seção transversal circular e múltiplas profundidades em um chip, que imita a geometria tridimensional de microvasos in vivo e opera sob fluxo de perfusão contínuo controlado. Isso é realizado primeiramente pela fabricação litográfica por luz de um molde-mestre com uma rede de microcanais de seção transversal semicircular, utilizando uma resistência fotossensível positiva refluível. O segundo passo consiste em usar o molde-mestre para replicar dois microcanais de poli-dimetilsiloxano, alinhá-los e uni-los para criar uma rede de microcanais cilíndricos.Em seguida, as células endoteliais primárias da veia umbilical humana são semeadas dentro da rede de microcanais antes do cultivo das células sob condições controladas de perfusão contínua do meio por um período entre quatro dias e duas semanas. Por fim, forma-se uma monocamada celular confluente, indicada pela marcação da membrana e marcação do núcleo sob microscópios, ao longo da superfície interna da rede de microcanais. O cálculo de microvasos funcionais pode fornecer uma plataforma para o estudo de fenômenos vasculares complexos. No entanto, ensaio

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descrevemos uma plataforma baseada em chip para o cultivo tridimensional de células em micro-biorreatores. Um chip pode abrigar até 10 milhões. células que podem ser cultivadas sob condições estritamente definidas em relação ao fluxo de fluidos, etc tensão de oxigênio em um circuito de circulação estéril, fechado.

Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores

Nós apresentamos dois processos para a microfabricação dos chips porosa de polímero para tridimensional cultivo celular. O primeiro é de estampagem a quente combinado com um processo de soldagem solvente vapor. A segunda usa um processo desenvolvido recentemente microthermoforming combinado com tecnologia de iões pista levando a uma significativa simplificação de fabricação.

Microfabricação de Chip porte Andaimes para tridimensional de cultivo celular

Um método para a cultura de uma monocamada de células endoteliais em toda a superfície interior 3D inteiro de um dispositivo micro com microvascular de tamanho canais (= 30 mm) é descrito.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Um método quantitativo para estudar a migração espontânea de células em um microambiente confinado unidimensional é descrito. Este método tira vantagem de canais microfabricados e pode ser utilizado para estudar a migração de grande número de células em condições diferentes nas experiências individuais.

Estudo da migração celular em Canais microfabricados

Esta publicação descreve a fabricação de um dispositivo de órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para a quantificação directa dos transendothelial de resistência elétrica (TEER). Para validação, a barreira hemato - encefálica foi imitada dentro deste dispositivo microfluidic e sua função de barreira foi monitorizada. Os métodos apresentados para integração de eletrodo e quantificação de TEER direta são geralmente aplicáveis.

Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

Vários métodos estão disponíveis para a fabricação de canais das seções não-retangulares incorporadas em dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano. A maioria deles envolve várias etapas fabricação e extenso alinhamento. Neste trabalho, uma abordagem de uma etapa é relatada para fabricar microfluidic canais de diferentes geométrica das secções transversais pelo polidimetilsiloxano sequencial gravura molhado.

Abordagem de uma etapa para fabricar polidimetilsiloxano Microfluidic canais de diferentes seções geométricas por processos sequenciais gravura molhado

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a fabricação do stretchable, dual channel, dispositivos de cultura de célula órgão microplaqueta microfluidic para recapitulando a funcionalidade de nível de órgão em vitro.

Fabricação escalável de Stretchable, Dual Channel, órgão Microfluidic Chips

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele simplificado e indiferenciado tridimensional usando uma plataforma microfluida micromaquinda. Uma abordagem de fluxo paralelo permite a deposição in situ de um compartimento dérmico para a semeadura de células epiteliais em cima, todas controladas por bombas de seringa.

Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

Aprenda a desenvolver microcanais circulares com reendotelização em chip para pesquisa vascular usando células endoteliais humanas. Esta plataforma microfluídica permite imagem em tempo real e perfusão controlada.

Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

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