Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo experimental de camundongo que possa ser usado para investigar as ramificações da infecção concomitante por tuberculose e malária in vivo. Isso é feito primeiro expondo os animais experimentais a eles. Tuberculose contendo gotículas de aerossóis infecciosas usando um sistema de exposição por inalação.

Na segunda etapa, a captação do número desejado de M tuberculosis é verificada pela análise de UFC do tecido pulmonar. Um dia após a infecção por aerossol, 40 dias depois, os camundongos são expostos a mosquitos infecciosos para transmissão natural de esporozoítos de plasmódio, que são depositados sob toda a pele durante a refeição de sangue. Na etapa final, o desenvolvimento do parasita do estágio sanguíneo da malária é monitorado pela análise de manchas de giemsa, esfregaços de sangue.

Em última análise, a carga de em tuberculosis no pulmão e o número de parasitas no sangue de animais coinfectados podem ser enumerados para determinar o curso da tuberculose e da malária, respectivamente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da tuberculose, coinfecção da malária, como Como a coinfecção com o parasita da malária influencia a patogênese e o controle da infecção por mycobacterium tuberculosis? Este protocolo foi desenvolvido para investigar como a coinfecção com odium buri impacta a fase crônica da tuberculose microbiana, um camundongo C 57 PL imunocompetente em seis camundongos.

Também pode ser aplicado a outras cepas de camundongos, incluindo camundongos knockout, ou usado com outras espécies de micobactérias ou ódio. Comece aquecendo mycobacterium tuberculosis. Unidades populacionais de um título CFU conhecido.

Quando as células estiverem descongeladas, use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27 para misturar cuidadosamente a suspensão cinco vezes para dispersar os aglomerados bacterianos, evitando a produção de aerossóis, dependendo da dose de infecção desejada, transfira o volume necessário do estoque de micobactérias para um tubo de 50 mililitros contendo PBS estéril para um volume final de seis mililitros. Em seguida, coloque os animais experimentais individualmente em cestos de malha compartimentados. Coloque os cestos na câmara circular de aerossol e feche a tampa da câmara.

Conecte a unidade nebulizadora Venturi às três juntas de soquete de aço inoxidável. Aspirar a suspensão micobacteriana para uma seringa de 10 mililitros, equipada com uma agulha romba de calibre 18 e transportar a seringa para a câmara de aerossol numa caixa de transporte fechada. Agora remova a tampa de rosca do nebulizador e injete cuidadosamente a suspensão de micobactérias na unidade.

Tomando cuidado para evitar a geração de aerossóis. Descarte a seringa em um recipiente para objetos cortantes contendo 2% de Burton e feche o nebulizador. Ligue o aparelho de inalação quando o ciclo estiver concluído.

Confirme se a suspensão de micobactérias foi completamente nebulizada antes de abrir a câmara de aerossol. Coloque capacetes de respirador purificador de ar motorizado, devolva os animais às suas gaiolas, esterilize as cestas do nebulizador e dentro da câmara de aerossol um dia após a infecção por aerossol, coloque os animais de controle sacrificados designados em papel absorvente em uma placa de dissecação em um gabinete de biossegurança classe dois e desinfete os camundongos com etanol 70% para cada camundongo. Primeiro, faça uma pequena incisão no meio do abdômen e depois retraia a pele sobre a cabeça do animal.

Em seguida, use uma tesoura cirúrgica para abrir o abdômen e a caixa torácica. Remova a parede torácica para que os pulmões fiquem acessíveis e, em seguida, remova-os. Transfira os pulmões para um tubo de 15 mililitros com dois mililitros de tampão de homogeneização e, em seguida, use o êmbolo de uma seringa de cinco mililitros para coar o tecido através de peneiras de 100 micrômetros em uma pequena placa de Petri.

Usando uma pipeta de um mililitro equipada com uma ponta de barreira, lave a peneira várias vezes e distribua cerca de 250 microlitros do homogeneizado pulmonar em oito placas de ágar. Use espalhadores descartáveis para colocar cuidadosamente as amostras quando as placas estiverem secas. Sele cada placa com perfil.

Embrulhe-os em papel alumínio e incube-os na vertical a 37 graus Celsius por pelo menos quatro semanas. Para infectar camundongos ingênuos ou infectados com micobactérias com malária por picadas de mosquito, coloque os animais anestesiados na rede das gaiolas dos mosquitos, permitindo que os mosquitos infecciosos se alimentem através da membrana para garantir a transmissão bem-sucedida do esporozoíto. Deixe os ratos nas gaiolas por 10 a 15 minutos.

Transfira os ratos de volta para suas gaiolas em uma toalha de papel e cubra-os com uma toalha de papel para mantê-los aquecidos até que acordem da anestesia. Mate os mosquitos borrifando-os com etanol 70% ou outros desinfetantes através da rede da gaiola e esterilize as gaiolas autoclavando-as. Para monitorar o para, use uma agulha para perfurar a ponta da veia de cada animal infectado e coletar uma gota de sangue.

Em cada extremidade de uma lâmina de vidro, use outra lâmina para puxar uma gota de sangue sobre a metade do comprimento da lâmina inferior. Em seguida, vire a lâmina de espalhamento e use a outra borda para a segunda esfregadura. Coloque as lâminas em um suporte de coloração.

Fixe brevemente os esfregaços de sangue em metanol absoluto e depois seque ao ar. Os slides a seguir, mergulham as manchas em Gizé. Após 10 minutos, mergulhe as lâminas para dentro e para fora dos vees de coloração cheios de água deionizada algumas vezes para enxaguar o excesso de mancha.

Por fim, seque as lâminas ao ar na posição vertical. A infecção induzida por esporozoítos de animais experimentais por picadas de mosquito resulta em uma taxa de infecção de 100%, conforme confirmado pela presença de parasitas em estágio sanguíneo quatro a cinco dias depois. Conforme ilustrado na tabela, a infecção de camundongos ingênuos e infectados com tuberculose por plasmodium buri por picadas de mosquito resulta na infecção consistente e reprodutível de todos os animais dentro de um grupo experimental.

Comparando os camundongos controle pré-perviedade e virgens com os animais co-infectados com mycobacterium tuberculosis, pode-se observar que a pré-perviedade é ligeiramente tardia. Em camundongos que foram pré-infectados com Mycobacterium tuberculosis em camundongos com Mycobacterium tuberculosis pelo uso de um sistema de exposição por inalação, resulta na deposição bem-sucedida de bactérias nos pulmões do animal com variabilidade relativamente baixa entre camundongos individuais. As cargas micobacterianas nos pulmões de camundongos C 57 black six infectados são aumentadas na presença de p burga.

Em contraste, os camundongos co-infectados têm uma paraemia reduzida em comparação com os camundongos infectados com plasmódio. Após este procedimento, métodos como citometria de fluxo PCR Eliza ou técnicas histológicas podem ser realizados no tecido ou fluidos corporais de interesse para dissecar as respostas imunes simultaneamente provocadas contra parasitas e basi da tuberculose e suas interações no hospedeiro co-infectado. Não se esqueça de que trabalhar com o patógeno humano microbacterium tuberculosis pode ser extremamente perigoso e medidas devem ser tomadas para evitar a exposição a aerossóis infecciosos em todos os momentos.

Todos os trabalhos experimentais que envolvam a microbactéria tuberculose devem ser realizados em instalações adequadas de nível três de biossegurança.