Preparação de amostras de Mycobacterium tuberculosis Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

O objetivo deste procedimento é analisar Mycobacterium tuberculosis, extratos livres de células por primeira cultura metabolômica de RMN, e colher as células em um estágio apropriado de crescimento. Em seguida, as células de lisa obtêm extratos livres de células para análise. Suspenda novamente os extratos liofilizados em tampão para análise de RMN.

Por fim, colete dados de RMN e analise espectros com software para identificar metabólitos. Em última análise, a análise de RMN do Mycobacterium tuberculosis é usada para mostrar preservações nos níveis de metabólitos em vários tratamentos. A metabolômica de RMN pode ser aplicada a aspectos-chave da fisiologia do Mycobacterium tuberculosis, como importantes vias metabólicas.

Esse entendimento é fundamental para elucidar os mecanismos de ação e resistência a medicamentos e para identificar novos alvos para o design de medicamentos. Geralmente, indivíduos novos neste método teriam dificuldades devido à incapacidade de lidar com todas as amostras exatamente da mesma forma, o que introduzirá variações e resultados desnecessários do meu laboratório. Steven Luka, estudante de pós-graduação em doutorado, demonstrará os procedimentos para manusear as amostras para processamento de RMN Do meu laboratório, o gerente do laboratório de pesquisa e Robert Fenton, técnico de pesquisa três, agora demonstrarão os procedimentos para lidar com culturas de micobactéria tuberculose ao conduzir M tuberculosis.

A pesquisa seguiu práticas de nível três de biossegurança, conforme definido pelas diretrizes institucionais. Embora os rótulos neste vídeo digam microbacterium tuberculosis por considerações de biossegurança, esta demonstração usou o mycobacterium magmático não patogênico. Comece descongelando um estoque de glicerol de 50% de M tuberculosis no gelo.

Ininocule 0,15 mililitros em 110 mililitros de caldo M-A-D-C-T-W no ER de 250 mililitros e meu frasco cultive as culturas a 37 graus Celsius com agitação a 100 RPM por aproximadamente seis dias. Se não houver antibióticos, adições alternativas ou outros tratamentos são necessários. Colha as culturas para culturas que requerem tratamentos.

Reserve um Eloqua de 0,5 mililitro no gelo para cultura, titulação e controle de qualidade. Em seguida, execute o tratamento desejado e coloque as culturas de volta no agitador após o período de tratamento. Remova um mililitro e determine o OD 600.

Além disso, reserve uma amostra de 0,5 mililitro para cultura, titulação e controle de qualidade. Mantenha as células no gelo durante todo o protocolo restante. Colha as células em quatro tubos de 50 mililitros por centrifugação após lavagem com 15 mililitros de água duplamente destilada gelada.

Reese suspende os pellets em alíquotas de 10 mililitros. Puxar duas alíquotas e o pellet por centrifugação e, em seguida, ressuspender o pellet celular num volume final de um mililitro de água bidestilada Se desejar uma única suspensão celular livre de aglomeração, passe as células por uma agulha de calibre 27.

Três vezes, proceda à transferência da suspensão de célula de um mililitro para uma tampa de rosca de dois mililitros contendo a matriz de lise B. Posicione o homogeneizador de lise de preparação rápida 24 dentro do gabinete de biossegurança. Coloque as amostras no porta-amostras que prende a placa do raio de retenção. Em seguida, processe por 60 segundos a uma configuração de velocidade de seis metros por segundo.

Em seguida, centrifugue as amostras para pellet cell debris e células intactas. Em seguida, passe o supinato por um filtro de seringa de 0,2 mícron em um tubo estéril para controlar a ausência de células viáveis. Placa 0,1 mililitro de amostra no MADC. Ágar.

Congele as amostras em um banho de gelo seco com etanol e armazene a 80 graus Celsius negativos até que estejam prontas para serem liofilizadas e processadas em uma instalação de RMN. Após dois meses, verifique as placas para verificar a ausência de unidades formadoras de colônias. Se nenhum usuário de FC for encontrado, as amostras podem ser removidas do laboratório BSL três para análise posterior em uma instalação de RMN padrão.

Depois de secar as amostras, ressuspenda em 0,7 mililitros de tampão NMR e transfira para uma centrífuga de tubo de microcentrífuga por três minutos a 13.000 vezes. G, remova 0,6 mililitros e transfira para um tubo de RMN de cinco milímetros. A partir da análise do meio, um rack personalizado facilita o carregamento de vários tubos de RMN em spinners na profundidade correta.

Em seguida, transfira as amostras para o espectrômetro de RMN para inserir no ABCS um trocador de 20 amostras. Alternando entre culturas não tratadas e tratadas com medicamentos. A primeira amostra precisa ser pré-carregada no ímã no início de uma execução automatizada.

Para calibrar o instrumento, otimize o comprimento do pulso de 90 graus com uma única amostra e ajuste o instrumento para as amostras restantes. Use o ícone NMR e o calço grad. Automatize o bloqueio e a coleta de dados de RMN para cada amostra.

Para um espectro de hidrogênio 1D e um NMR, selecione a sequência de pulso com supressão de água e escultura de excitação. Defina um total de 32.000 pontos de dados, 128 varreduras e 16 varreduras fictícias para um espectro de CQ de dois DH e C 13 hs. Selecione a sequência de pulsos.

Selecione um total de 2048 pontos de dados com largura de varredura ao longo da dimensão direta H um e 64 pontos de dados com largura de varredura ao longo da dimensão indireta C 13. Especifique também a coleta de espectro com 128 varreduras e 16 varreduras fictícias para obter um bom sinal para ruído. Um espectro de m tuberculosis gerou aproximadamente 400 picos, incluindo 50 metabólitos conhecidos.

Por exemplo, o processamento de dados, conforme detalhado no manuscrito anexo, produziu esse espectro de metabólitos que estão direta ou indiretamente associados à via da D alanina. A magnitude das intensidades de pico é proporcional às concentrações de metabólitos presentes no extrato celular, portanto, perturbações relativas em metabólitos e vias metabólicas podem ser quantificadas entre amostras e tratamentos. A metabolômica LMR abre caminho para pesquisas no campo da bacteriologia para explorar a fisiologia e patogênese em microrganismos visuais e microbacterianos outros microrganismos patogênicos ou não patogênicos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar vários extratos de células de tuberculose para metabolômica de RMN e, principalmente, manter a consistência em todo o protocolo para obter resultados confiáveis.