Name: Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a técnica de microinjeção de célula única com Lucifer Yellow para visualizar comunicação celular através de junções comunicantes em células vivas. Este método permite avaliar o acoplamento celular e a funcionalidade das junções gap em estudos de biologia celular.

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Os autores dedicam este artigo em homenagem ao Prof. Gilberto Oliveira-Castro que introduziu a pesquisa em comunicação intercelular por junções comunicantes no Brasil. Este trabalho foi financiado pela Capes, CNPQ e Faperj.

<html> 1. Preparação de células <ol><li> Manter uma cultura de uma linha celular epitelial tímica (IT76M1) ou célula a ser testada numa incubadora (37 ° C / 5% de CO 2). </li><li> Lave as células com PBS 1x (repetir este item 3x). </li><li> Adicionar tripsina às células durante 5 min. </li><li> Adicionar meio (o dobro do volume de tripsina adicionada no ponto 1.3) com 10% de FBS (soro fetal bovino) para as células com tripsina e centrifugação (800 xg durante 5 min). </li><li> Contar as células num hemocitómetro. </li><li> Ajustar a densidade de células de acordo com o tipo de células como as células têm que estar em estreito contacto umas com as outras para permitir o acoplamento. Nota: No nosso caso, usamos 3 x 10 5 células por 35 milímetros placa de Petri. </li></ol> 2. Preparação Micropipeta <ol><li> Puxar a micropipeta, conforme especificado a partir de uma micropipeta capilar de vidro (1,5 mm de diâmetro) para uma final de 0,2 um de diâmetro de modo a atingir uma resistência final de aproximadamente 30 mohmsf &quot;&gt; 17, 18. NOTA: Alternativamente, as pipetas de injecção pode ser comprado. A resistência depende do tamanho da célula, por exemplo, seria necessário para células acinares pancreáticas um microeléctrodo resistência mais elevada, por exemplo (100-150 mohms) 19. Um problema comum é que pode ocorrer a precipitação da solução amarelo Lucifer, que pode, em seguida, obstruir a micropipeta e pode necessitar de filtração ou centrifugação antes. Antes da injecção, a micropipeta devem ser analisadas sob o microscópio para detectar se existe uma obstrução ou qualquer tipo de interrupção 13. A micropipeta pode ser testada através da injecção de LY com a ponta da micropipeta dentro de uma solução salina. </li></ol> 3. Teste a micropipeta <ol><li> Preparar a solução de Amarelo Lúcifer (5%) em 150 mmol / L de LiCl e carregar a micropipeta com uma seringa ou por enchimento (colocar nele LY solução). </li><li> Coloque a micropipette ao longo de 35 mm placa de Petri com as células IT76M1 na estação de trabalho microinjecção e submergir a ponta da micropipeta de vidro para o meio celular. Concentre-se na micropipeta e executar um teste de corante fluindo através da aplicação de um pulso. </li></ol> 4. uma única célula Lucifer Yellow Microinjeção <ol><li> Concentre-se o microscópio logo acima da camada de células usando um grande aumento fi cação (40X) e desça lentamente a pipeta para as células usando o micromanipulador. </li><li> Perfurar a célula alvo quando a ponta está perto o suficiente para tocar a membrana celular, e aplique uma pequena pulsação de hiperpolarização para introduzir o LY na célula. A tensão aplicada dependerá da carga líquida do corante a ser injectada. Alternativamente, alguns outros corantes podem ser usados ​​com esta técnica, como mostrado na Tabela 1. Nota: Em princípio, qualquer corante hidrofílico com um PM inferior a 1 kDa poderia ser usada. No entanto, a taxa de transferência pode variar de acordo com o peso e hidrofilicidade. Além disso, utransferência nspecific do corante utilizado deve ser avaliada. </li><li> Capturar imagens de células 3 min após a injeção de corante ou fazer um pequeno filme com microscopia de lapso de tempo (30 fps). NOTA: Uma abordagem semelhante pode ser visto na Hitomi et al (2015) 20. Para evitar a comunicação por pontes intercelulares (mitose incompleto), um co-injecção de dextrano rodamina (de 2 a 10 kDa), que não passa através de junções de hiato, mas passa através de pontes intercelulares e certos tipos de nanotubules é recomendada como mostrado na Figura 2 . </li></ol>

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<li>Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+channels+and+hemichannels+in+the+CNS%3A+Regulation+by+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules.</a> Neuropharmacology. , (2013).</li>
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<li>Hitomi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+connexin+function+enhances+self-renewal+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma.</a> Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).</li>
<li>Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+cellular+communication+among+thymic+epithelial+cells%3A+intercellular+calcium+wave+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

A fim de verificar a presença de junções de hiato funcionais intercelular, a utilização de marcadores, que são membrana impermeável, embora permeável por meio de canais intercelulares são necessários 16. Fluoresceína, o primeiro corante fluorescente para observar célula-a-célula de acoplamento 22, é permeável entre membranas não juncionais 3 e, por conseguinte, tem sido substituído por Lúcifer corante Amarelo 15. Atualmente, ...

As junções de hiato são canais intercelulares que permitem a intercomunicação entre células vizinhas 1. Esta comunicação conecta duas ou mais células vizinhas, onde cada um contribui com um connexon ou hemichannel para formar o canal intercelular. Em células de mamíferos, o connexon é formado por seis conexinas, monómeros com quatro domínios transmembranares e um terminal de C e N dentro do citoplasma 2. As junções de hiato não só permitir o fluxo de iões, segundos mensageiros e pequenos metabolitos, mas também contribuir para muitas formas de comunicação celular em muitos processos fisiológicos, tais como a transmissão sináptica, a contracção cardíaca, crescimento e diferenciação celular 3, 4, 5, 6, 7, 8. Além disso as junções de hiato foram associados commuitas doenças incluindo cancro 9, 10, 11, atrofia muscular, algumas doenças genéticas e doenças desmielinizantes 12. Este tipo de interferência intercelular pode ser avaliada através de vários métodos 13, 14, 15, 16. Neste artigo, vamos mostrar como realizar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas. Discute-se como preparar as células e a micropipeta, a utilização do micromanipulador e a injecção do corante Amarelo Lúcifer em uma linha de células epiteliais do timo. Normalmente, este procedimento experimental poderia ser analisados ​​pela média de células ligadas à célula carregado com corante. Além disso, este método pode ser usado com outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a lacunajunções de corte, que é cerca de 1.000 daltons.

<table><tbody>Cloreto de lítio <tr><td>amarelo Lúcifer</td><td>Sigma</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td></td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>PBS comprimidos</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R4130</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Cultilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>mesa isolada por vibração&nbsp;</td><td>Newport</td><td>VH3036W-OPT</td><td>É necessária uma mesa isolada por vibrações para proteger os experimentos da vibração e evitar danos às células</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MMO-203</td><td>Este equipamento permite ajustes precisos da micropipeta, que é necessária para a microinjeção celular.</td></tr><tr><td>Gerador de Corrente&nbsp;</td><td>Digitimer</td><td>DS2</td><td>Para produzir o fluxo de corante através da micropipeta, uma corrente abaixo de um nano ampere foi dada usando um gerador de corrente com um eletrodo dentro da micropipeta ou um amplificador que possui um circuito de compensação de capacitância (eletrômetro antigo) ou funções de injeção de corrente de novos amplificadores patch clamp, e o fio terra submerso no prato da placa. Alternativamente, o corante pode ser injetado por um microinjetor pneumático, seguindo as recomendações da fábrica. &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

As junções comunicantes são canais intercelulares que permitem a comunicação de células vizinhas. Essa comunicação depende da contribuição de um hemicanal por cada célula vizinha para formar a junção comunicante. Em células de mamíferos, o hemicanal é formado por seis conexinas, monômeros com quatro domínios transmembranares e um terminal C e N dentro do citoplasma. As junções comunicantes permitem a troca de íons, segundos mensageiros e pequenos metabólitos. Além disso, eles têm papéis importantes em muitas formas de comunicação celular dentro de processos fisiológicos, como transmissão sináptica, contração cardíaca, crescimento e diferenciação celular. Detalhamos como realizar uma microinjeção de célula única de Amarelo de Lúcifer para visualizar a comunicação celular por meio de junções comunicantes em células vivas. Espera-se que, em junções comunicantes funcionais, o corante se difunda da célula carregada para as células conectadas. É uma técnica muito útil para estudar junções comunicantes, pois você pode avaliar a difusão da fluorescência em tempo real. Discutimos como preparar as células e a micropipeta, como usar um micromanipulador e injetar um corante fluorescente de baixo peso molecular em uma linhagem de células epiteliais.

Tímico linha celular epitelial de TI-76MI foram usadas para avaliar corante de acoplamento por junções de hiato como estas células foram descritos para expressar junções de hiato funcionais formados por conexina 43 21. A Figura 1 mostra a injecção de Amarelo Lúcifer quando aplicado na uma célula abaixo da ponta da pipeta. Após alguns minutos, as células tornam-se ligados fluorescente (asteriscos), indicando a difusão do corante fluorescente através das junções de ...

Descrevemos aqui como executar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas, e fornecer algumas dicas úteis. Esperamos que este trabalho irá ajudar a todos para avaliar o grau de acoplamento celular devido à junções comunicantes funcionais. Tudo o descrito aqui pode ser, em princípio, adaptado para outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a 1.000 Daltons.

Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Olá, meu nome é Anael. Trabalho na Fundação Oswaldo Cruz no Laboratório de Comunicação Celular. Estudamos aqui os receptores P2 e a injeção de gap no contexto do sistema imunológico e do fígado.Hoje, vou apresentar a vocês a microinjeção de células. As injeções de gap desempenham alguns papéis fisiológicos como transmissão de sinapses, contrações cardíacas e outros. Para esta técnica, podemos estudar se as injeções de gap são funcionais ou não.Ok, vamos ver os componentes básicos da configuração de microinjeção. Aqui temos o microscópio de fluorescência invertida onde veremos as células. Esta é uma câmera CCD para gravar os resultados.Temos aqui o gerador de corrente que introduziremos o corante na célula. Em seguida, temos o suporte onde o microeletrodo está conectado. E o micro-manipulador que está conectado ao suporte e permite o movimento do microeletrodo nos três eixos, Z, Y e X.Antes de iniciar o experimento, temos que fazer o microeletrodo.Usamos este capilar de vidro borossilicato e este equipamento denominado polar. Anexamos o capilar de borossilicato aqui. Este filamento de tungstênio vamos aquecer para fazer dois microeletrodos.Agora, o aquecimento do filamento de tungst

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