Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular
February 26th, 2017
Descrevemos aqui como executar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas, e fornecer algumas dicas úteis. Esperamos que este trabalho irá ajudar a todos para avaliar o grau de acoplamento celular devido à junções comunicantes funcionais. Tudo o descrito aqui pode ser, em princípio, adaptado para outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a 1.000 Daltons.
Olá, meu nome é Anael. Trabalho na Fundação Oswaldo Cruz no Laboratório de Comunicação Celular. Estudamos aqui os receptores P2 e a injeção de gap no contexto do sistema imunológico e do fígado.
Hoje, vou apresentar a vocês a microinjeção de células. As injeções de gap desempenham alguns papéis fisiológicos como transmissão de sinapses, contrações cardíacas e outros. Para esta técnica, podemos estudar se as injeções de gap são funcionais ou não.
Ok, vamos ver os componentes básicos da configuração de microinjeção. Aqui temos o microscópio de fluorescência invertida onde veremos as células. Esta é uma câmera CCD para gravar os resultados.
Temos aqui o gerador de corrente que introduziremos o corante na célula. Em seguida, temos o suporte onde o microeletrodo está conectado. E o micro-manipulador que está conectado ao suporte e permite o movimento do microeletrodo nos três eixos, Z, Y e X.Antes de iniciar o experimento, temos que fazer o microeletrodo.
Usamos este capilar de vidro borossilicato e este equipamento denominado polar. Anexamos o capilar de borossilicato aqui. Este filamento de tungstênio vamos aquecer para fazer dois microeletrodos.
Agora, o aquecimento do filamento de tungstênio e a onda aqui vamos puxar para baixo para fazer os dois microeletrodos. Fácil. Nosso primeiro passo é preencher o microeletrodo com o corante. Uma dica aqui é que você tem que preencher apenas a ponta com alguns microlitros para fazer o experimento.
Não é necessário preencher tudo. Nota com mais detalhes. Preencha apenas a ponta.
Vamos começar um experimento. Temos aqui as células na placa de Petri, em uma solução de sódio. O fio de prata conectado ao gerador de corrente.
Agora temos que conectar os microeletrodos no estágio principal. Aqui no estágio principal, temos outro fio de prata também conectado ao gerador de corrente. Uma vez que o microeletrodo é conectado, podemos colocá-lo dentro do banho.
Observe que a ponta da pipeta está tocando cuidadosamente o banho. Este procedimento é feito com muito cuidado para evitar a colisão da ponta no fundo da placa de Petri. Uma vez dentro do banho, podemos ir ao microscópio para procurar a sombra da micropipeta.
Recomendamos que comecemos a olhar na lente de ampliação. Quando encontramos a sombra da pipeta, podemos mover o microeletrodo em direção à célula usando o micromanipulador. Uma vez que está muito perto da célula, podemos fazer um teste para verificar se o microeletrodo não está obstruído.
Como veremos a seguir. Aqui estamos vendo a micropipeta e ajustando a micropipeta muito perto da célula. Podemos ver o movimento celular à direita e à esquerda.
Em seguida, mudamos para o filtro, filtro de fluorescência. Podemos aplicar pulso hiperpolarizante para testar se a ponta da pipeta não está obstruída. Como a micropipeta está dentro da célula, podemos aplicar pulso hiperpolarizante para carregar a célula com o corante.
Usamos aqui o corante amarelo solto e livre. Depois de carregar a célula com o corante, se as células vizinhas estiverem conectadas por injeções de lacuna, esperamos alguns minutos e veremos as células vizinhas brilhando pela difusão do corante por essas injeções de lacuna. Em nosso experimento, podemos ver cinco células, marcadas com estrelas, mostrando fluorescência.
Aqui há um bom exemplo de um experimento de microinjeção em células epiteliais tímicas, em A e B.In as figuras C e D, mostra uma microinjeção em célula tímica inerte de amarelo livre solto e outro corante, não permeável à injeção de gap mostrada na inserção. A linha de células epiteliais tímicas figura E e F microinjetada com amarelo livre solto e na inserção amarelo livre solto e um bloco de injeção de lacuna. Os resultados mostram que o amarelo livre solto não se espalhou para as células vizinhas.
Em seguida, vemos uma microinjeção em células epiteliais tímicas, na presença de dexametasona e a quantificação em B. A dexametasona aumentou o grau de acoplamento, como mostra a figura B. De 100 injeções, o número de três ou quatro células conectadas foi mais frequente na presença dessa droga. Espero poder ajudar os iniciantes a fazer essa importante técnica para o estudo da comunicação celular. Obrigado e tchau.
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Visão Geral
Este artigo descreve a técnica de microinjeção em célula única de Lucifer Yellow para visualizar a comunicação celular através de junções gap em células vivas. Fornece dicas práticas para pesquisadores avaliarem o acoplamento celular devido a junções gap funcionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Comunicação Celular
- Neurociência
- Imunologia
Fundamentos
- As junções gap desempenham papéis críticos em processos fisiológicos.
- Elas estão envolvidas na transmissão sináptica e nas contrações cardíacas.
- Entender sua funcionalidade é essencial para vários estudos biológicos.
- Lucifer Yellow é um corante fluorescente usado para visualização.
Propósito do Estudo
- Demonstrar a técnica de microinjeção para estudar junções gap.
- Avaliar o grau de acoplamento celular em células vivas.
- Fornecer insights sobre a funcionalidade das junções gap.
Métodos Utilizados
- Microinjeção em célula única de Lucifer Yellow.
- Visualização da comunicação celular.
- Avaliação de junções gap funcionais.
- Adaptação da técnica para outros corantes fluorescentes.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida da comunicação celular via junções gap.
- Avaliação do acoplamento celular demonstrada.
- Técnica aplicável a vários corantes fluorescentes com menos de 1.000 Daltons.
- Insights sobre os papéis fisiológicos das junções gap fornecidos.
Conclusões
- A técnica de microinjeção é eficaz para estudar junções gap.
- Lucifer Yellow serve como uma ferramenta útil para visualização.
- Os resultados contribuem para a compreensão da comunicação celular em sistemas vivos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Single-cell microinjection enables direct assessment of gap junction functionality, a key mechanism in cellular communication relevant to drug target validation in neuroscience, immunology, and tissue engineering. By visualizing real-time dye diffusion, researchers can evaluate compound effects on intercellular coupling, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, functional readouts that improve target confidence and inform go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether a target modulates gap junction-mediated communication.
- Operational Value: Enables functional validation of connexin or hemichannel targets in live cells.
- Predictive Value: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct observation of dye transfer.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated cellular systems for compound screening by establishing baseline coupling.
- Quantitative Output: Measures diffusion kinetics as a functional readout for assay standardization.
- Scalability: Adaptable to high-content imaging platforms for multi-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological processes like synaptic transmission and heart contraction where gap junctions are implicated.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical models by confirming functional coupling in relevant cell types.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement based on evidence of target engagement in cellular networks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to assess target effects on cellular communication before progressing to phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Tests hypothesis that a compound or genetic modulator alters intercellular signaling via gap junctions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence data to compare treatment conditions.
- Analytics: Provides measurable diffusion metrics that enable statistical comparison of coupling efficiency.
- Translational Research: Uses epithelial and immune-relevant cell lines to model tissue-level communication.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating connexin-targeting compounds across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by confirming functional target modulation in a native cellular context.
- Operational Value: Standardizes microinjection and imaging protocols for reproducible results across labs.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by identifying ineffective modulators of cellular coupling early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds demonstrating gap junction modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, fluorescence microscopy, and dye handling.
- Depends on micromanipulator stability, electrode preparation, and intracellular injection precision.
- Necessitates standardized cell preparation and bath conditions to ensure consistent results.
- Must account for cell type variability in connexin expression and baseline coupling.
- Limited to dyes under ~1,000 Da that can pass through gap junctions, as larger molecules remain cell-autonomous.
