Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir moléculas pequenas ou proteínas marcadas com fluoróforo no citoplasma de uma célula de mamífero cultivada e observar as alterações morfológicas induzidas com resolução de micrômetro a múltiplos nanômetros. Isso é alcançado primeiramente cultivando-se células de mamífero sobre lamínulas de vidro com grade e microinjetando-as com uma molécula pequena ou proteína de interesse marcada com fluoróforo. Em seguida, as células são fixadas em formaldeído e observadas e registradas por microscopia de fluorescência.

Em seguida, as células são fixadas com glutaraldeído, seccionadas, coradas e visualizadas por microscopia eletrônica. Por fim, as imagens obtidas durante a microscopia fluorescente de campo claro e a microscopia eletrônica são combinadas e alinhadas. Em última instância, a correlação dessas imagens permite ao pesquisador visualizar com alta resolução as perturbações induzidas pela molécula pequena ou pela proteína de interesse.

Olá, sou o Dr. Evan Reddick no laboratório do Dr. Neil Alto, do departamento de microbiologia do Centro Médico da Universidade do Texas em Dallas. Hoje vou falar com vocês sobre o procedimento M Clem, ou microinjeção com microscopia correlativa de luz e elétrons. A principal vantagem desse procedimento em relação a técnicas isoladas, como microinjeção ou microscopia, é que aqui elas são realizadas em conjunto e auxiliadas pelo uso de uma lamínula de vidro com grade.

É essa lamínula com grade que permite aos pesquisadores retornar à mesma célula durante diferentes etapas do protocolo. Além disso, essa técnica oferece ao pesquisador a capacidade de observar alterações arquitetônicas subcelulares induzidas por uma grande variedade de pequenas moléculas injetáveis ou proteínas de interesse, e de fazê-lo com resolução que varia de micrômetros a vários nanômetros. Para se preparar para a microinjeção, cultive células, como células renais de rato normais ou células de câncer cervical imortalizadas, em lamínulas de vidro com grade fotogravada fixadas em placas para células vivas, e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Dependendo da linha do tempo experimental a ser utilizada, ajuste a confluência das células. Uma placa totalmente confluente tornará a identificação de células microinjetadas no microscópio eletrônico muito difícil. Portanto, semeie as células de modo que atinjam cerca de 50% de confluência no dia de um experimento curto e cerca de 25% de confluência.

No dia de um experimento mais longo, prepare proteínas marcadas com fluoróforo, DNA ou moléculas pequenas no tampão apropriado até um volume final de 50 microlitros. Dependendo do fluoróforo escolhido, adicione um corante de rastreamento, como vermelho Texas ou azul cascade. Adicione uma concentração de 0,5 a 1 miligrama por mililitro.

Filtre a solução através de um filtro centrífugo de 0,22 mícron. Após puxar as micropipetas de injeção seguindo as orientações do fabricante, pipete cuidadosamente microlitros da solução na extremidade traseira de uma micropipeta. Insira a micropipeta no braço do micromanipulador de um dispositivo comercial de microinjeção acoplado a um microscópio invertido.

Coloque uma placa de células cultivadas no suporte da placa do microscópio invertido. Localize células crescendo dentro de uma grade com gravação fotolitográfica e anote o identificador alfanumérico da grade. Este será utilizado em todas as etapas subsequentes.

É importante escolher células para microinjeção que estejam aderidas próximas ao centro do lamínula e evitar aquelas próximas à periferia. Isso é essencial para garantir uma transferência eficiente das suas células de interesse para o centro de resina epóxi utilizado posteriormente na microscopia eletrônica. Manualmente, abaixe o braço de injeção sobre o lamínula e use o micromanipulador para baixar a agulha até que a ponta toque suavemente a superfície das células. Microinjete a cada outra célula dentro da grade escolhida; para células cultivadas com cerca de 50% de confluência, espere em torno de 80 células por grade de 600 micrômetros quadrados, o que resultará em um N de aproximadamente 30 a 40 células experimentais e controle.

Após a injeção, coloque a placa de volta no incubador por um período desejado para realizar a microscopia fluorescente. Descarte o meio de crescimento e fixe as células com formaldeído em PBS à temperatura ambiente por 10 minutos. Substitua o fixador por um XPBS.

Em seguida, documente o arranjo das células obtendo de cinco a dez imagens de campo claro da grade escolhida em baixa e alta ampliação. Para identificar as células microinjetadas, obtenha imagens fluorescentes nos comprimentos de onda de excitação e emissão do corante inerte injetado no olho. Utilizando um microscópio confocal, colete um z-stack de imagens das células microinjetadas em alta ampliação dentro da mesma grade previamente analisada.

É necessária uma ampliação elevada para correlacionar imagens fluorescentes com estruturas subcelulares que serão identificadas utilizando microscopia eletrônica. Após a imagem confocal, utilize um fluido removedor de lamínulas para separar a lamínula do recipiente e coloque-a com o lado das células voltado para cima em um novo recipiente de cultura contendo um XPBS. Prossiga para o processamento para microscopia eletrônica.

Seja após seguir os protocolos padrão de ME. Para fixar a coloração e desidratar as amostras, prepare a resina de epon e posicione a lâmina com o lado das células voltado para baixo sobre um tubo cheio de resina de epon. Deixe a resina polimerizar a 60 graus Celsius por 24 horas.

Para remover a lamínula da resina epon, mergulhe-a rapidamente em nitrogênio líquido. O choque térmico de 60 graus Celsius para menos 196 graus Celsius.

Desprende a lamínula do tubo de resina. Espere de cinco a dez minutos, depois recupere o tubo, que agora está livre da lamínula. Sob um microscópio estereoscópico, inspecione a superfície da resina para localizar a grade de interesse.

Usando uma lâmina de barbear estéril ou bisturi, corte o bloco de epóxi de forma que apenas a grade de interesse fique no ápice do bloco; corte seções seriadas do bloco aparado com um ultramicrótomo. Contraste as seções usando acetato de uranila e citrato de chumbo, seguindo protocolos padrão. Localize as células desejadas no microscópio eletrônico utilizando a posição relativa das células como guia, com base nas imagens fluorescentes de alta resolução capturadas anteriormente.

Identifique regiões de interesse na micrografia eletrônica que correspondam ao sinal fluorescente. Utilize marcos referenciais, como a posição da heterocromatina e do envelope nuclear, para determinar qual imagem fluorescente de Zack corresponde à fatia de ME. Atualmente sendo processada com um programa de imagem, como o Image J ou o Adobe Photoshop, reduza a opacidade da imagem fluorescente para 50% e sobreponha-a à imagem correspondente de MET.

Alinhe as imagens ajustando a escala mostrada. Aqui estão os resultados da microinjeção e da microscopia correlativa de luz e elétrica. Esta imagem mostra a micrografia de campo claro de células NRK crescendo em uma lamínula com grade de vidro gravada a laser.

Observe as letras de fundo b e m usadas para identificar a grade contendo as células injetadas. As setas indicam as duas células identificadas e analisadas por microscopia eletrônica. É mostrada aqui uma imagem fluorescente do corante inerte cascade blue utilizado para identificar as células microinjetadas.

Aqui está uma sobreposição dos sinais de campo claro e fluorescente de uma molécula pequena marcada com amina. Este painel representa a correlação entre microscopia fluorescente de campo claro e microscopia eletrônica de uma célula injetada. A seta indica pontos fluorescentes imagens com maior magnificação neste painel.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como microinjetar uma proteína de interesse e acompanhar as alterações morfológicas subcelulares que ela induz, utilizando o procedimento de microinjeção Clem ou microscopia correlativa de luz e elétrons.