Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir pequenas moléculas ou proteínas marcadas com fluorescência no citoplasma de uma célula de mamífero cultivada e observar as mudanças morfológicas induzidas de resolução micrométrica para multinanométrica. Isso é conseguido primeiro cultivando células de mamíferos em lamínulas de vidro quadriculadas e microinjetando-as com uma pequena molécula ou proteína de interesse marcada com fluorescência. Em seguida, as células são fixadas em formaldeído e observadas e fotografadas usando microscopia de fluorescência.

Em seguida, as células são fixadas com glutaraldeído, seccionadas, coradas e fotografadas por microscopia eletrônica. Finalmente, as imagens tiradas durante a microscopia fluorescente e eletrônica de campo claro são combinadas e alinhadas. Em última análise, a correlação dessas imagens permite ao pesquisador obter imagens de perturbações de alta resolução induzidas pela pequena molécula ou proteína de interesse.

Olá, sou o Dr. Evan Reddick no laboratório do Dr. Neil Alto no departamento de microbiologia do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas, em Dallas. Hoje vou falar com vocês sobre o procedimento M Clem ou a microscopia eletrônica e de luz correlativa de microinjeção. A principal vantagem desse procedimento em relação às técnicas autônomas, como microinjeção ou microscopia, é que aqui elas são realizadas em conjunto e auxiliadas no uso de uma lamínula de vidro quadriculada.

É essa lamínula quadriculada que permite que os pesquisadores retornem à mesma célula durante diferentes partes do protocolo. Além disso, esta técnica oferece ao pesquisador a capacidade de observar induzir mudanças arquitetônicas subcelulares a partir de uma ampla variedade de pequenas moléculas injetáveis ou proteínas de interesse, e fazê-lo de resolução micrométrica a multinanométrica. Para se preparar para a cultura de microinjeção, células como rim de rato normal ou células cancerígenas cervicais imortalizadas em lamínulas de vidro gravadas com foto, duas placas de células vivas incubam as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Dependendo do cronograma experimental a ser usado, ajuste a cofluência das células. Uma placa totalmente confluente dificultará muito a identificação de células microinjetadas no microscópio eletrônico. Portanto, as células-semente atingem cerca de 50% de fluência de co no dia de um experimento curto e cerca de 25% de fluência de co.

No dia de um experimento mais longo, prepare DNA de proteína marcado com fluorescência ou pequenas moléculas no tampão apropriado para um volume final de 50 microlitros. Dependendo do Fluor ofor de sua escolha, adicione um corante de rastreamento, como vermelho Texas ou azul cascata. Adicione uma concentração de 0,5 a um miligrama por mililitro.

Filtre a solução através de um filtro centrífugo de 0,22 mícron. Depois de puxar as agulhas de microinjeção usando as diretrizes do fabricante, pipete cuidadosamente para microlitros de solução na parte de trás de uma agulha. Carregue a agulha no braço do micromanipulador de um dispositivo de microinjeção comercial conectado a um microscópio invertido.

Coloque um prato de células cultivadas no suporte do prato do microscópio invertido. Encontre células crescendo dentro de uma grade gravada por foto e observe o identificador alfanumérico da grade. Isso será usado em todas as etapas subsequentes.

É importante escolher células para microinjeção que estejam aderidas perto do centro da lamínula e evitar aquelas próximas à periferia. Isso é importante, pois garantirá uma transferência eficiente de suas células de interesse para a peça central de resina epon usada posteriormente para microscopia eletrônica Manual, abaixe manualmente o braço de injeção sobre a lamínula e use o micro manipulador para abaixar a agulha até que a ponta toque suavemente a superfície das células. Micro injetar todas as outras células dentro da grade escolhida para células cultivadas a cerca de 50% de fluência de Co, espere cerca de 80 células por grade de 600 micrômetros quadrados, o que dará um N de cerca de 30 a 40 células experimentais e controladas.

Após a injeção, coloque o prato de volta na incubadora por um período de tempo desejado para realizar a microscopia fluorescente. Descarte o meio de crescimento e fixe as células com formaldeído em PBS em temperatura ambiente por 10 minutos. Substitua o fixador por um XPBS.

Em seguida, documente o arranjo das células tirando de cinco a 10 imagens de campo brilhante da grade escolhida em baixa e alta ampliação. Para identificar as células microinjetadas, tire imagens fluorescentes nos comprimentos de onda de excitação e emissão do olho do corante de injeção inerte. Usando um microscópio confocal, colete um Zack de imagens de células micro injetadas em alta ampliação dentro da mesma grade de imagens anteriores.

É necessária alta ampliação para correlacionar imagens fluorescentes com estruturas subcelulares que serão identificadas por microscopia eletrônica. Após a imagem confocal, use um fluido de remoção de lamínula para separar a lamínula do prato e coloque-o com o lado da célula voltado para cima em um novo Prossiga para o processamento para microscopia eletrônica.

Esteja depois de seguir os protocolos EM padrão. Para corrigir manchas e desidratar as amostras, prepare a resina epon e coloque a lamínula com o lado da célula voltada para baixo em cima de um tubo cheio de resina eon. Deixe a resina polimerizar a 60 graus Celsius por 24 horas.

Para remover a lamínula da resina epon. Mergulhe-o rapidamente em nitrogênio líquido. O choque de temperatura de 60 graus Celsius para 196 graus Celsius negativos.

Desaloja a lamínula do tubo de resina. Aguarde de cinco a 10 minutos e, em seguida, recupere o tubo, que agora está livre da lamínula. Sob um escopo de dissecação, inspecione a superfície da resina para localizar a grade de interesse.

Usando uma lâmina de barbear estéril ou bisturi, apare o bloco epon de forma que apenas a grade de interesse esteja no ápice do bloco com um corte ultra microtom, seções seriais do bloco aparado usam acetato de mictório e citrato de chumbo para contrastar as seções usando protocolos padrão. Reposicione as células desejadas no microscópio eletrônico usando o posicionamento relativo das células como guia. Usando as imagens fluorescentes de alta resolução capturadas anteriormente.

Identifique regiões de interesse na micrografia eletrônica que correspondem ao sinal fluorescente. Use pontos de referência como a posição da heterocromatina e o envelope nuclear para determinar qual imagem Zack fluorescente corresponde à fatia EM. Atualmente sendo fotografado com um programa de imagem como Image J ou Adobe Photoshop, reduza a opacidade da imagem fluorescente para 50% e sobreponha-a na imagem TEM correspondente.

Alinhe as imagens ajustando a escala mostrada. Aqui estão os resultados da microinjeção e microscopia de luz e eletrônica correlativa. Esta imagem mostra a micrografia de campo claro das células NRK crescendo em uma lamínula de cobertura de vidro gravada a laser.

Observe as letras de fundo b e m usadas para identificar a grade que contém as células injetadas. As setas indicam as duas células identificadas e fotografadas com microscopia eletrônica. Aqui é mostrada uma imagem fluorescente da cascata de corante inerte usada para identificar células microinjetadas.

Aqui está uma sobreposição dos sinais de campo claro e fluorescentes da pequena molécula marcada com amina. Este painel representa a correlação da microscopia fluorescente de campo claro e eletrônica de uma célula injetada. A ponta da seta indica pontos fluorescentes fotografados com maior ampliação neste painel.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microinjetar uma proteína de interesse e rastrear suas alterações morfológicas subcelulares que ela induz usando o procedimento de microinjeção Clem ou microscopia eletrônica e de luz correlativa.