Name: Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a técnica CLEM para visualizar moléculas microinjetadas e seus alvos subcelulares em células de mamíferos. Este método combina microscopia de fluorescência e eletrônica para análise de alta resolução.

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Agradecemos a membros do laboratório Alto para discussões úteis. Agradecemos também a Facilidade Imagem Molecular e Celular da UT Southwestern Medical Center, especificamente o Dr. Chris Gilpin, Januszewski Tom, e Mueller Laurie para perícia técnica e aconselhamento. Agradecemos também o Dr. Xionan Dong para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo NIH concessão AI083359 a NMA

1. Cultura de Células de mamífero <ol><li> Rim de Rato Normal (NRK), imortalizada cancro cervical (HeLa), ou outras linhas celulares de mamífero adequadas são cultivadas a 37 ° C, 5% CO 2, em lamelas de vidro em grade photoetched afixados viver pratos de células (ver Tabela 1 para qualquer reagente ou aparelho utilizado neste protocolo) em DMEM + 10% FBS e 1% de Pen / Strep. Precauções devem ser tomadas para manter um ambiente estéril quando se trabalha com cultura de células de mamíferos. </li><li> Dependendo da sua linha de tempo experimental (0-5 horas após a injecção vs 1-2 dias), a confluência das células deve ser ajustado para ~ 50% ou ~ 25%, respectivamente. </li></ol> 2. Microinjeção <ol><li> Preparar proteína desejada, o DNA, ou de moléculas pequenas na sua escolha de tampão, de acordo com a sua receptividade para cultura celular, para um volume final de 50 ul ~. Inertes corantes fluorescentes como o Texas vermelho ou azul Cascadeestão incluídos, a fim de marcar as células microinjectados; escolha do corante de injecção e sonda fluorescente deve ter excitação não sobrepostos e comprimentos de onda de emissão. A concentração da molécula de interesse o necessário para microinjecção devem ser determinados empiricamente, e os corantes de rastreamento fluorescentes são comumente utilizados em 0,5-1,0 mg / ml. Tipicamente, rodamina ou outro fluoróforo é ligado de forma covalente à sua molécula de interesse utilizando um kit comercial, no entanto, outros métodos de detecção podem ser utilizados dependendo da sensibilidade. Para mais informações, consulte Considerações críticas abaixo. </li><li> Filtra-se a injectant (~ 50 ul) através de um filtro de 0,22 uM centrífuga. Filtros centrífugos são preferidos em relação a vácuo e / ou filtração de seringa, que tem associado volumes mortos. </li><li> Para gerar a agulha microinjeção, pipetas de vidro de borosilicato são puxados usando um Flaming-Brown Micropipeta Puller seguintes orientações dos fabricantes. Alternativamente microinjecção,agulhas podem ser adquiridos de fornecedores como Eppendorf que torna as agulhas microinjeção femtotip. </li><li> Cuidadosamente pipetar 4 ul de injectant no final unmolested da agulha microinjeção usando Eppendorf 20 Femtotips. Verifique se não há bolhas de ar no interior da agulha microinjeção puxado. Carregar agulha de microinjecção para o braço do micromanipulador Eppendorf FemptoJet InjectMan ligado a um microscópio invertido. Para uma boa revisão do procedimento de microinjeção, o leitor é direcionado para um Jornal anterior do artigo Experimentos visualizada 8. </li><li> Coloque prato de células vivas com lamela grade e células cultivadas no suporte prato do microscópio Zeiss invertido. Encontrar células em crescimento dentro de uma grade photoetched e observe o identificador alfanumérico grades, este será utilizado em todas as etapas subsequentes. Idealmente, localizar as células no centro da lamela como passos subsequentes irá limitar a transferência da amostra para as extremidades da lamela. </li><li> Braço injecção manualmente inferior no lugar sobre a lamela, e usando o joystick micromanipulador e controles, agulha de injecção inferior para baixo até que a ponta toque suavemente a superfície das células em cultura e do limite de press &quot;para impedir o movimento da agulha para além deste ponto e, assim, quebrar a frágil puxou o vidro de borosilicato. Todos os outros aspectos da microinjecção celular são realizados como por Eppendorf manual FemtoJet InjectMan. A técnica de microinjecção foi recentemente utilizada para compreender individuais de proteínas segregadas a partir de bactérias de virulência 9. </li><li> Microinject todas as outras células no interior da grelha escolhida. Com as células que cresceram em ~ 50% de confluência, pode-se esperar ~ 80 células por 600 | iM de grade 2 (exemplo mostrado na fig. 3A). Assim, após uma inspeção de microscopia de fluorescência e de electrões, haverá um n ~ experimental de 30-40 e células de controlo. </li><li> Coloque vivo de células prato de volta para a cultura de células de mamífero para a incubadora desejadotempo como ditado pela configuração experimental. Alternativamente, pode-se prosseguir directamente a partir de micro-injecção de lapso de tempo para análise por microscopia de aguardar o aparecimento de estruturas subcelulares particulares de interesse antes da fixação. </li></ol> 3. Microscopia fluorescente <ol><li> Se se desejar, realizar-vivo de células de lapso de tempo medições de fluorescência de células microinjectados, após o que, substituir o meio com glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,4) e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. No entanto, se as medições em directo de células não são necessários, descartar meios de crescimento celular e de fixar as células com 5 ml de formaldeído a 3,7% em 1xPBS à temperatura ambiente durante 10 minutos. Descarte fixador e substituir com 5 ml 1xPBS, vá para o passo 3.2. Nota: Não é crítico para adicionar glutaraldeído até depois de microscopia de fluorescência é completa. </li><li> Colocar a cápsula ao vivo das células com a lamela gridded photoetched num microscópio fluorescente (confocal não é necessário para this passo) e recolher campo brilhante e as imagens fluorescentes 5-10 da grade apropriada para documentar a disposição das células (Fig. 4A). Identificar as células que foram microinjectados utilizando os comprimentos de onda de excitação e emissão do corante inerte injecção (Fig. 4B). É importante para obtenção de imagens em diferentes ampliações (por exemplo, 10x e 65x), a fim de facilitar a identificação de células microinjectados em passos subsequentes envolvendo microscopia electrónica. </li><li> Usando um microscópio confocal de fluorescência, recolher uma pilha de Z-microinjectados de células dentro da grade identificado no passo 2.5. Grande aumento (100x) é necessária de modo a correlacionar as imagens fluorescentes com as estruturas subcelulares que serão identificados em microscopia electrónica. </li><li> As lamelas de cobertura são removidas do fundo dos pratos de células vivas com o fluido disponível comercialmente lamela remoção de células e colocou-se de lado numa placa de cultura de células virgem contendo 5 ml1xPBS. A lamela é então processado para microscopia electrónica, como detalhado abaixo. </li></ol> 4. Microscopia Eletrônica de Transmissão <ol><li> Substituir 1xPBS tampão com 2 ml de 2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,1 M (pH 7,4) e incuba-se à temperatura ambiente durante 10 minutos. De incubação mais longo, enquanto que não é necessário, ajudará a manutenção das estruturas subcelulares. Nota: formaldeído por si só não é suficiente para um fixador de análise por ME. </li><li> Remover as células do fixador e da mancha, com a adição de 2 ml de tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato 0,1 M, durante 30 min seguido de três lavagens com tampão cacodilato e, finalmente, substituir todo o tampão com DDQ 2 O. </li><li> Seguindo protocolos padrão EM, desidratar a amostra de uma série (70% a 100%) graduada de etanol. Prepare Epon resina e lamínula lugar célula lado para baixo em cima de um tubo de resina Epon-cheia. Permitir que a polimerização durante 24 horas a 60 ° C. Ao colocar a lamela photoetched grade de células-side fazerwn sobre a resina Epon, tanto as células de interesse, bem como o padrão de grade é transferida para a resina Epon durante a polimerização (exemplo mostrado na fig. 3B). </li><li> Remover lamínulas de resina Epon por rapidamente imersão em nitrogênio líquido e / ou água fervente. Inspeccionar a superfície da resina no âmbito de um escopo de dissecação binocular para localizar a grelha de interesse (nota: o padrão de grade irá transferir como uma imagem de espelho). Usando uma lâmina de barbear esterilizada ou de bisturi, o corte de blocos Epon para baixo de tal forma que apenas a grelha de interesse está no vértice do bloco de resina Epon. </li><li> Usando um ultramicrótomo, adquirir cortes seriados do bloco recortada na espessura desejada (~ 70 nm de espessura por TEM convencional e espessura ~ nm 250 para tomografia TEM). Contraste das secções com acetato de uranilo e citrato de chumbo seguindo protocolos padrão. </li></ol> 5. Luz correlativa e Microscopia Eletrônica <ol><li> Realocar as células de interesse emo microscópio eletrônico utilizando imagens obtidas em etapas anteriores. Uma vez que as células de interesse microinjectados foram localizados, use as high-resolution confocal imagens fluorescentes para identificar regiões no interior da célula que eram de interesse. Imagem estes em alta resolução usando TEM. Use monumentos como a periferia da célula e do envelope nuclear para determinar qual imagem z-stack fluorescente corresponde à EM cortar. </li><li> Usando o programa de imagem de sua escolha (por exemplo, Image J, Adobe Photoshop, etc), reduzir a opacidade da imagem fluorescente de 50% e sobrepô-lo para a imagem TEM com o qual se correlaciona. Alinhar as imagens através do ajuste da escala (lembra a restringir as proporções) e a rotação da imagem confocal para coincidir com a imagem TEM. Os ajustes finos na nitidez, contraste, etc na imagem fluorescente pode ajudar no alinhamento. Nota: descobrimos que heterocromatina, o envelope nuclear, ea periferia das células representam uma marcos excelentes para ajudarna orientação das duas imagens. </li></ol> 6. Considerações críticas <ol><li> Para grande ajuda na localização da molécula de injecção pequeno, uma etiqueta fluorescente, tais como fluoresceína ou rodamina podem ser covalentemente ligados utilizando kits disponíveis comercialmente. A informação adicional é obtida por ectopicamente expressa uma proteína marcadora fluorescente localização subcelular antes da microinjecção. Por isso, a escolha de fluoróforos e de corantes de rastreamento inerte microinjecção é importante. </li><li> Escolha de células que estão aderentes a microinjecção, perto do centro da lamela e evitar a escolha de uma grelha perto da borda. Isto vai apresentar a maior probabilidade de que as células de interesse são transferidos para a resina Epon utilizado para microscopia electrónica. </li><li> Confluência de células is importante, tal como uma placa totalmente confluente vai fazer a identificação de células microinjectados no microscópio electrónico muito difícil. Em vez disso, as células semente de tal forma que eles atingem ~ 50% de confluência no dia da experiência de um curto, ou ~ 25% de confluência no dia de um tempo (1-2 dias) experimento. Utilizar a posição e forma das células, bem como o espaço vazio &quot;como pontos de referência para orientar a imagem de microscopia electrónica. </li><li> Espessura de corte óptica confocal deve ser sintonizado com as necessidades da experiência e deve, portanto, ser determinado empiricamente 10. </li><li> O formaldeído e glutaraldeído fixadores devem ser da mais alta qualidade disponível. Formaldeído irá fixar as células, no entanto, preservar as propriedades de fluorescência de ambas as proteínas e pequenas moléculas fluorescentes (tais como FITC ou rodamina). No entanto, ele não irá preservar as estruturas para permitir a resolução EM elevada. Glutaraldeído preserva membranas e estruturas subcelulares a um elevado grau de EM anásis, mas irá prejudicar significativamente a fluorescência. Portanto, a fixação de duas etapas é crítico para a fluorescência e microscopia de EM. O passo de fixação do formaldeído pode ser omitido se apresentar ao vivo de células medidas, como a fixação final pode ser realizada por tratamento com glutaraldeído. </li></ol> 7. Resultados representativos Este procedimento proporciona a capacidade de proporcionar uma molécula de interesse directamente para o citoplasma celular eucariótica e monitorizar a sua localização e / ou efeitos na arquitectura celular e organeller de milímetro a nanometros de multi-resolução. Uma ilustração esquemática da instalação experimental e procedimento é mostrado na Figura 2. Esta técnica baseia-se na micro-injecção de células crescidas em lâminas de vidro de laser gravado em grade (Fig. 3A), que depois de microscopia confocal, é capaz de transferir ambos as células de interesse, bem como o padrão de grelha para a resina Epon (Fig.3B). Um procedimento típico CLEM microinjeção produz imagens de fluorescência e micrografia eletrônica, que, quando correlacionados, permitem que tanto a localização subcelular e análise ultra-estrutural. As células cultivadas sobre uma lamela de vidro photoetched reticulada são microinjectados com uma molécula de interesse, após o que as imagens de campo brilhante são obtidos (Fig. 4A). Um corante de rastreio inerte é incorporada para distinguir as células a partir de não-microinjectados microinjectados células (Fig. 4B). Confocal z pilhas são obtidos utilizando um fluoróforo ou outro identificador ligado à molécula de interesse microinjectados pequeno (Fig. 4C). A amostra é fixado em glutaraldeído e processados ​​para microscopia eletrônica. Eletromicrografias são obtidos e colocado sobre as células para as quais eles correspondem (Fig. 4D). Áreas abrigam sinais fluorescentes são inspecionados em maior detalhe com maior ampliação (Fig. 4E </strong&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Cronograma de procedimento CLEM microinjeção. Dependendo da configuração experimental, microinjecção e as medições de fluorescência podem ser realizadas no mesmo dia. Preparação da amostra para microscopia eletrônica é mais devido tempo consumindo a passos longos de incubação e irá durar 2-3 dias. TEM análise e correlação de sinais de fluorescência, com imagens de microscopia electrónica pode ser feita em um dia. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 ilustração geral do método de microinjeção CLEM Passo 1:.. Localize células de crescimento em laser lamela de vidro jateado grade e microinject molécula de interesse Passo 2:.. Captura duas imagens de campo claro e confocal fluorescentes z pilhas de células microinjetados Passo 3: prepararlamela para EM análise e incorporar em resina Epon. Usando padrão de grade transferido, aparar bloquear tais que as células de interesse são o ápice Passo 4:. Corte cortes seriados com ultramicrótomo Passo 5:. Correlacionar imagens fluorescentes com EM imagens. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="Figura 3"/> . Figura 3 padrão de grade facilita a identificação das células de interesse O painel A mostra a micro-injecção de células cultivadas para ~ 50% de confluência,. Observe a grade identificador aK. Barra de escala é 100 um. Painel B mostra o padrão de grade transferido da lamela para o bloco de resina polimerizada Epon que serão seccionados seriadamente após a grelha de interesse é identificado com um microscópio de dissecção. Painel C mostra o padrão de grade transferido, em preparação para o seccionamento . Note-se que o padrão de grade é transferido no sentido inverso sobre o bloco de resina; scalbar e é de 1200 m. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="Figura 4"/> .. Figura 4 Os resultados representativos de luz microinjecção correlativa e microscopia electrónica O painel A mostra a micrografia de campo claro de células NRK em crescimento sobre uma lamela de vidro do laser gravado reticulada; setas indicam duas células que são visualizadas por CLEM em CD painéis O painel B mostra a fluorescência. de o corante de rastreio inerte, neste caso, Cascade Blue, usado para identificar as células que foram microinjectados. Painel C mostra a sobreposição do campo luminoso e a assinatura de fluorescência de uma molécula marcada com rodamina pequena. As duas células mostradas aqui são indicados por setas nos painéis A e B. O painel D representa CLEM de campo claro, microscopia de fluorescência e de electrões;. Cabeça da seta indica puncta fluorescente fotografada na maior ampliação em Painel E barras de escala são como folforma: Os painéis A e B, 100 um, c &amp; D, 50 mm; E, a 100 nm.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado permite a entrega directa de proteínas purificadas, ácidos nucleicos, ou moléculas pequenas para o citoplasma eucariótico e permite a análise de alta resolução ultra através da correlação de microscopia de fluorescência e de electrões. A utilização deste método é simples e robusto e pode ser realizado in-house com muitas instalações nucleares existentes e / ou laboratórios adequadamente equipados de microscopia electrónica. A técnica é também passível de live-célula, que permite ao utilizador c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Coverslip Photoetched e Live-célula Placa </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascata Azul </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina Labeling Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 unidade de filtração centrífuga uM </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de vidro de borosilicato </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modelo P-97 </td><td> Utilize o programa # 4 após a realização de teste de rampa </td></tr><tr><td> FemtoJet Sistema Microinjeção </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Lamela Fluid Remoção </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai microscópio eletrônico de transmissão </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

microscópio óptico e eletrônica (clem) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas sub-celulares metas

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

A célula eucariótica depende complexo, altamente regulado, e compartimentos da membrana acoplados funcionalmente distintos que preservam a polaridade bioquímico necessário para a função celular adequada. Entender como as enzimas, proteínas e componentes do citoesqueleto governar e manter esta segregação bioquímica é, portanto, de suma importância. A utilização de moléculas fluorescentes marcadas para localizar e / ou perturbam compartimentos subcelulares rendeu uma riqueza de conhecimentos e avanços na compreensão da regulação celular. Técnicas de imagiologia tais como a microscopia de fluorescência confocal e fazer a determinar a situação de uma molécula fluorescente etiquetado pequeno relativamente simples, no entanto a resolução de estruturas muito pequenas é limitada 1. Por outro lado, a microscopia electrónica revelou detalhes da morfologia subcelular com resolução muito elevada, mas a sua natureza estática torna mais difícil de medir pró altamente dinâmicosos com precisão 2,3. Assim, a combinação de microscopia de luz por microscopia de electrões de uma mesma amostra, denominado microscópio óptico e electrões (CLEM) 4,5, proporciona as vantagens duplas de ultra imagem fluorescente com a alta resolução de microscopia electrónica de 6. Esta poderosa técnica foi implementada para estudar vários aspectos da biologia celular 5,7. Desde a sua criação, este procedimento tem aumentado a nossa capacidade de distinguir arquiteturas subcelulares e morfologias em alta resolução. Aqui, apresentamos um método simplificado para a realização de microinjeção rápida seguida de CLEM (Fig. 1). O procedimento CLEM microinjecção pode ser utilizado para introduzir quantidades específicas de moléculas pequenas e / ou proteínas directamente para o citoplasma da célula eucariótica e estudar os efeitos de milímetro a nanometros de multi-resolução (Fig. 2). A técnica baseia-se na microinjectingcélulas cultivadas em lamínulas gravadas a laser de vidro grade aposta para o fundo de pratos de células vivas e de imagem com tanto microscopia confocal fluorescente e eletrônica. Localização da célula (s) de interesse é facilitado pelo padrão de grade, a qual é facilmente transferido, juntamente com as células de interesse, para a resina Epon utilizado para imobilização de amostras e de corte antes da análise por microscopia de electrões (fig. 3). Sobreposição de imagens de fluorescência e EM permite ao utilizador determinar a localização subcelular, assim como quaisquer alterações morfológicas e / ou induzidos por ultra-estrutural da molécula de interesse microinjectados (Fig. 4). Esta técnica é passível de pontos de tempo variando de ≤ 5 s até várias horas, dependendo da natureza da amostra microinjectados.

A técnica CLEM foi adaptado para analisar a morfologia ultraestrutural de membranas, organitos e estruturas subcelulares afectados por moléculas microinjectados. Este método combina as técnicas poderosas de micromanipulação / microinjeção, microscopia confocal, fluorescentes e microscopia eletrônica para permitir milímetros de multi-resolução nanométrica. Esta técnica é susceptível a uma grande variedade de aplicações.

Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas

A célula eucariótica depende de compartimentos delimitados por membranas, complexos, altamente regulados e funcionalmente distintos, que preservam uma polaridade bioquímica...

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir moléculas pequenas ou proteínas marcadas com fluoróforo no citoplasma de uma célula de mamífero cultivada e observar as alterações morfológicas induzidas com resolução de micrômetro a múltiplos nanômetros. Isso é alcançado primeiramente cultivando-se células de mamífero sobre lamínulas de vidro com grade e microinjetando-as com uma molécula pequena ou proteína de interesse marcada com fluoróforo. Em seguida, as células são fixadas em formaldeído e observadas e registradas por microscopia de fluorescência.Em seguida, as células são fixadas com glutaraldeído, seccionadas, coradas e visualizadas por microscopia eletrônica. Por fim, as imagens obtidas durante a microscopia fluorescente de campo claro e a microscopia eletrônica são combinadas e alinhadas. Em última instância, a correlação dessas imagens permite ao pesquisador visualizar com alta resolução as perturbações induzidas pela molécula pequena ou pela proteína de interesse.Olá, sou o Dr. Evan Reddick no laboratório do Dr. Neil Alto, do departamento de microbiologia do Centro Médico da Universidade do Texas em Dallas. Hoje vou falar com vocês sobre o procedimento M Clem, ou m

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Biologia

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

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Um método de microscopia de elétron luz correlativo (CLEM) é aplicado às estruturas intracelulares induzida por vírus imagem através de microscopia eletrônica (EM) em células que são previamente selecionadas pela microscopia de luz (LM). LM e eme são combinados como uma abordagem de imagem híbrida para alcançar uma visão integrada das interações do vírus-anfitrião.

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Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

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