Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

O objetivo geral deste procedimento é extrair proteínas de levedura, preservando a estrutura nativa, as interações funcionais e as modificações pós-tradução. Isso é feito primeiro cultivando células para induzir a expressão da proteína de interesse. Em seguida, as células de levedura colhidas são homogeneizadas em um tampão adequado para extrair as proteínas.

Em seguida, as proteínas de interesse são purificadas a partir do extrato de células inteiras clarificado usando uma afinidade de resina. A etapa final do procedimento é iludir as proteínas purificadas da resina de afinidade para análises posteriores ou aplicações a jusante. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram modificações e interações de purificação de proteínas com base na análise de western blot.

Demonstrando o procedimento estará Ky de Eva, graduado em William e Mary, que passou os últimos dois anos como pesquisador de graduação em meu laboratório. A principal vantagem do beading de contas sobre outros métodos existentes é o rápido processamento e lise de várias amostras sob condições que preservam as interações da função da proteína e as modificações pós-tradução. Para começar a transformar células de uma cepa de levedura gal positiva com um plasmídeo que codifica uma galactose induzível seis, sua proteína marcada de escolha inocula transformantes em cinco mililitros de meio seletivo apropriado, como SD uracila, contendo 2% de sacarose e incuba a 30 graus Celsius durante a noite com rotação no dia seguinte dilua a cultura noturna em meio seletivo com 2% de sacarose para um volume final de 33 mililitros para que a densidade óptica em 600 Os nanômetros medem 0,3, crescem em uma incubadora agitada a 30 graus Celsius e 150 RPM.

Quando a cultura atingir uma DO 600 de 0,8 a 1,5, induzir a expressão da proteína desejada adicionando 17 mililitros de três XYEP com 6% de galactose para uma concentração final de um XYEP com 2% de galactose colocado em uma incubadora agitada a 30 graus Celsius por mais cinco a seis horas. Depois de medir o OD 600 da centrífuga de cultura induzida cerca de 150 a 200 unidades OD 600 de células por cinco minutos a 5.000 RPM a quatro graus Celsius, em seguida, use um mililitro de um XPBS gelado com um coquetel inibidor de protease x para ressuspender o palato celular e transferi-lo para um tubo de tampa de rosca de dois mililitros, centrifugue as células por um minuto a 15, 000 RPM e quatro graus Celsius. Após a decantação do sobrenadante, congelar o sedimento celular em nitrogênio líquido até o sedimento de célula congelada.

Adicione 200 microlitros de contas de vidro lavadas com ácido e 500 microlitros de tampão de lise gelada. Manter os tubos no gelo o tempo todo. Use uma ponta de pipeta com o corte final para pipetar brevemente para cima e para baixo a quatro graus Celsius.

Coloque os tubos de células na trava de equilíbrio do moinho de esferas e opere a máquina de acordo com as instruções do fabricante por 20 segundos a 5.5 metros por segundo. Em seguida, coloque os tubos em gelo lamacento por um minuto. Repita um total de seis vezes para limpar as proteínas extraídas centrifugue por 15 minutos a 15.000 RPM a quatro graus Celsius.

Em seguida, para preparar uma amostra do extrato de células inteiras ou WCE para western blot e WCE correspondente a duas unidades OD 600 de células para 800 microlitros de ácido tricloroacético a 20% ou vórtice TCA para misturar. Para purificar uma amostra de WCE transparente a 50 a 100 microlitros de resina de afinidade em um novo tubo de microcentrífuga, lave e equilibre a resina adicionando um mililitro de tampão de lavagem e inverta de cima para baixo até que a resina seja ressuspensa. Depois de girar por um minuto a 5.000 RPM e quatro graus Celsius, aspire o sobrenadante para ligar a proteína para purificação por afinidade a 100 a 200 microlitros de lisado limpo aos grânulos lavados e use tampão de lise para trazer o volume total para um mililitro.

Incubar com mutação ou balançar a quatro graus Celsius por duas a cinco horas. Use nitrogênio líquido para quebrar alíquotas congeladas do WCE claro restante e armazene a menos 80 graus Celsius até uso posterior, enquanto a solução de beterraba lisada está incubando para a amostra de WCE Western blot no gelo. Depois de girar por dois minutos e meio a 15.000 RPM a quatro graus Celsius, decantar o sobrenadante tomando cuidado para reter o pellet, adicionar 800 microlitros de 2% de TCA ao pellet e vortex o tubo antes de repetir a centrifugação de dois minutos e meio.

Depois de decantar cuidadosamente o sobrenadante, adicione 100 microlitros de tampão de amostra de TCA e vórtice para dissolver o pellet antes de incubar a amostra. Em um bloco de calor de 100 graus Celsius por dois a cinco minutos, leva uma segunda vez para dissolver completamente quaisquer restos do pellet, que pode ser difícil de dissolver e armazenar a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para uso. Uma vez que a amostra de grânulos de lisado é incubada, depois de girar a 5.000 RPM e quatro graus Celsius por um minuto, use tampão de lavagem para lavar a resina cinco vezes para eluir as proteínas.

Adicione 150 microlitros de tampão de eluição ao multato de resina a quatro graus Celsius por cinco minutos. Gire por um minuto a 5.000 RPM e quatro graus Celsius e guarde o sobrenadante em um novo tubo. Finalmente, para preparar uma amostra para western blot a 25 microlitros de dois tampão de amostra de sulfato docal de lítio com dois microlitros de BME para 25 microlitros de amostra de proteína UD.

Conforme mostrado nesta figura, uma ampla gama de proteínas pode ser extraída de forma reprodutível de células de levedura. Bandas discretas em uma variedade de pesos moleculares são indicativas de extratos de proteínas de alta qualidade. A qualidade dos extratos pode ser confirmada por western blotting para proteínas marcadas com epítopos específicos.

Aqui está um resultado representativo para a galactose superexpressa V cinco marcados Sumo Ligase é aquele que migra a cerca de 120 kilodaltons. Geralmente, proteínas parcialmente degradadas correriam como vários fragmentos abaixo do peso esperado, mas aqui apenas proteína de comprimento total é observada. Além disso, adições de alto peso molecular de uma determinada proteína podem indicar modificações pós-traducionais.

Por exemplo, aqui você pode ver a lactose sobre o sumô expresso relacionado ao S um delta quatro 40 e o SIS de comprimento total um. Como demonstrado neste Western blot, as modificações também podem ser preservadas no S expresso endogenamente. Esta figura mostra que duas proteínas enriquecidas com energia nuclear SLX five e CS one delta four 40 foram purificadas com sucesso de nosso ws.

Notavelmente, uma proteína marcada com seis chiados pode ser purificada por afinidade de W'S, tanto em condições nativas quanto em condições desnaturantes. Em contraste, SLX 5G ST e CS um delta quatro 40 ha não possuem um epítopo de seis chiados, mas sob condições nativas ainda interagem com a resina de afinidade metálica de maneira sensível. Propomos que o CIS um e, em menor grau, o SLX cinco são capazes de ligar a resina de afinidade metálica por meio de seu domínio de anel coordenador de metal.

Embora, até onde sabemos, esse fenômeno específico ainda não tenha sido relatado, uma situação semelhante foi descrita na qual a subunidade da toxina B se liga à resina de afinidade Nicola de maneira mediada por seus resíduos naturais de histamina. Essa observação sugere que as proteínas no WCER, pelo menos em parte, se dobraram nativamente para o estudo da função da proteína. É importante mostrar que os complexos proteicos permanecem intactos em extratos de células inteiras.

Um dado representativo revelou que CS um delta quatro 40 SLX cinco, e P GK um, uma proteína citosólica que serve como controle de carga, estavam presentes em WS cis um. O Delta four 40 foi purificado a partir desses extratos com base em sua capacidade inerente de se ligar a resinas de afinidade metálica. Além disso, quando SLX cinco e SIS um foram co-expressos em células de levedura, os níveis de SLX cinco nas EITs foram aumentados, aumentando a possibilidade de que SLX cinco possa interagir com SIS um.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e processar células de levedura para extrair, purificar e visualizar proteínas de levedura em condições nativas.