Name: Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a extrair e purificar proteínas de levedura preservando estruturas nativas, interações e modificações pós-traducionais. Este método utiliza homogeneização e cromatografia de afinidade para análises bioquímicas.

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Agradecemos a todos os membros do laboratório Kerscher pelo seu apoio. Agradecemos Mark Hochstrasser para o fermento tensão MHY3765. Este trabalho foi financiado pela NSF 1051970 (para OK) e um Howard Hughes Medical Institute Graduação viagem concessão e Monroe Scholars Programa Grant (para ES).

Purificação de proteínas 6xHis-tagged expressos em células de levedura sob condições nativas brotamento 1. O crescimento de células de levedura e a indução da expressão de proteina (Modificado a partir de 2) OPCIONAL: Use logaritmicamente crescentes culturas de levedura que expressam a proteína de interesse, em vez das culturas induzidas galactose descritos abaixo. <ol><li> Transformar células de uma estirpe de levedura + Gal com um plasmídeo que codifica uma proteína indutivel galactose de escolha 6xHis-tag. Por exemplo, veja a lista dos reagentes. </li><li> Inocular os transformantes em 5 ml de meio selectivo apropriado (por exemplo, DP-uracilo), contendo 2% de sacarose. Incubar a 30 ° CO / N, rotação. </li><li> Diluir O / N a cultura de modo a que a densidade óptica a 600 nm mede 0,3 (DO600 = 0,3) em 33 ml de meio selectivo com 2% de sacarose. Crescer a 30 ° C, com agitação (Δ150 rpm). </li><li> Quando a cultura atingiu OD 600 = 0,8-1.5, Induzir a expressão da proteína pretendida por adição de 17 ml de YEP 3x com 6% de galactose (Receita na Tabela 1), para uma concentração final de 1x YEP com 2% de galactose. Volume de cultura total agora é de 50 ml. Incubar, agitação, a 30 ° C durante uma hora adicional de 5-6. Nota: o volume de cultura pode ser variada. No passo 1.3, diluído em dois terços do volume final pretendido. No passo 1.4, adicionar um terço do volume final de 3x YEP / 6% de galactose. </li><li> Medir a DO600 da cultura induzida e centrifugar Δ150-200 OD de 600 unidades de células durante 5 min a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento de células com 1 ml de gelo frio 1x com PBS 1x cocktail inibidor de protease e transferir para um tubo de tampa 2 ml parafuso. </li><li> Centrifugar as células durante 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar o sobrenadante. </li><li> Encaixe sedimento celular congelamento em azoto líquido, seguido de imediato de lise celular ou de armazenamento a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol><ol><li> Para a célula de sedimento congelado a partir do passo anterior, adiciona-se 200 ul de contas de vidro lavadas com ácido e 500 ul de tampão de lise gelado (receita na Tabela 1, ou usar tampão de escolha de lise celular). </li><li> Resumidamente pipeta cima e para baixo. Não é necessário para ressuspender completamente o sedimento celular. Manter os tubos em gelo em todos os momentos. Nota: O fim da ponteira pode ser cortada antes de pipetagem cima e para baixo. </li><li> A 4 ° C, colocar o tubo (s) com as células para o moinho de bolas, equilíbrio, bloqueio e executar a máquina como por instruções do fabricante. </li><li> Executar o batedor de talão contendo o tubo (s) de 20 segundos a 5,5 m / seg, e depois colocar em gelo lamacento durante 1 min. Repita 6x no total. </li><li> Limpar as proteínas extraídas através de centrifugação durante 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPCIONAL: remover pequenas partículas por centrifugação através de um filtro Esfinge. </li><li> Prepara-se uma amostra de toda a célula eXtract (WCE) para confirmar a presença da proteína de interesse por meio de Western Blot: <ol><li> Adicionar WCE correspondente com 2 600 unidades de OD de células (por exemplo, 5 mL do extracto limpo se 200 OD de 600 unidades de células foram colhidas) a 800 ul de 20% de ácido tricloroacético (TCA). Vortex para misturar. </li><li> Centrifugar durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar o sobrenadante, mas tenha cuidado para manter o sedimento. </li><li> Adicionar 800 uL de TCA a 2%, a pelete e o tubo de vórtice, seguido por centrifugação durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar o sobrenadante, mas tenha cuidado para manter o sedimento. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de amostra de TCA (Receita na Tabela 1), vortex para dissolver o sedimento. Nota: Se o tampão de amostra torna-se ácido (fica amarelo) após a adição ao sedimento, adicione alíquotas de Δ10 mL de Tris base de [1M] até que a amostra é azul novamente. </li><li> Incubar em um bloco de calor de 100 ° C por 2-5 min. </li><li> Vortex again para dissolver totalmente se restos de pellet ainda estão presentes. Peletes preparados por este método são notoriamente difíceis de dissolver totalmente. Pode levar Δ10 min de vortex para dissolver completamente peletes. </li><li> Amostra Armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Encaixe congelar alíquotas do restante WCE apuradas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 3. Purificação de Proteínas de lote homogenatos celulares de leveduras Nota: Este método de purificação foi optimizado para a purificação de proteínas 6xHis-tag em Co 2 + resina de afinidade com metal. <ol><li> Equilíbrio resina <ol><li> Para uma amostra de WCE preparadas a partir Δ20 sacudiu-40 OD de 600 unidades de células, adiciona 50-100 ul de resina de afinidade para um tubo de microcentrífuga. As proteínas extraídas a partir de células que não expressam a proteína desejada ou uma resina não específica, tais como amilose, pode ser usado como controles para a ligação inespecífica. </li><li> Lavar a resina 5x com 1 ml de tampão de lavagem: invertido topo-a-fundo para que a resina é suspensa de novo, e depois girar durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante. Nota: se efectuar a extracção e purificação, no mesmo dia, o equilíbrio da resina pode ser realizada antes da extracção. </li></ol></li><li> Binding Protein Purificação por Afinidade <ol><li> Adicionar 100-200 ul de ligado clarificado (Δ20 OD-40 600 unidades) para 50-100 ul de pérolas lavadas, e perfazer um volume total de 1 ml com tampão de lise. </li><li> Incubar com nutation ou balanço a 4 ° C por 2-5 horas. </li><li> Girar durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Se desejado, guardar uma amostra do sobrenadante para análise posterior remanescente de proteínas não ligadas. TCA precipitam como descrito acima para o WCE (passo 2.6). </li><li> Lavar a resina com proteínas ligadas 5x com 1 ml de tampão de lavagem, seguido por uma centrifugação durante 1 min a 5000 rpm a4 ° C. Manter as amostras frio durante as lavagens. </li></ol></li><li> A eluição das proteínas ligadas <ol><li> Adicionar 150 ul de tampão de eluição à resina, nutar a 4 ° C durante 5 min, centrifugação durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C e guardar o sobrenadante num novo tubo. OPCIONAL: Repita 2x e eluições piscina. </li><li> Prepare a amostra eluída por Western Blot: Para 25 mL de proteínas eluídas, adicionar 25 ul de dodecil-sulfato de lítio 2x (LDS) com tampão de amostra de 2 ul β-mercaptoetanol (BME) e incubar em ° C num bloco de aquecimento 100 por 2 min. Nota: O tampão de amostra de Laemmli 2X padrão também podem ser usadas. </li><li> Tire o excesso de proteína eluída congelamento em nitrogênio líquido. OPCIONAL: tiras restantes proteínas a partir da resina com um volume igual de 2x tampão de amostra de LDS a 65 ° C durante 5 minutos, remover as proteínas LDS-eluídas para um novo tubo, em seguida, adicionar 2 mL de BME para as proteínas eluídas, e não para a resina. Esta ordem é para impedir a remoção de quaisquer iões ou anticorpos que são Conjugated às pérolas. </li><li> Armazenar as amostras a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Western Blot e de sonda com anticorpos adequados para visualizar as proteínas. <ol><li> Carregar 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 unidades) de cada amostra e 3-10 uL de uma escada de proteína num gel de SDS-PAGE de escolha. Géis rotineiramente utilizados para este protocolo incluem 4-12% de Bis-Tris e 8% de Tris-Glicina. </li><li> Executar gel a 200 V durante 50 min. </li><li> Transferir as proteínas do gel para uma membrana de PVDF de transferência semi-seco, a 19 V durante 20-30 minutos (a receita na Tabela 1). </li><li> Bloco de membrana em 4% milk/1x tampão salino Tris-Tween (TBST), durante 1 hora à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C (a receita na Tabela 1). </li><li> Incubar a membrana com anticorpo primário à proteína marcadas com epítopo de interesse em 4% milk/1x TBST durante 1-3 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. </li><li> Lave membrana 3x por 5 minutos cada com TBST 1x. </li><li> Incubar a membrana com adequadaperoxidase de rábano secundário (HRP) conjugado anticorpo durante 1-3 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar membrana 3x durante 15 minutos cada uma em um grande volume de TBST 1x. </li><li> Cubra membrana com substrato ECL e embrulhe em papel filme. </li><li> Expor membrana para filmar e desenvolver a visualizar proteínas. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo centra-se na preparação de intacta, nativo, e as proteínas modificada após a tradução a partir de células de levedura de brotamento para aplicações a jusante. Antes de efectuar este protocolo, é crítico para determinar se a proteína de interesse pode ser facilmente detectado em extractos proteicos preparados sob condições de desnaturação 12. Se os anticorpos policlonais não estão disponíveis, pode ser vantajoso para epitopos marcação da proteína de interesse de modo a que a proteína de fusão po...

O incrível poder de fermento genética é lendária, mas a preparação e análise de proteínas nativas da levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae, é muitas vezes repleta de problemas. O último é devido ao considerável resistência mecânica e elasticidade da parede da célula de levedura 1. Diferentes meios têm sido descritos para a ruptura das células de levedura para obter extracto de proteína de célula inteira 2-6 enzimática, química, mecânica e baseada pressão. Estas técnicas variam muito na sua eficácia para produzir extractos de proteínas nativas de células representativas, que podem ser utilizados para análises posteriores ou de passos de purificação. Por exemplo, a parede celular de levedura podem ser removidas com enzimas líticas (por exemplo, Zymolyase) e esferoblastos resultantes podem ser rompidas por cisalhamento, detergentes, ou lise osmótica para libertar proteínas. Esta abordagem tem sido utilizada com sucesso como o ponto de partida para muitos fraccionamentos subcelulares mas requer longas incubaçõesque não são compatíveis com a estabilidade de algumas proteínas 7. Os reagentes de lise de levedura farmacêuticas (tais como detergentes) para a extracção química de proteínas de células de levedura estão disponíveis comercialmente, mas a eficácia destes reagentes na extracção da proteína e do seu efeito na subsequente caracterização bioquímica de proteínas não é sempre claro 8. Os homogeneizadores de alta pressão, muitas vezes referida como prensas Francesa, quebrar eficazmente células de levedura por primeiro submetendo-os a alta pressão e, em seguida, extrudindo-los através de uma pequena abertura de uma célula de pressão. Esta técnica produz extractos de elevada qualidade, mas o equipamento é muito caro e pode não ser adequado para pequenas quantidades de amostras de células ou múltiplos 9. Por conseguinte, a ruptura mecânica das células de levedura num moinho de esferas é frequentemente o método de escolha para a preparação de proteínas de levedura nativas 10. Esta técnica envolve a ruptura mecânica da parede celular da levedura com ácido-waverter esferas de vidro, que podem ser realizados com uma grande variedade de agitadores, moinhos de vortexers ou grânulo. Nomeadamente, este método pode ser usado para processar simultaneamente múltiplas amostras pequenas (1 ml de células ou menos). Muitas contas diferentes ou talão moinho matrizes rompimento já estão disponíveis comercialmente para interromper qualquer tipo de tipo de célula em tubos de 2 ml. Considerando as outras técnicas e equipamentos, um moinho de esferas tem a vantagem adicional de que a ruptura das células de levedura ocorre muito rapidamente, o que ajuda a preservar a modificações pós-translacionais, tais como sumoilação, especialmente quando são utilizados os tampões apropriados com protease e / ou inibidores de proteassoma e a temperatura é controlada de extractos. Este protocolo centra-se na extração rápida, eficaz e confiável de proteínas endógenas e sobre-expressos em condições suaves com o objetivo final de preservar a função da proteína, interações e modificações pós-traducionais. O meio de crescimento, tampão de lise celularAs composições e configurações de moinho de esferas são optimizados para manter as interacções proteicas e modificações pós-traducionais tais como sumoilação e ubiquitinação.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de levedura ORF em BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>cepa de levedura GAL+ que pode ser usada para indução e extração</td></tr><tr><td>pYES2.1 TOPO vector</td><td>Life Technologies</td><td>K4150-01</td><td>GAL+ cepa de levedura que pode ser usada para indução e extração; contém uma etiqueta V5/6xHIS</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail ( 100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>Tubo com Saia de 2.0 ml com Tampa de Rosca Amarrada</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3 Certifique-se de</td><td>que o tubo se encaixa corretamente no ruptor da conta</td></tr><tr><td>Contas de vidro, lavadas com ácido, 425-600 &micro; m (peneira de 30-40 EUA)</td>Filtros de tubo de centrífuga <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>Use para filtragem adicional de lisado clarificado</td></tr><tr><td>TALON Resina de afinidade de metal</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Para a purificação de proteínas marcadas com 6xHIS</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Para preparar e/ou eluir amostras antes de SDS-PAGE e Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>Géis pré-moldados frequentemente usados para SDS-PAGE antes de Western Blotting</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>Mancha de gel de proteína</td></tr><tr><td>Tampão de lise de mamíferos</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>Tampão de lise comercial alternativo</td></tr><tr><td>Anti-V5 agarose</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>Método de imunoprecipitação</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS géis</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-myc</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo secundário</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>PAb de cabra para IgG de camundongo (HRP)</td></tr></tbody></table>

brotando yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogeneização por espancamento talão é uma maneira rápida e eficiente para liberar DNA, RNA, proteínas e metabólitos de células de levedura de brotamento, que são notoriamente difíceis de romper. Aqui descrevemos o uso de um homogeneizador de moinho de esferas para a extracção de proteínas nos buffers optimizados para manter as funções, interações e modificações pós-traducionais das proteínas. As células em crescimento logarítmica que expressam a proteína de interesse é cultivada num meio de crescimento líquido de escolha. Os meios de cultura podem ser suplementados com os reagentes para induzir a expressão de proteína a partir de promotores inductíveis (por exemplo galactose), sincronizar estágio do ciclo celular (por exemplo, nocodazol), ou inibir a função do proteassoma (por exemplo, MG132). As células são então sedimentadas e ressuspensas num tampão adequado contendo a protease e / ou inibidores de fosfatase e seja processado imediatamente ou congelado em azoto líquido para posterior utilização. A homogeneização é realizada por seis ciclos de 20 seg bead-batimento (5,5 m / seg), cada um seguido por um minuto de incubação sobre gelo. O homogenato resultante foi clarificado por centrifugação e as pequenas partículas podem ser removidas por filtração. O extracto celular total foi afastada resultante (WCE) é precipitado utilizando 20% de TCA para análise directa de proteínas totais por SDS-PAGE seguido por Western blotting. Os extractos são também adequados para a purificação por afinidade de proteínas específicas, a detecção de modificações pós-tradução, ou a análise de proteínas de co-purificação. Como é o caso para a maioria dos protocolos de purificação de proteínas, algumas enzimas e proteínas podem exigir condições únicas ou composições de tampão para a sua purificação, e outros podem ser instáveis ​​ou insolúveis sob as condições indicadas. Neste último caso, o protocolo apresentado pode proporcionar um ponto de partida útil para determinar empiricamente a melhor estratégia talão batimento para a extracção e purificação de proteínas. Mostramos a extração e purificação de um epitopo-marcado SUMO E3 ligase, Siz1, um ciclo celularregulada proteína que se torna tanto sumoylated e fosforilada, bem como uma subunidade de ubiquitina ligase SUMO-alvo, Slx5.

Os resultados representativos revelam que o protocolo de extracção de grânulo proteína-batimento e descrita é útil para a preparação de proteínas reprodutíveis para uma variedade de aplicações a jusante (resumidos na Tabela 2). SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie de WCEs mostrar que uma grande variedade de proteínas (12 a&gt; ~ 250 kDa) podem ser reprodutivelmente extraído de células de levedura (Figura 1A). Bandas discretas ao longo de um intervalo de pesos moleculares são ind...

A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

O objetivo geral deste procedimento é extrair proteínas de levedura preservando as interações nativas de estrutura, função e modificações pós-traducionais. Isso é realizado primeiramente cultivando as células para induzir a expressão da proteína de interesse. Em seguida, as células de levedura colhidas são homogeneizadas em um tampão apropriado para extrair as proteínas.Em seguida, as proteínas de interesse são purificadas do extrato celular clarificado utilizando uma resina de afinidade. A etapa final do procedimento consiste em eluir as proteínas purificadas da resina de afinidade para análises posteriores ou aplicações downstream. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram modificações e interações da purificação proteica com base na análise por western blot.Quem demonstrará o procedimento será Eva Ky, formada pela William and Mary, que passou os últimos anos como pesquisadora de graduação no meu laboratório. A principal vantagem da técnica de peletização em comparação com outros métodos existentes é o processamento rápido e a lise de múltiplas amostras em condições que preservam as interações funcionais das proteínas e as modificações pós-traducionais. Para começar, t

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Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em...

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Contaminação de preparações dos ribossomos eucarióticos purificado por métodos tradicionais de co purificação de proteases e nucleases negativamente impactos sobre a jusante análises bioquímicas e estruturais. Um método de purificação cromatográfica rápida e simples é usado para resolver esse problema usando os ribossomos de levedura como um sistema modelo.

Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active

Utilizando microarrays de proteína que contêm quase toda a S. cerevisiae proteoma é sondado para um rápido interrogatório imparcial de milhares de interações proteína-proteína em paralelo. Este método pode ser utilizado para a molécula de proteína-pequena, a modificação pós-traducional, e outros ensaios in high-throughput.

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Este artigo descreve um ensaio baseado no crescimento de leveduras para a determinação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas. Ele também demonstra um método para extração rápida de proteínas de levedura, adequado para western blotting para confirmar bioquimicamente os requisitos de degradação. Essas técnicas podem ser adaptadas para monitorar a degradação de uma variedade de proteínas.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Aqui nós apresentamos um protocolo para expressar, solubilizar e purificar vários transportadores de borato eucarióticas com homologia à família de transportador de SLC4 usando o fermento. Também descrevemos um ensaio químico do cross-linking para avaliar as proteínas homomeric purificado para assembly multiméricas. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas de membrana desafiador.

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para a expressão, purificação e ligação liposoma de heterodimers SNX-BAR em levedura.

Expressão, purificação e ligação lipossoma dos heterodimers brotamentos do SNX-BAR do fermento

Descrevemos um método confiável para a preparação de extratos celulares inteiros de leveduras ou outras células usando uma fábrica de congelador criogênico que minimiza a degradação e a desnaturação de proteínas. Os extratos celulares são adequados para purificação de complexos proteicos funcionais, análises proteômicas, estudos de co-imunoprecipitação e detecção de modificações de proteína labile.

Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.

Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Aprenda a extrair e purificar proteínas de levedura preservando estruturas nativas, interações e modificações pós-traducionais. Este método utiliza homogeneização e cromatografia de afinidade para análises bioquímicas.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

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