Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

O objetivo geral deste procedimento é extrair proteínas de levedura preservando as interações nativas de estrutura, função e modificações pós-traducionais. Isso é realizado primeiramente cultivando as células para induzir a expressão da proteína de interesse. Em seguida, as células de levedura colhidas são homogeneizadas em um tampão apropriado para extrair as proteínas.

Em seguida, as proteínas de interesse são purificadas do extrato celular clarificado utilizando uma resina de afinidade. A etapa final do procedimento consiste em eluir as proteínas purificadas da resina de afinidade para análises posteriores ou aplicações downstream. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram modificações e interações da purificação proteica com base na análise por western blot.

Quem demonstrará o procedimento será Eva Ky, formada pela William and Mary, que passou os últimos anos como pesquisadora de graduação no meu laboratório. A principal vantagem da técnica de peletização em comparação com outros métodos existentes é o processamento rápido e a lise de múltiplas amostras em condições que preservam as interações funcionais das proteínas e as modificações pós-traducionais. Para começar, transforme células de uma linhagem de levedura gal positiva com um plasmídeo que codifique uma proteína de escolha com marcação hexa-histidina indutível por galactose, inocular os transformantes em cinco mililitros de meio seletivo apropriado, como SD uracila, contendo 2% de sacarose, e incubar a 30 graus Celsius durante a noite com agitação. No dia seguinte, dilua a cultura noturna em meio seletivo com 2% de sacarose até um volume final de 33 mililitros, de modo que a densidade óptica a 600 nanômetros seja 0,3, e cultive em incubadora com agitação a 30 graus Celsius e 150 RPM.

Quando a cultura atingir uma OD 600 entre 0,8 e 1,5, induza a expressão da proteína desejada adicionando 17 mililitros de três XYEP com 6% de galactose, obtendo uma concentração final de um XYEP com 2% de galactose, e coloque em um incubador com agitação a 30 graus Celsius por mais cinco a seis horas. Após medir a OD 600 da cultura induzida, centrifugue cerca de 150 a 200 unidades de OD 600 de células por cinco minutos a 5.000 RPM e 4 graus Celsius; em seguida, use um mililitro de um XPBS gelado com um coquetel de inibidores de protease 1x para ressuspender o pellet celular e transfira-o para um tubo de rosca de dois mililitros. Centrifugue as células por um minuto a 15.000 RPM e 4 graus Celsius. Após a remoção do sobrenadante, congele rapidamente o pellet celular em nitrogênio líquido até que o pellet celular congele completamente.

Adicione 200 microlitros de esferas de vidro lavadas com ácido e 500 microlitros de tampão de lise gelado. Mantenha os tubos sempre sobre gelo. Utilize uma ponteira com a extremidade cortada para pipetar brevemente para cima e para baixo a quatro graus Celsius.

Coloque os tubos com as células no bloqueio de equilíbrio do moinho de esferas e execute a máquina conforme as instruções do fabricante por 20 segundos a 5,5 metros por segundo. Em seguida, coloque os tubos sobre gelo picado por um minuto. Repita o processo seis vezes no total para clarificar as proteínas extraídas. Centrifugue por 15 minutos a 15.000 RPM a quatro graus Celsius.

Em seguida, para preparar uma amostra do extrato de células inteiras ou WCE para western blot, use WCE correspondente a duas unidades de OD 600 de células e adicione a 800 microlitros de ácido tricloroacético a 20% ou TCA; vortexe para homogeneizar. Para purificar uma amostra de WCE clarificado, adicione 50 a 100 microlitros de resina de afinidade a um novo tubo de microcentrífuga; lave e equilibre a resina adicionando um mililitro de tampão de lavagem e inverta o tubo de cima para baixo até que a resina seja ressuspendida. Após centrifugar por um minuto a 5.000 RPM e quatro graus Celsius, aspire o sobrenadante. Para ligar a proteína na purificação por afinidade, adicione 100 a 200 microlitros de lisado clarificado às esferas lavadas e use o tampão de lise para ajustar o volume final a um mililitro.

Incube com mutação ou em agitação rotativa a quatro graus Celsius por duas a cinco horas. Utilize nitrogênio líquido para congelar rapidamente alíquotas do sobrenadante claro de WCE restante e armazene a menos 80 graus Celsius até uso posterior, enquanto a solução de beterraba do lisado estiver incubando na gelo para a amostra de Western blot de WCE. Após centrifugar por dois minutos e meio a 15.000 RPM a quatro graus Celsius, decante o sobrenadante tomando cuidado para manter o pellet, adicione 800 microlitros de TCA 2% ao pellet e vortexe o tubo antes de repetir a centrifugação de dois minutos e meio.

Após decantar cuidadosamente o sobrenadante, adicione 100 microlitros de tampão de amostra TCA e vortexie para dissolver o precipitado antes de incubar a amostra. Em um bloco de aquecimento a 100 graus Celsius por dois a cinco minutos para uma segunda vez dissolver completamente quaisquer resíduos do precipitado, o que pode ser difícil de dissolver, e armazene a -80 graus Celsius até o momento de uso. Uma vez que a amostra de lisado em esferas é incubada, após centrifugação a 5.000 RPM e 4 graus Celsius por um minuto, utilize o tampão de lavagem para lavar a resina cinco vezes para eluir as proteínas.

Adicione 150 microlitros de tampão de eluição à resina e incube a quatro graus Celsius por cinco minutos. Centrifugue por um minuto a 5.000 RPM e quatro graus Celsius e recolha o sobrenadante em um novo tubo. Por fim, para preparar uma amostra para western blot, adicione 25 microlitros de tampão amostral de lauril sulfato de lítio 2x com dois microlitros de BME a 25 microlitros da amostra proteica UD.

Como mostrado nesta figura, uma ampla variedade de proteínas pode ser extraída de forma reprodutível de células de levedura. Bandas discretas ao longo de uma faixa de pesos moleculares indicam extratos proteicos de alta qualidade. A qualidade dos extratos pode ser confirmada por meio de western blot para proteínas marcadas com epítopos específicos.

Aqui temos um resultado representativo da galactose com superexpressão da ligase Sumo marcada com o marcador V cinco, que migra em aproximadamente 120 quilodaltons. Geralmente, proteínas parcialmente degradadas se deslocam como múltiplos fragmentos abaixo do peso esperado, mas neste caso observa-se apenas a proteína de comprimento completo. Além disso, agregados de alto peso molecular de uma determinada proteína podem indicar modificações pós-traducionais.

Por exemplo, aqui você pode ver a lactose superexpressa relacionada ao SUMO S um delta quatro 40 e SIS um de comprimento completo. Como demonstrado neste Western blot, modificações também podem ser preservadas em S um expresso endogenamente. Esta figura mostra que duas proteínas enriquecidas no núcleo, SLX cinco e CS um delta quatro 40, foram purificadas com sucesso a partir do nosso ws.

Notavelmente, uma proteína com marcação de seis histidinas pode ser purificada por afinidade a partir de W'S, tanto em condições nativas quanto desnaturantes. Em contraste, SLX 5G ST e CS um delta quatro 40 ha não possuem um epítopo de seis histidinas, mas, em condições nativas, ainda interagem com a resina de afinidade metálica de maneira sensível ao OLÉ. Propomos que CIS um, e em menor grau SLX cinco, sejam capazes de ligar a resina de afinidade metálica por meio de seu domínio em forma de anel que coordena metais.

Embora, até onde sabemos, esse fenômeno específico ainda não tenha sido relatado, uma situação semelhante foi descrita, na qual a subunidade B da toxina colérica se liga a uma resina de afinidade Nicola de maneira mediada por seus resíduos naturais de histidina. Essa observação sugere que as proteínas no extrato de células inteiras estão, pelo menos em parte, corretamente dobradas para o estudo da função proteica. É importante demonstrar que os complexos proteicos permanecem intactos nos extratos de células inteiras.

Dados representativos revelaram que CS um delta quatro 40, SLX cinco e P GK um a, uma proteína citosólica que serve como controle de carregamento, estavam presentes em WS cis um. O delta quatro 40 foi purificado a partir desses extratos com base em sua capacidade inerente de se ligar a resinas de afinidade metálica. Além disso, quando SLX cinco e SIS um foram coexpressos em células de levedura, os níveis de SLX cinco nos EITs aumentaram, levantando a possibilidade de que SLX cinco possa interagir com SIS um.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar e processar células de levedura para extrair, purificar e visualizar proteínas de levedura em condições nativas.