Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

O objetivo geral deste procedimento é detectar a simulação e ubiquitinação de proteínas do núcleo cinético de levedura em brotamento, NDC 10 e NDC 80. Isso é feito primeiro colhendo células de levedura que expressam a bandeira de chiado marcada com SMT três e MT marcada com NDC 10 ou NDC 80, e fazendo extratos de proteína dessas células. O segundo passo é purificar os três conjugados SMT marcados com bandeira de chiado para a detecção de soma ou imunoprecipitar proteínas de núcleo cinético mik tagg para a detecção de ubiquitinação.

Posteriormente, a soma ou ubiquitinação é detectada pela análise de western blot. Em última análise, a presença de um padrão de escada para NDC 10 e NDC 80 confirma que essas proteínas são simuladas e ubiquitinadas. O método de purificação de proteínas descrito permite a detecção de simulação e ubiquitinação das proteínas connico ND C 10 e NDC 80 na levedura sacro de brotamento.

Meu cci. A principal vantagem desta técnica é que a cepa que criamos tem dois ataques de epítopos, um na proteína de teste e outro que permite a detecção de simulação. O uso dessas marcas reduz o fundo devido à reatividade cruzada que é freqüentemente observada quando o soro policlonal é usado.

A demonstração deste procedimento será feita por Canero Uni, um pesquisador do meu laboratório. As proteínas de interesse serão extraídas de pellets de células de levedura preparados previamente e armazenados a menos 20 graus Celsius. Resus, suspenda as células em 0,5 mililitros de tampão gelado.

Use tampão guine se o extrato for para um ensaio pull-down usando níquel nitrilo, ácido triacético ou grânulos de superfluxo de níquel NTA. Utilizar tampão A se o extracto for para imunoprecipitação. Mantenha os tubos no gelo o tempo todo.

Transfira as suspensões celulares para dois mililitros. Tampa de rosca dois para cada tubo. Adicione um volume de contas de vidro igual ao volume da conta de suspensão da célula.

Bata as células em um mini batedor de esferas por dois minutos em temperatura ambiente e depois coloque os tubos no gelo por dois a três minutos. Repita a batida e a cobertura três vezes. Vórtice em alta velocidade a quatro graus Celsius por 30 a 60 minutos.

Verifique as células por visualização ao microscópio para garantir que as células sejam lisadas. As células lisadas aparecerão como fantasmas escuros e não terão um limite ou forma definida. Idealmente, pelo menos 80% das células devem ser mentidas.

Em seguida, use um alfinete para fazer um furo na parte inferior do tubo. Coloque a tampa de rosca frouxamente e coloque o tubo em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue a 1000 vezes G por um minuto.

Para coletar o lisado, transfira o lisado para uma centrífuga de tubo de microcentrífuga a 15.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius para coletar as proteínas extraídas. Depois de medir a concentração das proteínas extraídas usando um kit de ensaio de proteína, normalize todos os extratos para que cada um contenha a mesma quantidade de proteína. Traga o volume total para um mililitro com o tampão apropriado.

Aproximadamente cinco miligramas de proteína total são obtidos de 50 OD 600 de células. Economize 50 microlitros da proteína extraída como extrato de célula inteira. Os 950 microlitros restantes de extrato proteico serão usados posteriormente para purificação de proteínas ou imunoprecipitação de proteínas marcadas com MT.

Adicione 50 microlitros de tampão de amostra de dois x laly aos 50 microlitros de extrato de células inteiras. Incube as amostras a 100 graus Celsius em um bloco de calor por três a cinco minutos antes de analisá-las por western blot. Comece este procedimento preparando os grânulos de superfluxo NTA de níquel necessários para a purificação.

Obtenha a quantidade de grânulos necessária para centrifugação de baixa velocidade por um minuto. Remova o sobrenadante e lave as esferas com PBS. Adicione um mililitro de PBS e inverta o tubo de cima para baixo até que as contas sejam ressuspensas.

Colete grânulos por centrifugação de baixa velocidade e remova o sobrenadante. Lave as contas dessa maneira um total de cinco vezes. Suspender os grânulos num mililitro de tampão guinéu e alíquota no número de tubos correspondente às amostras a processar.

Recolha os grânulos por centrifugação a baixa velocidade e retire o sobrenadante de cada amostra. Adicione 950 microlitros do extrato de células inteiras. Preparado anteriormente para 100 microlitros das contas.

Incube em uma plataforma de balanço a quatro graus Celsius por pelo menos quatro horas ou durante a noite. Centrifugue a 800 a 1500 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius. Economize 50 microlitros do sobrenadante.

Adicione 50 microlitros de tampão de amostra de dois x laly a este sobrenadante e incube a 100 graus Celsius em um bloco de calor por três a cinco minutos. 10 microlitros de cada amostra serão posteriormente analisados por western blot. Lave as contas de superfluxo NTA de níquel uma vez com um mililitro de tampão guine por cinco a 10 minutos em uma plataforma de balanço em temperatura ambiente.

Em seguida, lave as contas cinco vezes com um mililitro de tampão de quebra após a lavagem final com tampão de quebra ressuspenda os grânulos em 90 microlitros de tampão de amostra de dois x laly. Adicione 10 microlitros de um molar para ajudar a dissociar a proteína marcada com his do NT de níquel. As contas incubam a 100 graus Celsius em um bloco de calor por três a cinco minutos. O vórtice centrifuga então a 13.000 vezes G por 30 segundos.

Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Para iniciar este procedimento, obtenha a quantidade necessária de anticorpo de gel de afinidade aero cmic por centrifugação de baixa velocidade. Remova o sobrenadante, lave a resina com tampão A Adicione um mililitro de tampão A e inverta de cima para baixo até que a resina seja ressuspensa.

Colete a resina por centrifugação de baixa velocidade e remova o sobrenadante. Lave um total de cinco vezes. Suspender a resina em um mililitro de tampão A e alíquota no número de tubos correspondentes às amostras a processar.

Colete a resina por centrifugação de baixa velocidade e remova o sobrenadante. Adicione 950 microlitros de extrato de células inteiras a 25 microlitros de resina Incube em uma plataforma de balanço a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Centrifugue a 800 a 1500 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius.

Economize 50 microlitros do sobrenadante. Adicione 50 microlitros de tampão de amostra de dois x lam a este sobrenadante e incube a 100 graus Celsius em um bloco de calor por três a cinco minutos. Lave a resina com tampão e adicione um mililitro de tampão, inverta de cima para baixo até que a resina seja ressuspensa.

Recolha a resina por centrifugação a baixa velocidade e retire o sobrenadante após a remoção do sobrenadante da lavagem final. Ressuspenda a resina em 100 microlitros de tampão de amostra e incube a 100 graus Celsius em um bloco de calor por três a cinco minutos. O vórtice centrifuga então a 13.000 vezes G por 30 segundos.

Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Por fim, carregue todas as amostras coletadas deste protocolo. Em uma página SDS, gel para análise de Western blot, cepas de levedura que expressam poli-histamina marcadas com bandeira SMT três ou HF SMT três e MT marcadas com NDC 80 e NDC 10 foram usadas para detectar a simulação de proteínas cinéticas.

HF SMT três substratos foram purificados por afinidade usando esferas de níquel e detectados com um anticorpo Anti-Flag. O NDC 80 com fosso total foi detectado no HF SMT em três substratos quando sondado com um anticorpo anti-mic. A ausência de proteínas modificadas nas cepas controle sem HF SMT três indica a especificidade da interação entre HF SMT três e suas proteínas-alvo.

Além disso, a soma de NDC 80 e NDC 10 é reduzida em células tratadas com NOCO para detectar a ubiquitinação de NDC 80 e NDC 10. ND C 80 ou ND C 10 marcado com Mick foi imunoprecipitado e a análise de western blot foi realizada com anticorpos anti-mic e anti-ubiquitina, a análise do extrato de células inteiras e sobrenadante confirmou a expressão de NDC 80 M e NDC 10 M, amostras imunoprecipitadas sondadas com anti MIC mostraram várias bandas de alto peso molecular, sugerindo que NDC 80 e NDC 10 contêm modificações pós-traducionais. Um padrão de escada de amostras imunoprecipitadas sondadas com antiubiquitina mostrou que ND C 80 e ND C 10 são ubiquitinados.

Os padrões de escada de NDC 80 e NDC 10 foram aprimorados pelo tratamento com um inibidor de proteassoma MG 1 32. Confirmando ainda mais que estes representam poliubiquitinação Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da técnica de purificação de proteínas que permite a detecção de mação e vacinação de NN de morcego.