Name: Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprenda a purificar proteínas Ndc10 e Ndc80 de Saccharomyces cerevisiae para detectar sumoilação e ubiquitinação por western blot. Este método revela modificações pós-traducionais essenciais na regulação do cinetocoro.

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Agradecemos ao Dr. Oliver Kerscher pelo apoio e aconselhamento e aos membros do laboratório Basrai por seu apoio e comentários sobre o artigo. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do National Institutes of Health.

1. Crescimento de Células de Levedura <ol><li> Inoculação das células de levedura em 30 ml de YPD (Tabela 1) em um balão pequeno. Incubar a 30 ° C durante a noite com agitação. </li><li> Dilui-se as células até uma densidade óptica de 0,2 a 600 nm (DO 600 = 0,2) em 50 ml de meio YPD e incubar a 30 ° C com agitação. </li><li> Crescer a cultura a uma densidade óptica de 1,0 a 600 nm (DO600 = 1,0). </li><li> Centrifugar células durante 5 min a 2000 xg e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 40 ml de água estéril e centrifugar durante 5 minutos a 2000 x g para lavar as células. Descartar o sobrenadante e o sedimento de células armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Extracção de proteínas <ol><li> Ressuspender as células em 0,5 ml de tampão de guanidina arrefecido em gelo (Tabela 1) para o ensaio suspenso usando pérolas de Ni-NTA Superflow ou tampão A (Tabela 1) para imunoprecipitação. Manter tubos em gelo em todos os momentos. </li><li> Transferir a 2 ml tubo de tampa de rosca. </li><li> Adicionar o mesmo volume de esferas de vidro (Tabela de Materiais). </li><li> Conta-bater as células de uma mini-grânulo batedor (tabela de materiais) durante 2 min à temperatura ambiente, depois colocar sobre gelo durante 2-3 minutos. Repita isso três vezes. </li><li> Vortex em alta velocidade, a 4 ° C durante 30-60 min. Verificar as células por visualização sob o microscópio para garantir que as células são lisadas. Nota: As células lisadas aparece como fantasmas escuros e não têm um limite ou uma forma definida. Optimamente, pelo menos, 80% das células devem ser lisadas. </li><li> Perfurar um buraco no fundo do tubo usando um pino do impulso e coloque em uma coleção 15 ml tubo cônico (tampa de rosca deve ser solto). </li><li> Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para recolher o lisado. </li><li> Transferir o lisado para um tubo de micro centrífuga. </li><li> Centrifugar a 15.000 xg durante 30 min a 4 ° C para recolher as proteínas extraídas. </li><li> Medir a concentração das proteínas extraídas utilizando a proteína assay kit (Tabela de Materiais) e normalizar todos os extractos de conter a mesma quantidade de proteína. Levar o volume total a 1 ml com tampão apropriado. Nota: Cerca de 5 mg de proteína total é obtida a partir de 50 OD600 células. </li><li> Guardar a 50 ul (250 ug de proteína, se a proteína total extraído a partir do passo 5 é 2,10 mg) como extracto celular total (WCE). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x (Tabela 1) e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot). </li></ol> 3. Purificação de HF-Smt3 Conjugados <ol><li> Obter os grânulos Superflow Ni-NTA (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (100 ul de contas por amostra) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg) durante 1 min. Remover o sobrenadante. </li><li> Grânulos lavagem 5x com 1 ml de PBS (Tabela de Materiais): Inverter top-sobre-inferior até que as contas são novamente suspensas, coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. </li><li> Suspender pérolas em 1 ml de tampão de guanidina (Tabela 1) e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. Misture as contas bem invertendo top-over inferior. Nota: Misture bem grânulos invertendo top-over inferior. </li><li> Para cada amostra, adicionar 950 ul de WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 100 ul de contas de Ni-NTA Superflow. </li><li> Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante pelo menos 4 horas ou durante a noite. </li><li> Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Anal Western blotysis). </li><li> Lavar as pérolas uma vez com 1 ml de tampão de guanidina durante 5-10 min sobre uma plataforma oscilante. </li><li> Lavar as pérolas de 5x com 1 ml de tampão de Rebentamento (Tabela 1) durante 5-10 minutos numa plataforma de agitação. </li><li> Grânulos Ressuspender em 90 ul de tampão de amostra Laemmli 2x. </li><li> Adicionar 10 ul de 1 M de imidazol. Nota: Imidazole ajuda para dissociar a proteína marcada com His a partir das pérolas de Ni-NTA, devido à interacção entre a competir imidazole e os grânulos. </li><li> Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. </li><li> Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco. </li><li> Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot). Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado. </li></ol> 4. Immunoprecipitation de Myc-marcados kinetochore Proteínas <ol><li> Obter anti-c-Myc de afinidade em gel de agarose umtibody (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (25 ul de resina por exemplo) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg). Remover o sobrenadante. </li><li> Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. </li><li> Suspender a resina em 1 ml de tampão A e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Recolha resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. Nota: Misture a resina bem invertendo-bottom top-over. </li><li> Adicionar 950 ul da WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 25 ul de resina. </li><li> Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante a noite. </li><li> Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Load 10 uL de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot). </li><li> Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender a resina em 100 ul de tampão de amostra SUMEB (Tabela 1). Nota: tampão de amostra contém SUMEB Ureia 8 M e 1% de SDS (forte condição de desnaturação). </li><li> Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. </li><li> Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco. </li><li> Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot). Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado. </li></ol> 5. Análise de mancha Ocidental <ol><li> Coloque os extratos de proteínas em 4-12% Bis-Tris géis (Tabela de Materiais) e perfeletroforese orm a 120 V durante 90 minutos (tampão corrente: Tabela de Materiais). </li><li> Transferir as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose (Tabela de Materiais) usando um aparelho de transferência a 30 V durante 90 min (tampão de transferência: Tabela de Materiais). </li><li> Bloquear a membrana em 5% leite / TBST 1x (Tabela 1) durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Incubar membrana com anticorpo primário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos primários, usar uma diluição de 1: 1000 (os anticorpos anti-FLAG e anti-Ub) ou 1: 5000 (anticorpo anti-Myc). </li><li> Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x. </li><li> Incubar membrana com anticorpo secundário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante 1 hora à temperatura ambiente. Usar uma diluição de 1: 5000 de anticorpos secundários. </li><li> Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x. </li><li> Incubar membrana com ECL workisolução ng (Tabela de Materiais) durante 5 min. </li><li> Expor a membrana sensível ao azul filme X-Ray (Tabela de Materiais) e desenvolver usando um desenvolvedor automático (Tabela de Materiais). </li></ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
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<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
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<li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+assembly%3A+if+you+build+it%2C+they+will+come%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Marcadores de epitopo HA, tais como, Myc, Bandeira, e GST são amplamente utilizados para análise bioquímica de proteínas. Construção de estirpes com IC-Smt3 e proteínas cinetócoro Myc-tag, como Ndc10 e Ndc80, facilita a detecção de PTMs como sumoilação e ubiquitinação. HF-Smt3 puxar para baixo ensaio permite a detecção de proteínas cinetócoro sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). O protocolo de purificação por afinidade e análise Western blot utilizando anticorpo anti-Flag estabelecer a especificidade d...

Ubiquitinação e sumoilação permitir a conjugação de ubiquitina e modificador pequeno Ubiquitina-like (SUMO; Smt3 em S. cerevisiae 1) para uma proteína-alvo, respectivamente. PTMs de proteínas cinetócoro afectar os níveis celulares e interacções proteína-proteína durante as diferentes fases do ciclo celular para assegurar a segregação cromossómica fiel. Por exemplo, os níveis celulares de Cse4 / CENP-A e proteína cinetócoro exterior Dsn1 são regulados através de proteólise mediada por ubiquitina para assegurar a estabilidade do genoma 2-5. A desestabilização das ligações cinetócoro-microtúbulo incorrectas requer a IPL1 / Aurora B-quinase, que fosforila e Dam1 Ndc80 complexos que interagem directamente com os microtúbulos 6-8. Apesar da identificação de mais de setenta proteínas cinetócoro, há muito poucos estudos que investigam as modificações dessas proteínas com PTMs, por exemplo, ubiquitina e SUMO. Uma limitação importante é a capacidade de preservar a PTMs durante a purificação e a escassez de anticorpos para a detecção de mercadorias, tais como PTMs sumoilação, fosforilação, metilação, e outros. Caracterização de proteínas cinetócoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizou um anticorpo costume 9. Além disso, Ndc10 tem sido implicado como um substrato para ubiquitinação 10. Hec1 Humano (Ndc80 em S. cerevisiae) é também substrato para ubiquitinação, regulamentada pelo APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Portanto, Ndc10 e Ndc80 são bons candidatos para otimização do protocolo para detectar tanto sumoylation e ubiquitination em S. cerevisiae. Para facilitar a identificação de sumoilação, construiu-se as estirpes que expressam HF-Smt3 e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80. O uso de marcadores de epitopo (HF: His6-Flag) minimiza o fundo devido à reatividade cruzada que é frequentemente observada no soro policlonal criado contra uma proteína candidato. Eu inventei um protocolo de afinidadepurificar conjugados HF-Smt3 e, em seguida, utilizado anti-Flag comercial e anticorpos anti-myc para detectar a presença de sumolyated Ndc10 e Ndc80 na preparação Smt3 purificado. Para ubiquitination, eu inventei um protocolo de imunoprecipitação modificado que preserva ubiquitinação das proteínas cinetócoro Myc marcadas e realizadas análises de Western blot com o anticorpo anti-Ub comercial para detectar ubiquitination de Ndc10 e Ndc80.

<table><tbody><tr><td>Contas de vidro</td><td>Produtos BioSpec</td><td>11079105</td> Mini batedor de contas de <td>0,5 mm de diâmetro</td></tr><tr><td></td><td>Produtos BioSpec</td>#<td>693</td><td>Disruptor de 8 células</td></tr><tr><td>Ni-NTA superfluxo</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc gel de afinidade de agarose antbody produzido em coelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>de anticorpo monoclonal anti-Flag M2 produzido em camundongo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Anticorpo primário, diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>anticorpo c-Myc (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Anticorpo primário, diluição 1:5.000</td></tr><tr><td>Anticorpo de camundongo purificado monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Anticorpo primário, diluição 1:5.000</td></tr><tr><td>Ubiquitina (P4G7) anticorpo monoclonal</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Anticorpo primário, diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, Ab inteiro ligado a HRP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Anticorpo secundário, diluição 1:5.000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, Ab inteiro ligado a HRP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Anticorpo secundário, diluição 1:5.000</td></tr><tr><td>Ensaio de proteína DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0,45 mm tamanho de poro</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Géis de Proteína</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1,0 mm, 10 poços</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato Quimioluminescente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Filme de raio-X sensível a azul</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Revelador automático</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

técnica de purificação de proteína que permite a detecção de sumoilação e ubiquitination de brotamento yeast kinetochore proteínas ndc10 e ndc80

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

As modificações pós-traducionais (PTMs), tais como fosforilação, metilação, acetilação, ubiquitinação, e sumoilação, regular a função de muitas proteínas celulares. PTMs de proteínas cinetócoro que se associam com DNA centromeric mediar segregação cromossômica fiéis para manter a estabilidade do genoma. Abordagens bioquímicas, tais como espectrometria de massa e análise de transferência de western são mais comumente utilizado para a identificação de PTMs. Aqui, um método de purificação de proteínas está descrito que permite a detecção de ambos sumoilação e ubiquitinação das proteínas cinetocoro, Ndc10 Ndc80, e em Saccharomyces cerevisiae. Uma estirpe que expressa polihistidina-Flag-etiquetado Smt3 (HF-Smt3) e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80 foi construída e utilizada para os nossos estudos. Para a detecção de sumoylation, eu inventei um protocolo para purificar por afinidade proteínas sumoylated His-tag usando esferas de níquel e usado western blot com anti-Myc anticorpo para detectar sumoylated Ndc10 umnd Ndc80. Para a detecção de ubiquitinação, que concebido um protocolo para a imunoprecipitação das proteínas Myc-tag e utilizada a análise de Western blot com um anticorpo anti-Ub para mostrar que Ndc10 e Ndc80 são ubiquitinadas. Os nossos resultados mostram que o epitopo marcado com proteína de interesse na sua bandeira-tagged Smt3 estirpe facilita a detecção de vários PTMs. Estudos futuros deverão permitir a exploração desta técnica para identificar e caracterizar as interações proteína que são dependentes de um PTM específico.

Para detectar sumoilação de proteínas cinetócoro Ndc80 e Ndc10, estirpes com HF-Smt3 e proteínas cinetócoro marcada com myc (Ndc80 ou Ndc10) foram calculados (Tabela 2), como anteriormente descrito 9,12. HF-Smt3 conjugados foram purificados por afinidade utilizando esferas de Ni-NTA. A análise de Western blot de HF purificado-Smt3 com um anticorpo anti-Flag permitiu a detecção de formas sumoylated de substratos SUMO que estavam ausentes na estirpe de controlo, sem HF-Smt3 (Figura 1A</...

Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar a simulação e a ubiquitinação das proteínas do núcleo cinético de levedura brotante, NDC 10 e NDC 80. Isso é realizado primeiramente colhendo células de levedura que expressam SMT três marcado com hiss flag e NDC 10 ou NDC 80 marcado com MT, e produzindo extratos proteicos a partir dessas células. O segundo passo é purificar os conjugados de SMT três marcado com hiss flag para a detecção de sumoilação ou imunoprecipitar as proteínas do núcleo cinético marcadas com mik tag para a detecção de ubiquitinação.Posteriormente, a sumoilação ou ubiquitinação é detectada por análise de western blot. Em última instância, a presença de um padrão escalonado para NDC10 e NDC80 confirma que essas proteínas estão sumoiladas e ubiquitinadas. O método de purificação de proteínas descrito permite a detecção tanto da sumoilação quanto da ubiquitinação das proteínas connicas NDC10 e NDC80 na levedura em brotamento sacro.Meu cci. A principal vantagem desta técnica é que a linhagem que criamos possui dois epitopos marcados, um no proteína de teste e outro que permite a detecção da simulação. O uso dessas marcas reduz o fundo devido à reatividade cruzada, frequentemente observado quando soros policlonais são utilizados.A demonstração deste procedimento será realizada por Canero Uni, pesquisador associado em meu laboratório. As proteínas de interesse serão extraídas de pellets de células de levedura preparados previamente e armazenados a menos 20 graus Celsius. Resuspenda as células em 0,5 mililitros de tampão gelado.Use o tampão guine se o extrato for destinado a um ensaio de precipitação com níquel nitrilo, ácido triacético ou perlas de níquel NTA superflow. Use o tampão A se o extrato for destinado à imunoprecipitação. Mantenha os tubos sempre no gelo.Transfira as suspensões celulares para dois mililitros. Parafuse as tampas em cada tubo. Adicione um volume de esferas de vidro igual ao volume da suspensão celular.Bata as células em um homogeneizador de pequeno porte com esferas por dois minutos à temperatura ambiente e, em seguida, coloque os tubos em gelo por dois a três minutos. Repita a homogeneização com esferas e o resfriamento em gelo três vezes. Vortexe em alta velocidade a quatro graus Celsius por 30 a 60 minutos.Verifique as células por meio da visualização ao microscópio para garantir que as células estejam lisadas. Células lisadas aparecerão como fantasmas escuros e não terão contorno ou forma definida. Idealmente, pelo menos 80% das células devem estar lisadas.Em seguida, use um alfinete para furar um orifício na parte inferior do tubo. Coloque a tampa rosqueável levemente apertada e posicione o tubo dentro de um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue a 1000 vezes G durante um minuto.Para coletar o lisado, transfira o lisado para um tubo de microcentrífuga e centrifugue a 15.000 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius para coletar as proteínas extraídas. Após medir a concentração das proteínas extraídas utilizando um kit de ensaio proteico, normalize todas as amostras para que cada uma contenha a mesma quantidade de proteína. Ajuste o volume final para um mililitro com o tampão apropriado.Obtém-se aproximadamente cinco miligramas de proteína total a partir de 50 OD 600 de células. Reserve 50 microlitros da proteína extraída como extrato de célula inteira. Os 950 microlitros restantes do extrato proteico serão utilizados posteriormente para purificação de proteínas ou imunoprecipitação de proteínas marcadas com MT.Adicione 50 microlitros de tampão de amostra 2 x lysis aos 50 microlitros de extrato celular total. Incube as amostras a 100 graus Celsius em um bloco térmico por três a cinco minutos antes de analisá-las por western blot. Inicie este procedimento preparando as esferas de níquel NTA superflow necessárias para a purificação.Obtenha a quantidade de microesferas necessária por meio de centrifugação de baixa velocidade durante um minuto. Remova o sobrenadante e lave as microesferas com PBS. Adicione um mililitro de PBS e inverta o tubo de cima para baixo até que as microesferas sejam ressuspendidas.Recolha as microesferas por centrifugação de baixa velocidade e remova o sobrenadante. Lave as microesferas desta maneira um total de cinco vezes. Suspenda as microesferas em um mililitro de tampão guine e alíquota-as no número de tubos correspondente às amostras a serem processadas.Colete as esferas por centrifugação de baixa velocidade e remova o sobrenadante de cada amostra. Adicione 950 microlitros do extrato celular completo, preparado anteriormente, a 100 microlitros das esferas.Incube em uma plataforma oscilante a quatro graus Celsius por pelo menos quatro horas ou durante a noite. Centrifugue a 800 a 1500 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius. Reserve 50 microlitros do sobrenadante.Adicione 50 microlitros de tampão amostral 2 x laly a este sobrenadante e incube a 100 graus Celsius em um bloco térmico por três a cinco minutos. Posteriormente, 10 microlitros de cada amostra serão analisados por western blot. Lave as esferas de níquel NTA superflow uma vez com um mililitro de tampão guine por cinco a 10 minutos em uma plataforma oscilante à temperatura ambiente.Em seguida, lave as esferas cinco vezes com um mililitro de tampão de ruptura; após a lavagem final com o tampão de ruptura, reconstitua as esferas em 90 microlitros de tampão amostral 2x Laemmli. Adicione 10 microlitros de iodo a 1 mol/L para ajudar na dissociação da proteína com marcação His das esferas de níquel-NTA; incube a 100 graus Celsius em bloco térmico por três a cinco minutos. Vortex, seguido de centrifugação a 13.000 × g por 30 segundos.Transfira o sobrenadante para um tubo novo. Para iniciar este procedimento, obtenha a quantidade necessária de anticorpo de afinidade anti cmic aero em gel por meio de centrifugação de baixa velocidade. Remova o sobrenadante, lave a resina com o tampão A, adicione um mililitro de tampão A e inverta o tubo de cima para baixo até que a resina seja ressuspendida.Colete a resina por centrifugação de baixa velocidade e remova o sobrenadante. Lave um total de cinco vezes. Suspenda a resina em um mililitro do tampão A e alíquota em um número de tubos correspondente às amostras a serem processadas.Colete a resina por centrifugação de baixa velocidade e remova o sobrenadante. Adicione 950 microlitros de extrato de células inteiras a 25 microlitros de resina. Incube em plataforma oscilante a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Centrifugue a 800 a 1500 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius.Guarde 50 microlitros do sobrenadante. Adicione 50 microlitros de tampão amostral 2 x Laemmli a este sobrenadante e incube a 100 graus Celsius em bloco térmico por três a cinco minutos. Lave a resina com o tampão A, adicione um mililitro do tampão A e inverta o tubo de cima para baixo até que a resina seja ressuspendida.Coletar a resina por centrifugação de baixa velocidade e remover o sobrenadante após a remoção do sobrenadante da lavagem final. Suspender novamente a resina em 100 microlitros de tampão amostral sume, incubando a 100 graus Celsius em um bloco térmico por três a cinco minutos. Vortex seguido de centrifugação a 13.000 ×g por 30 segundos.Transfira o sobrenatante para um tubo novo. Por fim, carregue todas as amostras coletadas a partir deste protocolo. Em um gel de eletroforese SDS-PAGE para análise por Western blot, cepas de levedura que expressam SMT três com marcação de poli-histidina ou HF SMT três e NDC 80 e NDC 10 com marcação MT foram utilizadas para detectar a simulação de proteínas cinetocóricas.Três substratos de HF SMT foram purificados por afinidade utilizando esferas de níquel e detectados com um anticorpo anti-Flag. Sumoilação de NDC 80 foi detectada nos três substratos de HF SMT quando sondados com um anticorpo anti-Mic. A ausência de proteínas modificadas nas linhagens controle sem HF SMT três indica a especificidade da interação entre HF SMT três e suas proteínas-alvo.Além disso, a soma de NDC 80 e NDC 10 é reduzida em células tratadas com NOCO desole para detectar a ubiquitinação de NDC 80 e NDC 10. ND C 80 ou ND C 10 marcado com Mick foi imunoprecipitado e a análise por western blot foi realizada com anticorpos anti-mic e anti-ubiquitina. A análise de extrato celular total e sobrenadante confirmou a expressão de NDC 80 M e NDC 10 M. As amostras imunoprecipitadas sondadas com anti-MIC mostraram múltiplas bandas de alto peso molecular, sugerindo que NDC 80 e NDC 10 contêm modificações pós-traducionais. Um padrão escalonado nas amostras imunoprecipitadas sondadas com anti-ubiquitina mostrou que ND C 80 e ND C 10 são ubiquitinados.Os padrões em escada do NDC 80 e do NDC 10 foram realçados pelo tratamento com um inibidor do proteassoma, MG 132. Isso confirma ainda mais que estes representam poliubiquitinação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da técnica de purificação de proteínas que permite a detecção da maturação e vacinação do NN de morcego.

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Biologia

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Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80 (Vídeo) | JoVE Journal

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

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