Name: Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprenda a gerar camundongos com deficiência gênica usando TALENs, nucleases de designer para edição precisa do genoma. Este método envolve microinjeção em oócitos fertilizados e transferência para mães substitutas, permitindo estudos funcionais de genes em modelos animais.

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Gostaríamos de agradecer a Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, e Ewa Skoczylas pela excelente assistência técnica. Este estudo foi financiado pela SNF Sinergia concessão CRSI33-125073 para PP.

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Orientada por nuclease Designer genoma abordagens edição estenderam significativamente a gama de espécies passíveis de alterações específicas dos respectivos genomas 10,12. Em ratinhos, em células ES de direccionamento de genes tem sido uma técnica padrão para mais de duas décadas; no entanto, tem sido difícil para se adaptar às células-tronco embrionárias de outros do que o mouse espécies, embora tenha havido algum sucesso recente em ratos células-tronco embrionárias. Mesmo com a disponibilidade de &quot;off-the-shelf&quot; rato ES clones de células alvo de genes fornecidos por consórcios como EUCOMM, KOMP ou NorCOMM 3 genoma edição por ZFN e TALEN proporciona maior precisão e flexibilidade em relação ao espectro de modificações que podem ser introduzida no genoma do rato. Animais fundadores portadores de mutações mediada por nuclease parece ser altamente germe linha competente 4-6,20,21, o que nem sempre é o caso para as quimeras provenientes injecções blastocisto de células ES. Assim, em certos casos, a microinjecção de desnucleases Igner pode resultar em geração significativamente mais rápido de novas linhas de mouse com modificações do genoma direcionados. A geração bem sucedida de camundongos knockout por injeção de ZFN e TALEN depende, em grande medida, da atividade do par nuclease injetado. TALENS tenham demonstrado ter uma elevada taxa de sucesso em atingir uma grande variedade de genes em vários organismos; No entanto, estudos recentes sugerem que a ligação é sensível ao TALEN metilação da citosina 30,31. Assim, os pares de nuclease recém-gerados, por exemplo TALENS clonado em vectores pCAG-T7, pode ser transfectada de forma transiente numa linha de células de rato tais como NIH-3T3 ou Neuro -2a, que imitam o estado da cromatina do embrião de rato, em certa medida. Aqui, a atividade nuclease pode ser estimada utilizando o ensaio endonuclease T7 ou uma restrição resumo de produto de PCR, como descrito na seção 5 antes da síntese de mRNA e microinjeção. Recomendamos seqüenciamento da região genômica de interesse no que diz respeitoive linha celular ea tensão do rato usado para experimentos de microinjeção. Em zigotos murinos, diferentes pares talen ou ZFN funcionará optimamente a diferentes concentrações de mRNA e, por conseguinte, a concentração de trabalho óptima do ARNm de nuclease microinjectado podem ter que ser determinadas experimentalmente. Dependendo do par de nuclease, uma concentração demasiado baixa irá resultar em nenhuma clivagem enquanto demasiado elevada pode resultar na letalidade de embrião. Dependendo do par de nuclease, tivemos sucesso utilizando as concentrações de mRNA total de tão baixas quanto 2 ng / mL e tão alta quanto 200 ug / ul. Estes efeitos são difíceis de prever a partir de experiências em cultura de células e a concentração óptima de nuclease para a sobrevivência do embrião e taxa de alteração do locus alvo precisa de ser determinada empiricamente. ZFN altamente ativa ou TALEN pode unir sua seqüência alvo além do estágio de uma célula do embrião microinjeção e, assim, causar padrões complexos de mutagênese umd mosaicismo em fundadores. Nós e os outros quatro têm observado três ou mais alelos mutantes distintos em um único fundador (Figura 5C). Assim, ao estabelecer uma nova linha de rato a partir desses fundadores, filhos devem ser cuidadosamente selecionados por sequenciamento para a presença da mutação favorável desde que os ensaios de digestão fornecem evidências de que apenas uma mutação indefinido está presente. Uma das críticas frequentemente manifestadas contra os sistemas de ZFN e talen é a possibilidade de que estas nucleases são também capazes de clivagem de sequências presentes em outro lugar no genoma, que são semelhantes aos sítios alvo. Tais efeitos fora do alvo têm sido observados com reagentes primeira geração usando o domínio homodimérico FokI e construções heterodímero foram projetados para aliviar os efeitos fora do alvo 25. Locais fora do alvo potencial podem ser previstos, em certa medida in silico 32,33 e rastreados por PCR e sequenciação. Uma vantagem óbvia of usando ZFNs TALENS e para a geração de ratinhos em vez de linhas de células é a possibilidade de remoção de fora mutações alvo não ligados a modificação do genoma desejado realizando retrocruzamentos a uma estirpe de tipo selvagem de escolha. Para a análise de um grande número de ratinhos progenitores, a próxima geração de profundidade sequenciação dos produtos de PCR gerados a partir do locus alvo de nuclease e in silico previsto fora do alvo loci pode oferecer uma leitura qualitativa e quantitativa alternativa aos ensaios de digestão dos produtos de PCR. As técnicas de reprodução assistida descritos neste protocolo são otimizados para cepas padrão de mouse usados ​​para experimentos de microinjeção, como C57Bl/6J ou B6D2F1. Ratos de diferentes origens, como cepas outbred, pode, em princípio, ser utilizada para abordagens edição do genoma e pode fornecer um fundo genético mais adequado para questões de pesquisa específicas. O desempenho de técnicas de reprodução assistida, como a superovulação pode ser predicted para um número de estirpes de 34-36, mas pode requerer mais de optimização para estirpes diferentes do padrão, a fim de se obter um número suficiente de embriões para nuclease microinjecção. Para além ZFN e TALEN, novas nucleases grife como o sistema CRISPR/Cas9 guiado RNA-9,37,38 foram agora introduzidas para aplicações de edição de genoma. Todos os métodos para a microinjecção e análise de animais fundadores aqui descritas são também aplicáveis ​​aos CRISPR/Cas9 e modos futuros de edição genoma.

Os ratos são, de longe, a plataforma mais popular para a geração de modelos de animais transgênicos. A caixa de ferramentas versáteis para a engenharia genética do embrião de rato 1-3 foi recentemente prorrogado por abordagens edição do genoma com base em nucleases designer, tais como nucleases dedo de zinco (ZFN) 4-6, transcrição nucleases efetoras ativador-like (Talen) 7,8, e os aglomerados regularmente intercaladas repete palindrômicas curtas (CRISPR) / (Cas) 9-associados CRISPR sistema 9. ZFN e função TALEN como pares de dois domínios de design personalizado à base de proteína de ligação a DNA (arrays de proteínas dedo de zinco e repetem-variable di-resíduos (RVDS), respectivamente), que são todos acoplados ao endonuclease FokI 10-12. Por outro lado, a especificidade de clivagem de ADN mediada por Cas9 é fornecido pela transactivação RNAs CRISPR (crRNA e tracrRNA, que também podem ser combinadas numa única molécula de ARN quimérico guia de ARN denominado 11) que age em complexo com oProteína CRISPR. Talens com uma seqüência definida de RVDS podem ser rapidamente construído por pesquisadores individuais, com uma multiplicidade de estratégias de montagem para escolher 13-17. CRISPR/Cas9 promete ainda menor geração de trabalho intensivo de nucleases grife, no entanto, a especificidade da guia de RNA-DNA de ligação ainda não está completamente resolvido 18,19. Geração de ZFNs personalizados até agora tem sido limitado a laboratórios acadêmicos especializados e fornecedores comerciais, como Sangamo Biosciences eo serviço Sigma CompoZr. Em geral, o genoma edição com nucleases grife visa introduzir vertente quebras duplas (DSB) em loci genômico definido, que, posteriormente, atrair final não homóloga juntar (NHEJ) ou recombinação homóloga (HR) máquinas de reparo do DNA 10,12. Reparação NHEJ-mediada de um DSB muitas vezes resulta na introdução de inserções e deleções, em estreita proximidade ao local de reparação. Assim NHEJ reparação cum ser explorada para bater para fora a função de um gene-alvo através da introdução de uma mutação frame-turno dentro do genes codificadores de proteínas seqüência 4,7,9. Alternativamente, a adição ou substituição de informação genética definida podem ser conseguidos proporcionando um doador de ADN em conjunto com as nucleases de design. Um doador de ADN compreende sequências de ADN concebidas para o investigador flanqueadas por regiões de homologia com o locus alvo, servindo assim como um molde para a reparação de DSB por HR. Ambos os plasmídeos 5,6,20 e de fita simples oligonucleotídeos 8,9,21 têm sido utilizados com sucesso como doadores. Nem NHEJ-nor genoma edição mediada por AR exigir a introdução de um marcador seleccionável para o genoma do embrião de rato, o que faz com que essas estratégias particularmente bem adequado para a criação de pequenas alterações na sequência de nucleótidos, sem perturbar a arquitectura genética global. Neste protocolo, descrevemos todos os procedimentos essenciais para a edição de genoma naembrião de rato usando Talens. Estes incluem: 1) identificação de um site de destino TALEN 22, 2) construção de Talens por clonagem Golden Gate 13, 3) síntese in vitro de TALEN mRNA, 4) microinjeção de TALEN mRNA em oócitos de camundongos fertilizados, 5) procedimentos cirúrgicos para transferência de embriões e 6) a análise de mutagénese induzida por TALEN em animais fundadores. Nós nos concentramos em microinjeção TALEN mRNA e triagem dos fundadores para induzidas NHEJ inserções / exclusões. Para este fim, geraram construções talen bifuncionais que permitem tanto a expressão em células de mamíferos quando transfectado como plasmídeos e na síntese in vitro do ARNm TALEN para microinjecção em embriões de ratinho. Estas construções compreendem um backbone CONTO truncado 23 fundido a heterodimeric FokI domínios 24,25 para a edição genoma ideal em células de mamíferos. Este protocolo também pode ser adotado para microinjeção de outras nucleases grife ou por injeções combinadas de nucleases grifee construções doadores (projeto de doadores de DNA tem sido descrita em excelentes publicações técnicas por Wefers et al. 26,27). Declaração de ética Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Instituto Cantonal de Veterinária da Cantão de Zurique.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S ou L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S ou L</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomicina</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease segura para plasmídeo</td><td>Epicentro</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Spin Columns</td><td>Invitrogen</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Formaldyde Load Dye</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA Marcadores do Milênio</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE tampão</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonuclease</td><td>NEB</td><td>M0302S ou L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector System I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Ácido Nucleico Gel Mancha</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>égua grávida&#039; s gonadotrofina sérica (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>gonadotrofina coriônica humana (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 meio de cultura de embriões</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 meio de cultura de embriões</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral, embrião testado</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cetamina CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment/Tools</td></tr><tr><td>Microscópio invertido com óptica Nomarski DIC (por exemplo, Nikon Eclipse TE200)</td><td>Unidades</td> micromanipuladoras Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>(por exemplo, Narishige, NT88NF)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embriões segurando capilares</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de injeção de embriões</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Extrator capilar (por exemplo, Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge (por exemplo, Narishige MF-900)</td>Tesoura de pele <td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonda cirúrgica</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de clipe reflexo (9 mm)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Clipe reflexo (9 mm)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina Dumont 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva Moria</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina Moria</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeira de buldogue Dietrich</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos C57BL / 6J</td> Código <td>de cepa Jackson Labs</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos CD-1 Código de</td><td>cepa</td> <td>Charles River</td> 000664 <td></td></tr></tbody></table>

rato genoma engenharia usando nucleases designer

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Camundongos transgênicos portadores modificações específicas do local do genoma (ko, batida-in) são de vital importância para dissecar sistemas biológicos complexos, bem como para a modelagem de doenças humanas e testar estratégias terapêuticas. Os recentes avanços no uso de nucleases de designer, tais como nucleases dedo de zinco (ZFNs), ativador de transcrição-como nucleases efetoras (Talens), e os aglomerados se repete regularmente palindrômicas curtas intercaladas (CRISPR) / (CAS) associada à CRISPR 9 sistema para o local- engenharia genoma específico em aberto a possibilidade de realizar rápida modificação do genoma segmentado em praticamente qualquer espécie de laboratório, sem a necessidade de contar com caule embrionárias (ES) tecnologia celular. Uma edição experimento genoma tipicamente inicia-se com a identificação de locais alvo de nuclease designer dentro de um gene de interesse, seguido por construção de domínios de ligação de ADN personalizados para dirigir a actividade de nuclease para o locus genómico definido pelo investigador. Plasmídeos nuclease Designer são in vitro &lt;/ Em&gt; transcrito para gerar mRNA para microinjeção de oócitos fertilizados de camundongo. Aqui, nós fornecemos um protocolo para alcançar a modificação do genoma alvo de injeção direta de TALEN mRNA em oócitos fertilizados de camundongo.

Foram construídos plasmídeos de destino compatível com o conjunto de Ouro GateTALEN publicado por 13 Cermak et al. Que permitem a expressão de TALENS em células de mamíferos, bem como a síntese in vitro de ARNm a partir do promotor do fago T7 (Figura 1C). Estes plasmídeos carregam domínios FokI heterodiméricos (ELD ou KKR mutações) que foram mostrados para reduzir fora do alvo efeitos relativos ao homodímeros FokI e aumentar a atividade clivagem em relação a primeira geração FokI heterodímeros 25,29. As reacções de montagem Golden Gate # 1 e # 2 são geralmente muito eficiente e cada colónia branca, quando analisados ​​por PCR de colónias, mostra o padrão esperado para o número particular de RVDS clonados (Figuras 1B e 1D). A análise em gel de ARNm sintetizada in vitro (Figura 2) deverá revelar uma única banda distinguíveis com pouca ou nenhuma mancha para cada amostra analisada. Deve haver uma mudança clara de tamanho entre amostras L1/R1 e L2/R2, L3/R3, que indica poliadenilação sucesso. Animais fundadores podem ser rastreados para alelos mutantes induzidos por NHEJ genotipagem utilizando PCR seguido por digestão com endonuclease de T7 (Figura 3) ou de uma digestão de restrição com uma enzima que cliva a sequência de tipo selvagem na região espaçadora do par de nuclease (Figura 4). O ensaio de T7 endonuclease é aplicável a qualquer tipo de mutação, independentemente da sequência genómica específica dentro da região espaçadora do par nuclease injectado; no entanto, ele detecta apenas desemparelhamentos entre cadeias de ADN de produtos de PCR de heteroduplex. Assim, no caso raro que um fundador carrega dois alelos mutantes de forma idêntica, os produtos de PCR que não mostram qualquer padrão de digestão T7. Essa distinção é, no entanto, sempre possível quando um local específico de restrição está localizado no interior da região espaçadora da nuclease que irá ser eliminado por NHEJInduzida por inserções / eliminações (Figura 5). Aqui, as bandas não digeridos indicam a presença de mutações e a ausência de quaisquer produtos digeridos sugere fortemente um fundador transportando mutações em ambos os alelos do gene alvo (marcado com um asterisco na Figura 4b). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> Figura 1. Golden Gate clonagem de Talen RVDS em heterodiméricos vetores pCAG-T7-Destino. A) Assembléia de matrizes RVD em vetores PFUs. Aqui é mostrado um exemplo de um par TALEN com matrizes CONTO individuais com 15 e 17 RVDS RVDS, respectivamente (para arrays CONTO mais de 21 RVDS, são necessárias três PFUs-RVDS assembléias, não apresentado). As setas indicam primers para reações de PCR colônia PFUs específicas do B). Produtos de PCRamplificados a partir de assembléias PFUs corretas normalmente mostram uma banda correspondente ao comprimento total de todos os RVDS clonados (por exemplo, cerca de 1,1 kb para 10 RVDS) e uma &quot;escada&quot; de menores bandas menos proeminentes devido à natureza repetitiva de matrizes RVD. C) A montagem final de matrizes PFUs-RVD e um plasmídeo contendo a última repetição (PLR) em vetores de expressão heterodiméricos Talen com FokIELD e FokIKKR variantes, respectivamente. A espinha dorsal TALEN (anotada como N e C) assemelha-se a arquitectura publicada por Miller et al. CAG 23 A (CMV elemento potenciador precoce / beta-actina de frango), o promotor permite níveis elevados de expressão em células de mamífero transfectadas, ao passo que o promotor do fago T7 permite em a síntese in vitro de mRNA (usar Saci para linearização do vector a jusante do codão de paragem da nuclease). D) Colónia de PCR utilizando os iniciadores indicados por setas em C) permite a identificação de montado correctamente TALENS. -Lengt completaprodutos h PCR são menos proeminentes, enquanto o &quot;efeito escada&quot; representa um indicador robusto de montagem bem-sucedida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> Figura 2. . Controle de qualidade de nuclease de ARNm na síntese in vitro utilizando electroforese em gel de agarose mRNAs ZFN são mostradas como um exemplo (L, deixou ZFN; R, ZFN direita). Amostras L1/R1 mostrar mRNA antes de poliadenilação, amostras L2/R2 espetáculo polyadenylated mRNA e L3/R3 mostrar mRNA poliadenilado purificada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img<html> alt = &quot;Figura 3&quot; fo: content-width = &quot;6 pol&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 3. Exemplo de uma digestão com endonucleases de T7 utilizados para a identificação de animais fundadores portadores de mutações induzidas por nuclease do locus alvo. A) Um par TALEN foi projetado para unir dentro da região codificadora do gene da proteína prion rato (Prnp, TALEN seqüência alvo pode ser fornecido mediante solicitação). Um produto de PCR é gerado usando um iniciador para a frente (F) localizado 110 pb a montante e um iniciador inverso (R) de 250 pb a jusante do local de clivagem TALEN. B) O produto de PCR é, subsequentemente, sujeito a formação de heteroduplex e digestão com endonuclease de T7. C) mutagénese induzida por TALEN dentro da região genómica alvo de fundadores individuais é revelada pela presença de um produto de comprimento completo por PCR com os produtos da digestão de 250 e 110 pb.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> Figura 4. Exemplo de uma digestão de restrição dos produtos de PCR utilizados para a identificação de animais fundadores portadores de mutações induzidas por nuclease do locus alvo específicos. ZFN para o locus alvo rato Rosa26 29 um local de restrição Xbal dentro do intrão 1. Fundadores A) foram rastreados por PCR utilizando a genotipagem um iniciador para a frente (F), localizado a 500 bp a jusante e um iniciador inverso (R) de 250 pb a jusante do local de clivagem. B) A digestão dos produtos de PCR com Xba I revela padrões de digestão, indicando ratinhos com mutações bi-alélicos (marcados com asteriscos), mono alélicas mutações (bandas digeridas e não digeridas, por exemplo, animais 2)e camundongos em peso (digestão completa, por exemplo, animais 21). C) Seqüenciamento de camundongos com potenciais modificações bi-alélicas mostra até 3 (animais 24) distintas inserções / exclusões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome do Primer </td><td> Sequência de 5 &#39;para 3&#39; </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Seqüências de primers utilizados para a PCR de colônia e sequenciamento dentro do conjunto Golden Gate TALENprotocolo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Plasmídeo / Colecção </td><td> Contribuinte </td><td> Addgene ID </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit 2.0 </td><td> Voytas laboratório </td><td> 1000000024 </td><td> Contém todos os plasmídeos necessários para a montagem Golden Gate TALEN </td></tr><tr><td> pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD vetores destino </td><td> Pelczar laboratório </td><td> 40131, 40132 </td><td> Add-on plasmídeos para a expressão em células de mamíferos TALEN e na síntese de ARNm in vitro </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Plasmídeos e coleções de plasmídeos necessários para a montagem Golden Gate TALEN podem ser obtidas Addgene ( <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> On-lineRecurso </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> Projeto de TALEN; TALEN previsão off-alvo </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> Projeto de TALEN, ABERTO ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> Projeto de TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 previsão off-alvo </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> Assembleia da TALEN seqüências para confirmação de resultados de sequenciamento </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> Projeto de montagem modular ZFN </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> Projeto de montagem modular ZFN </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Recursos on-line para a concepção de ZFN, TALEN e CRISPR/Cas9. </strong&gt;

Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar rapidamente camundongos deficientes em genes com a ajuda de nucleases ou garras de cauda projetadas. Isso é feito primeiro projetando e montando construções de DNA que codificam pares específicos de talons, que servem como modelos para a transcrição in vitro para gerar mRNAs Talon. As próximas etapas do procedimento são isolar os citos de camundongos fertilizados e, em seguida, microinjetá-los com o T. A etapa final é transferir cirurgicamente os citos injetados para as pseudo mães adotivas grávidas.A progênie F zero resultante freqüentemente mostra deleções específicas do local de sequências genômicas que muitas vezes levam à perda da função do gene alvo. Embora o método apresentado aqui possa fornecer informações sobre a função do gene em camundongos, a abordagem básica também pode ser adaptada a outros organismos modelo, como ratos e peixes. Primeiro, acesse o site do direcionador de nucleotídeos efetor TAL no site.Escolha o programa direcionador TN e cole a sequência do gene alvo. Para este protocolo. Use as sete construções de expressão TALEN do PCAGT e o kit efetor Golden Gate Talen e T que estão disponíveis no gene ad.Se outras construções ou kits de montagem forem usados para as configurações de montagem Talen puderem ser diferentes para o comprimento ideal do espaçador e o número de RVs de cauda, escolha a opção Miller Etal 2011 na configuração usar uma arquitetura predefinida. Em seguida, selecione NN na guia Substituto G. O programa gera um arquivo de texto com possíveis sites de destino gerados a partir dessa lista.Selecione o par ou pares Talen necessários e prossiga com a montagem do Golden Gate. Este protocolo funciona com as cepas de camundongos de laboratório mais comumente usadas, incluindo C 57, BL, seis J e BDF, uma super ovular 10 fêmeas doadoras com quatro semanas de idade usando uma injeção intraperitoneal de cinco unidades de gonadotrofina sérica de égua grávida. 48 horas depois, dê às fêmeas cinco unidades de gonadotrofina coriônica humana também por injeção intraperitoneal imediatamente após a injeção de gonadotrofina coriônica humana acasalar, as fêmeas um a um com machos em idade reprodutiva no mesmo dia, prepare as pseudo mães adotivas grávidas. Outros.Na manhã seguinte, sacrifique as fêmeas e recupere os oócitos fertilizados dissecando os UCTS. Em seguida, solte as garras de oócitos em uma placa de cultura de órgãos contendo um mililitro de meio M dois. Remova todas as células do cumulus adicionando 10 microlitros de solução de hialuronidase bovina a 0,1% a um prato contendo embreagens de cite em meio M dois.Em seguida, use a pipeta bucal para lavar os embriões através de duas ou três trocas de M dois meios para remover a hialuronidase. Continuar o tratamento com hialuronidase para embriões que ainda não se dissociaram das células do cumulus. Os embriões isolados podem ser armazenados em M 16, meio a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até serem microinjetados.Prepare 100 microlitros de solução injetável contendo 10 nanogramas por microlitro de cada cauda. Nuclease, mRNA, par e centrifugação por 30 minutos a 30.000 G para granular. Quaisquer partículas que possam entupir as agulhas de injeção.Em seguida, mantenha a mistura no gelo. Planeje injetar os oócitos em seu estágio pronuclear no início da tarde. Mergulhe aproximadamente 100 embriões em M dois meios sob uma camada de óleo mineral e trabalhe em um microscópio invertido sem óptica DIC marsy.Com ampliação de 20 x, selecione citos com pronúcleos distintos. A classificação dos oócitos pode ser feita usando uma carga capilar de injeção vazia no capilar de injeção imediatamente antes de ser usada com um a dois microlitros da solução de injeção. Em seguida, conecte-o ao cabeçote de microinjeção.Em seguida, aspire um cite selecionado com um capilar de retenção e faça uma injeção superficial do mRNA da nuclease no citoplasma. Evite o contato com os pronúcleos. O volume de injeção deve ser mantido baixo.Ao primeiro sinal de distensão citoplasmática, retire a agulha. Normalmente, cerca de 80 a 90% dos embriões devem sobreviver sem imediato. Para aumentar a quantidade de mRNA injetado, torne a solução mais concentrada após a microinjeção dos citos disponíveis.Transfira-os para um meio M 16 usando uma pipeta de boca. Incube os embriões por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, transfira os que sobreviverem para pseudo mães adotivas grávidas.No dia anterior à microinjeção induzir pseudo gravidez em camundongos fêmeas CD um de três a seis meses de idade, acasalando-os com machos setorizados por VA. Na manhã seguinte, selecione as fêmeas com um tampão transparente para usar como receptoras de embriões. As fêmeas não utilizadas voltarão ao seu estado de pseudo-gravidez em três semanas e podem ser reutilizadas posteriormente.Posicione uma mãe adotiva anestesiada sobre uma superfície quente em seu abdômen. Em seguida, desinfete a área da incisão borrifando-a com etanol 70%. Penteie o cabelo molhado para longe do local da incisão planejada.Agora abra a cavidade peritoneal com uma tesoura e exteriorize o corno uterino. Para fazer isso. Puxe a almofada de gordura presa ao ovário e imobilize os órgãos reprodutivos com uma pinça de buldogue.Além disso, certifique-se de manter os órgãos úmidos com solução aquecida de cloreto de sódio a 0,9%. Neste ponto, separe de 12 a 20 embriões viáveis e carregue-os em um capilar de vidro fino. Usando a pipeta bucal, aspire primeiro uma pequena bolha de ar e, em seguida, aspire os embriões usando uma pinça fina.Segure suavemente o UCT logo a montante do amplificador e crie um pequeno orifício na parede do UCT usando uma agulha de calibre 30. Insira o capilar carregado no orifício e sopre suavemente os embriões para o amplificador até ver que a bolha de ar foi deslocada do capilar. Em seguida, remova o capilar.Substitua imediatamente os órgãos reprodutivos de volta à cavidade corporal e feche a cavidade peritoneal com uma única sutura. Em seguida, feche a pele usando um ou dois clipes de nove milímetros. Devolva o animal à gaiola de origem e supervisione-o até que a anestesia passe.Em seguida, alojar as fêmeas em grupos sociais estáveis de dois a três camundongos para minimizar o estresse nos primeiros três dias de pós-operatório, certifique-se de fornecer um analgésico como o DEF Falcon na água potável para cada gafanhoto no genoma do camundongo que é alvo de nucleases projetadas. Um ensaio baseado em PCR é projetado para identificar animais fundadores que carregam um alelo mutado desejado. No primeiro exemplo, fundadores originados da microinjeção de um par de nuclease de cauda.Visando a região de revestimento do gene da proteína príon de camundongo foram analisados pela digestão de endonuclease T seven de um produto de PCR. O ensaio de digestão de endonuclease T seven baseia-se na formação de heteroduplexes entre fitas de DNA de produtos de PCR gerados a partir de alelos mutantes e selvagens. A mutagênese induzida por Talon dentro da região genômica alvo de fundadores únicos foi revelada pelo aparecimento de 250 e 110 produtos de digestão longa emparelhados com bases, além do produto de PCR de comprimento total.Alternativamente, os produtos de PCR podem ser submetidos a um resumo de restrição se um local de restrição de diagnóstico adequado estiver localizado na região espaçadora do par de nuclease projetado. No segundo exemplo, o ZFN tem como alvo um site de restrição XPO localizado na introdução, um dos locus Rosa 26 do mouse. Aqui, bandas não digeridas indicam a presença de mutações.Os asteriscos marcam, a ausência de quaisquer produtos digeridos sugerindo fortemente um fundador portador de mutações em ambos os alelos do gene alvo. A clonagem e o sequenciamento desses produtos de PCR não digeridos revelam que os camundongos fundadores podem abrigar duas ou mais modificações distintas do alelo alvo. A ausência de sequências do tipo selvagem indica a ablação completa do gene alvo.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão do design da nuclease da cauda, montagem da cauda, construções de nuclease e como usá-las para gerar camundongos mutantes por microinjeção direta de osídeo. Este método pode ser adaptado para trabalhar com outras classes de nucleases projetadas, como zinco, núcleo de dedo ou CAS nove crispr. Também pode facilitar a modificação do genoma por recombinação homóloga por meio da coinjeção simultânea da nuclease e do modelo de direcionamento genético apropriado.

mouse-genome-engineering-using-designer-nucleases

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O CompoZr personalizado Zinc-Finger Nuclease de Serviços (ZFN) permite edição genoma preciso em qualquer organismo ou linha de células em qualquer lugar geométrico definido pelo utilizador. Este artigo descreve o processo para a concepção, fabricação, validação e implementação do Serviço CompoZr ZFN personalizada.

Genoma Edição com CompoZr personalizados Nucleases dedo de zinco (ZFNs)

CRISPR/Cas9 é um sistema robusto para produzir ruptura de genes e elementos genéticos. Aqui descrevemos um protocolo para a criação eficiente de deleções genômicas em linhagens celulares de mamíferos usando CRISPR/Cas9.

Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

A edição do genoma de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) pode ser feita de forma rápida e eficiente. Apresentado aqui é um procedimento experimental robusto para projetar geneticamente hPSCs, como exemplificado pela edição do locus de porto seguro AAVS1 para expressar EGFP e introduzir resistência a antibióticos.

Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

CRISPR-Cas é uma tecnologia poderosa para projetar os genomas complexos de plantas e animais. Aqui, detalhamos um protocolo eficiente editar o genoma humano usando diferentes endonucleases de Cas. Destacamos importantes considerações e parâmetros de projeto para otimizar a eficiência de edição.

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

O presente protocolo descreve a microinjeção de zigoto de CRISPR-Cas9 e DNA do doador para produzir eficientemente camundongos knock-in e floxed de gênico.

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

A eficiência do método de Edição Aprimorada do Genoma via Entrega de Ácidos Nucléicos Ovidutais (I-GONAD) é comparável à microinjeção tradicional, que requer coleta de zigoto de fêmeas doadoras e transferência para fêmeas pseudo-grávidas. Este protocolo demonstra sua eficácia introduzindo mutações induzidas por CRISPR/Cas9 no locus ROSA26 no cromossomo 6.

Edição de genoma aprimorada por meio de técnica de eletroporação in vivo baseada em entrega de ácidos nucléicos ovidutais para geração de camundongos knockout

Abordagens experimentais de Engenharia de Tecidos

Aprenda a gerar camundongos com deficiência gênica usando TALENs, nucleases de designer para edição precisa do genoma. Este método envolve microinjeção em oócitos fertilizados e transferência para mães substitutas, permitindo estudos funcionais de genes em modelos animais.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

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