Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

O objetivo geral deste procedimento é gerar rapidamente camundongos deficientes em genes com a ajuda de nucleases ou garras de cauda projetadas. Isso é feito primeiro projetando e montando construções de DNA que codificam pares específicos de talons, que servem como modelos para a transcrição in vitro para gerar mRNAs Talon. As próximas etapas do procedimento são isolar os citos de camundongos fertilizados e, em seguida, microinjetá-los com o T. A etapa final é transferir cirurgicamente os citos injetados para as pseudo mães adotivas grávidas.

A progênie F zero resultante freqüentemente mostra deleções específicas do local de sequências genômicas que muitas vezes levam à perda da função do gene alvo. Embora o método apresentado aqui possa fornecer informações sobre a função do gene em camundongos, a abordagem básica também pode ser adaptada a outros organismos modelo, como ratos e peixes. Primeiro, acesse o site do direcionador de nucleotídeos efetor TAL no site.

Escolha o programa direcionador TN e cole a sequência do gene alvo. Para este protocolo. Use as sete construções de expressão TALEN do PCAGT e o kit efetor Golden Gate Talen e T que estão disponíveis no gene ad.

Se outras construções ou kits de montagem forem usados para as configurações de montagem Talen puderem ser diferentes para o comprimento ideal do espaçador e o número de RVs de cauda, escolha a opção Miller Etal 2011 na configuração usar uma arquitetura predefinida. Em seguida, selecione NN na guia Substituto G. O programa gera um arquivo de texto com possíveis sites de destino gerados a partir dessa lista.

Selecione o par ou pares Talen necessários e prossiga com a montagem do Golden Gate. Este protocolo funciona com as cepas de camundongos de laboratório mais comumente usadas, incluindo C 57, BL, seis J e BDF, uma super ovular 10 fêmeas doadoras com quatro semanas de idade usando uma injeção intraperitoneal de cinco unidades de gonadotrofina sérica de égua grávida. 48 horas depois, dê às fêmeas cinco unidades de gonadotrofina coriônica humana também por injeção intraperitoneal imediatamente após a injeção de gonadotrofina coriônica humana acasalar, as fêmeas um a um com machos em idade reprodutiva no mesmo dia, prepare as pseudo mães adotivas grávidas. Outros.

Na manhã seguinte, sacrifique as fêmeas e recupere os oócitos fertilizados dissecando os UCTS. Em seguida, solte as garras de oócitos em uma placa de cultura de órgãos contendo um mililitro de meio M dois. Remova todas as células do cumulus adicionando 10 microlitros de solução de hialuronidase bovina a 0,1% a um prato contendo embreagens de cite em meio M dois.

Em seguida, use a pipeta bucal para lavar os embriões através de duas ou três trocas de M dois meios para remover a hialuronidase. Continuar o tratamento com hialuronidase para embriões que ainda não se dissociaram das células do cumulus. Os embriões isolados podem ser armazenados em M 16, meio a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até serem microinjetados.

Prepare 100 microlitros de solução injetável contendo 10 nanogramas por microlitro de cada cauda. Nuclease, mRNA, par e centrifugação por 30 minutos a 30.000 G para granular. Quaisquer partículas que possam entupir as agulhas de injeção.

Em seguida, mantenha a mistura no gelo. Planeje injetar os oócitos em seu estágio pronuclear no início da tarde. Mergulhe aproximadamente 100 embriões em M dois meios sob uma camada de óleo mineral e trabalhe em um microscópio invertido sem óptica DIC marsy.

Com ampliação de 20 x, selecione citos com pronúcleos distintos. A classificação dos oócitos pode ser feita usando uma carga capilar de injeção vazia no capilar de injeção imediatamente antes de ser usada com um a dois microlitros da solução de injeção. Em seguida, conecte-o ao cabeçote de microinjeção.

Em seguida, aspire um cite selecionado com um capilar de retenção e faça uma injeção superficial do mRNA da nuclease no citoplasma. Evite o contato com os pronúcleos. O volume de injeção deve ser mantido baixo.

Ao primeiro sinal de distensão citoplasmática, retire a agulha. Normalmente, cerca de 80 a 90% dos embriões devem sobreviver sem imediato. Para aumentar a quantidade de mRNA injetado, torne a solução mais concentrada após a microinjeção dos citos disponíveis.

Transfira-os para um meio M 16 usando uma pipeta de boca. Incube os embriões por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, transfira os que sobreviverem para pseudo mães adotivas grávidas.

No dia anterior à microinjeção induzir pseudo gravidez em camundongos fêmeas CD um de três a seis meses de idade, acasalando-os com machos setorizados por VA. Na manhã seguinte, selecione as fêmeas com um tampão transparente para usar como receptoras de embriões. As fêmeas não utilizadas voltarão ao seu estado de pseudo-gravidez em três semanas e podem ser reutilizadas posteriormente.

Posicione uma mãe adotiva anestesiada sobre uma superfície quente em seu abdômen. Em seguida, desinfete a área da incisão borrifando-a com etanol 70%. Penteie o cabelo molhado para longe do local da incisão planejada.

Agora abra a cavidade peritoneal com uma tesoura e exteriorize o corno uterino. Para fazer isso. Puxe a almofada de gordura presa ao ovário e imobilize os órgãos reprodutivos com uma pinça de buldogue.

Além disso, certifique-se de manter os órgãos úmidos com solução aquecida de cloreto de sódio a 0,9%. Neste ponto, separe de 12 a 20 embriões viáveis e carregue-os em um capilar de vidro fino. Usando a pipeta bucal, aspire primeiro uma pequena bolha de ar e, em seguida, aspire os embriões usando uma pinça fina.

Segure suavemente o UCT logo a montante do amplificador e crie um pequeno orifício na parede do UCT usando uma agulha de calibre 30. Insira o capilar carregado no orifício e sopre suavemente os embriões para o amplificador até ver que a bolha de ar foi deslocada do capilar. Em seguida, remova o capilar.

Substitua imediatamente os órgãos reprodutivos de volta à cavidade corporal e feche a cavidade peritoneal com uma única sutura. Em seguida, feche a pele usando um ou dois clipes de nove milímetros. Devolva o animal à gaiola de origem e supervisione-o até que a anestesia passe.

Em seguida, alojar as fêmeas em grupos sociais estáveis de dois a três camundongos para minimizar o estresse nos primeiros três dias de pós-operatório, certifique-se de fornecer um analgésico como o DEF Falcon na água potável para cada gafanhoto no genoma do camundongo que é alvo de nucleases projetadas. Um ensaio baseado em PCR é projetado para identificar animais fundadores que carregam um alelo mutado desejado. No primeiro exemplo, fundadores originados da microinjeção de um par de nuclease de cauda.

Visando a região de revestimento do gene da proteína príon de camundongo foram analisados pela digestão de endonuclease T seven de um produto de PCR. O ensaio de digestão de endonuclease T seven baseia-se na formação de heteroduplexes entre fitas de DNA de produtos de PCR gerados a partir de alelos mutantes e selvagens. A mutagênese induzida por Talon dentro da região genômica alvo de fundadores únicos foi revelada pelo aparecimento de 250 e 110 produtos de digestão longa emparelhados com bases, além do produto de PCR de comprimento total.

Alternativamente, os produtos de PCR podem ser submetidos a um resumo de restrição se um local de restrição de diagnóstico adequado estiver localizado na região espaçadora do par de nuclease projetado. No segundo exemplo, o ZFN tem como alvo um site de restrição XPO localizado na introdução, um dos locus Rosa 26 do mouse. Aqui, bandas não digeridas indicam a presença de mutações.

Os asteriscos marcam, a ausência de quaisquer produtos digeridos sugerindo fortemente um fundador portador de mutações em ambos os alelos do gene alvo. A clonagem e o sequenciamento desses produtos de PCR não digeridos revelam que os camundongos fundadores podem abrigar duas ou mais modificações distintas do alelo alvo. A ausência de sequências do tipo selvagem indica a ablação completa do gene alvo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão do design da nuclease da cauda, montagem da cauda, construções de nuclease e como usá-las para gerar camundongos mutantes por microinjeção direta de osídeo. Este método pode ser adaptado para trabalhar com outras classes de nucleases projetadas, como zinco, núcleo de dedo ou CAS nove crispr. Também pode facilitar a modificação do genoma por recombinação homóloga por meio da coinjeção simultânea da nuclease e do modelo de direcionamento genético apropriado.