Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

O objetivo geral deste procedimento é projetar geneticamente células-tronco pluripotentes humanas usando tecnologia moderna de edição de genoma. Embora esse procedimento possa fornecer informações sobre a biologia das células-tronco, ele também pode ser aplicado para facilitar a modelagem de doenças humanas em um ambiente geneticamente definido. Geralmente, indivíduos novos neste método precisarão praticar o isolamento de colônias antes de se tornarem proficientes.

A demonstração visual deste método é essencial, pois a identificação e a coleta de colônias podem ser difíceis. Comece cultivando células-tronco pluripotentes humanas em meio hESC em uma placa de seis poços contendo fibroblastos embrionários de camundongo inativados com mitomicina C ou células alimentadoras de MEF cultivadas em gelatina. A cada dia subsequente após o revestimento, até que os hPSCs atinjam 50% de confluência, use uma pipeta de vidro e aspire para remover todo o volume do meio.

Substitua por três mililitros de meio hESC quente por poço. Um dia antes do direcionamento, remova o meio hESC e adicione um novo meio hESC pré-aquecido suplementado com 10 micromolares Y-27632. Além disso, prepare de um a dois seis poços

No dia do direcionamento, prepare as soluções de transvecção pipetando cinco microgramas de plasmídeo de expressão de nuclease de dedo de zinco 1 e 2, plasmídeo de expressão TALON 1 e 2 ou 15 microgramas do plasmídeo codificador CRISPR cas9 px330 em um tubo de um vírgula cinco mililitros. Adicione 30 microgramas do plasmídeo doador reparado, seguido de solução salina tamponada com fosfato suficiente para elevar o volume a 300 microlitros. Inspecione as células ao microscópio para garantir 50% de confluência.

Em seguida, use uma pipeta de vidro e aspire para remover o meio da placa de hPFCs e, em seguida, lave as células com 2 mililitros de PBS 1x quente. Depois de aspirar o PBS, adicione cinco mililitros de solução de tripsina-EDTA a 0,25% diretamente nas células. Coloque na incubadora de cultura de tecidos por aproximadamente 10 minutos ou até que a camada de alimentação comece a se soltar da placa.

Após a incubação, adicione dois mililitros de meio de lavagem ES quente a cada poço para interromper a reação de tripsina. Colete as células de cada poço, garantindo que as células alimentadoras saiam como uma folha. Pipetar o conteúdo de cada alvéolo para um único tubo cónico de 50 mililitros, combinando todos os alvéolos e triturar as células com uma pipeta serológica de 10 mililitros.

Adicione o meio de lavagem ES para levar a suspensão celular a 40 mililitros. Aguarde um a dois minutos para permitir que grandes pedaços de alimentação se depositem no fundo do tubo, depois remova o sobrenadante, usando uma pipeta sorológica, e deposite em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Depois de centrifugar a suspensão celular durante cinco minutos a 190 vezes g, aspirar o sobrenadante sem perturbar a paleta celular.

Ressuspenda as células em 500 microlitros de 1x pbs. Combine as células ressuspensas com a solução de transecção de plasma preparada anteriormente. Pipete as células e a mistura de transfecção em uma cubeta de eletroporação de quatro milímetros e coloque no gelo por três a cinco minutos.

Defina os parâmetros para o programa exponencial no sistema de eletroporação para 250 volts, 500 microfarads, resistência infinita e tamanho de cubeta de quatro milímetros. Eletropore as células e coloque a cubeta de volta no gelo por três minutos. Ressuspenda as células eletroporadas em 18 mililitros de meio hESC quente, suplementado com 10 micromolares Y-27632.

Inspecione os MEFs DR4 ao microscópio. Coloque três mililitros da suspensão de célula única em cada poço de uma placa de seis poços contendo células alimentadoras DR4 e retorne à incubadora. No terceiro dia após o revestimento, substitua a mídia nas células hESC sem Y-27632.

No quarto dia, substitua o meio não suplementado por meio contendo o antibiótico de seleção apropriado. Puromicina é usada aqui. No dia anterior à colheita da colônia, prepare uma placa de 12 poços de células alimentadoras de MEF para cada colônia a ser colhida.

No dia 12 após o plaqueamento, examine a placa em um microscópio de dissecação. Identifique colônias de 800 a 1.200 mícrons de diâmetro que estão prontas para serem colhidas. Certifique-se de que essas colônias não contenham células que estão começando a se diferenciar, como a mostrada aqui.

Além disso, certifique-se de que as células estejam expressando GFP. No dia da colheita, inspecione os MEFs ao microscópio para garantir que estejam saudáveis. Remova todos os meios das placas das células alimentadoras de MEF e substitua por um mililitro de meio hESC.

Além disso, troque o meio hESC nas placas de hPSC de seis poços que serão colhidas. Em seguida, puxe pipetas de vidro para colher colônias. Para escolher colônias, primeiro coloque os hPFCs da placa no stage do microscópio de dissecção na capa de cultura de tecidos, monte o dispositivo de coleta colocando a extremidade da pipeta de vidro no bulbo de sucção.

Identifique a colônia a ser colhida e coloque a ponta da pipeta de vidro puxada sobre a colônia. Em seguida, comprima o bulbo do dispositivo de coleta para extirpar suavemente e cortar uma colônia individual em 10 a 20 pedaços de tamanhos iguais. Em seguida, puxe os pedaços de colônia excisados para a pipeta, soltando o bulbo.

Tente tirar o mínimo de mídia possível durante a transferência. Comprima o bulbo para transferir a colônia agora quebrada diretamente para um poço de uma placa de célula alimentadora MEF de 12 poços. Rotule cada poço para permitir a identificação exclusiva de clones derivados de uma única célula.

Troque a pipeta de vidro e repita o procedimento para a próxima colônia. Retorne as placas para a incubadora e balance suavemente as placas para dispersar as células no poço. No dia seguinte, remova todo o volume do meio e substitua por um vírgula cinco mililitros de meio hESC quente.

Repita por 10 a 12 dias até que as células estejam 50% confluentes. Após 10 a 12 dias, inspecione as hESCs sob o escopo. Escolha uma a duas colônias de cada poço e transfira para novas placas de células alimentadoras MEF de 12 poços para gerar uma placa de réplica.

Extrair DNA das colônias restantes em cada poço das placas originais para genotipagem por PCR ou southern blot. Weber Três células-tronco embrionárias humanas foram direcionadas ao locus AAVS1 usando nucleases específicas do local e um modelo de reparo para introduzir um repórter EFFP e um de resistência à puromicina. Essas imagens representativas mostram colônias editadas com nucleases de dedo de zinco, TALENs e CRISPR/Cas9.

Esses resultados representativos de genotipagem de PCR mostram clones direcionados não direcionados, heterozigotos e homozigotos usando nucleases de dedo de zinco, TALENs e CRISPR/Cas9 ao lado de um controle de tipo selvagem. Esta tabela mostra as integrações verificadas por PCR no locus AAVS1 para cada nuclease específica do local neste experimento, em comparação com as integrações únicas adequadas verificadas por Southern Blot em experimentos anteriores. O CRISPR-Cas9 produziu os clones mais corretamente direcionados, enquanto a plataforma TALEN teve os clones mais homozigosamente direcionados.

Uma vez dominada, essa técnica leva cerca de três a cinco horas de tempo prático, e você pode obter células editadas dentro de cerca de três semanas após o início dos experimentos. É muito importante com esta técnica trabalhar com segurança e usar a técnica estéril em todos os momentos. Após a manipulação genética, você pode ver como isso afeta outros tipos de células usando a diferenciação de células-tronco em outros tipos de células, como neurônios.

O desenvolvimento deste protocolo abriu caminho para os pesquisadores usarem a edição do genoma em células-tronco pluripotentes humanas para estabelecer modelos de doenças in vitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como editar o genoma em células-tronco pluripotentes humanas.