Name: Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a criar um modelo celular de contato da barreira hemato-encefálica humana usando cocultura de astrócitos e células endoteliais cerebrais. Este método melhora a adesão celular e permite estudar permeabilidade e efeitos de agentes farmacológicos.

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Este estudo foi financiado por subvenções concedidas aos RLM do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (concessão # 606658).

1. Cultura de Células (3-7 dias antes da Assembleia-BBB) 1.1. Células Cérebro humano microvascular endoteliais primárias (BEC) CEBs foram obtidos comercialmente. As células foram produzidas por dissociação de dispase de tecido do córtex cerebral humano normal e forneceu congeladas a passagem 3 (&lt;12 duplicações da população). <ol><li> Substrato: vasos Brasão de cultura de tecidos com &quot;Fator de Fixação&quot; de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Manutenção celular: Manter BECs em meio completo contendo soro. Para a experimentação, a cultura CEBs em meio isento de soro completo. Manter as células numa atmosfera húmida de 5% de CO 2, 21% de O 2 incubadora a 37 ° C Observação: Como uma alternativa aos reagentes especializados, 0,1% (w / v), soluções de gelatina pode servir como um reagente de revestimento ao mesmo tempo DMEM/F-12 suplementado com HEPES 15 mM, 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de L-glutamina, 50 ug/ Ml de gentamicina, 20 ug / ml de heparina e 20 ug / ml de suplemento de crescimento de células endoteliais pode ser utilizado para a manutenção BEC. </li><li> Sub-cultura de experimentação: CEBs confluentes divididos na proporção de 1:03 - 01:06, dependendo do tempo pretendido para a utilização seguinte (3-7 dias). Altere o meio de manutenção a cada 3 dias. Use BECs até 15 passagens. </li></ol> 1.2. SVG Human Fetal astroglial-line celular SVG células gliais fetais humanas 22 foram originalmente derivadas de culturas primárias de cérebro fetal humano transformada com o vírus símio 40 deficiente em replicação. <ol><li> Manutenção: células Cultura SVG em meio mínimo essencial com solução salina equilibrada de Earle suplementado com 20% (v / v) FCS (mesma percentagem de soro utilizado para manter as células primárias progenitoras 22), 2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina. Manter as células numa atmosfera húmida de 5% de CO 2, 21% de O2 </sub&gt; incubadora a 37 ° C. </li><li> Sub-cultura de experimentação: SVGs confluentes Dividir a uma proporção de 1:5 a 1:10, dependendo do tempo pretendido para a utilização seguinte (3-7 dias). Remoção de tripsina não é necessário, devido ao alto teor de soro no meio. Troca da mídia a cada 3 dias. Use SVGs até 20 passagens. </li></ol> 2. Montagem e Coculturing da In vitro BBB Modelo Humano (Dia 0) Comentário: O ser humano em contato modelo BBB vitro é preparado de acordo com protocolos publicados 13,23, com modificações. 2.1. Revestimento de inserções <ol><li> Coloque inserções de cultura de tecidos (6,5 mm de diâmetro, com poliéster membrana porosa, de 3 um de tamanho dos poros) nos poços da placa de 24 poços fornecidas. Revestir a superfície luminal das inserções <s> </s> durante a noite numa incubadora humidificada a 37 ° C com colagénio I de rato (20 g / cm 2, 50 ul de 132 ug/ Ml de colagénio I, em 0,02% de ácido acético em água Milli-Q (MQH 2 O)). Lavar as inserções uma vez (tanto do lado abluminal e luminal) com MQH 2 O para remover o ácido residual. Nota: A membrana basal dos capilares do cérebro não contém colágeno I, mas principalmente lamininas, isoformas de colágeno tipo IV, nidogens e proteoglicanos de heparan sulfato 9. Por este motivo, alguns pesquisadores utilizam agentes de revestimento como o colágeno IV, fibronectina 13, ou Matrigel (BD Biosciences) 16 para uma modelagem BBB mais autêntica. </li></ol> 2.2. SVGs Sementeira na parte de baixo (abluminal) superfície da membrana <ol><li> Inverta a inserção e ajustar suavemente em torno da borda da membrana porosa a uma curta peça de tubagem de silicone elástico (&quot;tubo externo&quot;, 8 mm de diâmetro interno ~ 10 mm de comprimento, 1,6 mm de parede), criando essencialmente um novo bem acima da superfície abluminal (Figura 2A). </li><li> A parte inferior da inserção needs para ser selado para evitar vazamento de mídia. Em primeiro lugar, preparar um bujão (Figura 2A e 2B), feita de um tubo de silicone (denominado &quot;tubo interno&quot;; ~ 8 mm de comprimento, 3,2 mm de diâmetro interno, parede de 1,6 milímetros; Figura 2B), selado numa das extremidades, com um cone de vedação de plástico (~ 3 mm de comprimento; preparado pelo corte da parte inferior de uma reacção em cadeia com 0,2 ml de polimerase (PCR) do tubo e a figura 2B). Este cone não só sela o lúmen dos tubos internos, mas também aumenta a sua aresta para encaixe apertado dentro do inserto. Em seguida, utilizando um fórceps estéril, inserir a ficha de silicone na cavidade luminal e avançar até que ele chegue até a ~ 1-2 mm a partir da membrana (Figura 2A). </li><li> Em seguida, as sementes 4 x 10 4 células SVG em 200 mL SVG meio de manutenção (SEcção 1.2.2 acima) directamente para o silicone bem acima da superfície da membrana abluminal (Figura 2A). Permitir SVGs a aderir por pelo menos 4 horas na incubadora. Nota: Para manter a esterilidade transportar as inserções montadas entre duas placas de 6 poços (uma placa invertida sobre a outra; Figura 2C), para minimizar a exposição ao ar não filtrado, durante o procedimento. Os tubos de silicone e os tampões são lavadas em etanol e autoclavado para uso posterior. Nota: Utilize plugs (seção 2.2.2) apenas para pastilhas com poros da membrana com tamanho superior a 1 mícron. As membranas com poros de diâmetro de 1 um ≤ raramente vazar e requerem apenas a montagem do tubo de silicone externa (secção 2.2.1). Além disso, alguns outros do que o colágeno agentes de revestimento I (ver nota a seção 2.1) pode impedir leakiness mesmo através de 3 mM poros. Determinar esta empiricamente. </li><li> A fim de monitorar o estado adesão de seus astrócitos, semear em paralelo emde 96 cavidades de um volume idêntico padrão da célula-suspensão dos astrócitos. Este poço tem a mesma área de superfície que a inserção 6,5 milímetros (0,33 cm 2) e permite a fácil visualização das células por microscopia de contraste de fase do que a membrana de inserção. Quando se verificar a adesão suficiente dos astrócitos no controlo de 96 poços, os astrócitos foram aderidas adequadamente também a inserção da membrana. </li><li> Quando astrócitos têm suficientemente respeitado no controle de 96 poços, transferir os conjuntos de inserção para a capa de cultura de tecidos (ver nota acima) e retire cuidadosamente o tubo de silicone externa e plugues. Retornar inserções para a orientação normal (ou seja, na vertical) nas cavidades fornecidas contendo 800 ul / poço de meio de manutenção BEC (secção 1.1.2, supra). </li></ol> 2.3. Sementeira do BEC para a Câmara Luminal acima dos astrócitos Semente 2x10 4 BECs em 200 mL até a superfície luminal da revestido de colágeno e voltar a insegurançarts na incubadora. 2.4. Coculturing Co-cultura das inserções SVG / BEC-semeados durante 3 dias em meio BEC sem mudança mídia antes de experimentação. 3. Experimentação com o modelo de certificação Humano (Dia 3) <ol><li> Para estimular as células in vitro de BBB primeira lavagem, substituindo os meios de comunicação abluminais e luminais com 600 mL e 100 mL de meio BECs sem soro, respectivamente. </li><li> Aspirar o meio do lúmen de novo e substituir com 100 ul de meio isento de soro, com agentes estimulantes. Nota: Se a estimulação da câmara abluminal é necessária (para ativar o in vitro a certificação do compartimento astrocitária), aspirar o meio abluminal e substituir com 600 ul de meio sem soro com agentes estimulantes. </li><li> Teste cada grupo experimental em triplicado (daí, se a estimulação luminal é realizada, o que requer 3 x 100 mL, recomendamos diluir o re<html> Os agentes para as suas concentrações finais em 350 ul de meio isento de soro em cada grupo para minimizar erros de pipetagem entre poços). </li><li> Realizar paracelular padrão e / ou ensaios de permeabilidade transcelular dos marcadores marcados 16,24 (para o último usamos isotiocianato de fluoresceína (ITCF) conjugadas com albumina) e / ou medição de TEER 13,16,25 como descrito anteriormente. </li></ol> Para ter em conta as flutuações na permeabilidade da linha de base entre os experimentos, analisar alterações na permeabilidade em relação a uma inserção de revestimento sem células (que serve como uma referência para a permeabilidade máxima) e para o grupo tratado com o veículo utilizando a fórmula: permeabilidade (% de máximo) = ( valor de permeabilidade de inserção experimental - valor médio permeabilidade do grupo do veículo) / (valor de permeabilidade do inserto em branco - valor médio permeabilidade do grupo do veículo) X 100. 4. A visualização de células em membranas porosas nt &quot;&gt; Comentário: células não coradas em membranas de inserção são difíceis de observar por contraste de fase ou de contraste de interferência diferencial microscopia (DIC) desde a membrana é bastante opaca e interfere com a transmissão de luz para lidar com esta questão, desenvolvemos vários procedimentos de coloração de células em. pastilhas, que melhoram grandemente a aparência de células sobre a membrana. Geralmente, manchar as membranas de inserção enquanto ainda ligados à inserção, nas cavidades. As membranas devem ser removidos apenas no fim do procedimento de coloração para fins de montagem. 4.1. Coloração Hematoxilina <ol><li> Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl 130 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) durante 20 min. Lavar uma vez com PBS. </li><li> Mergulhe a inserção em solução de hematoxilina 0,1% de Mayer por 2 min. </li><li> Delicadamente, lave a inserção com água da torneira (submergindo as insert em um copo contendo água da torneira e cuidado pipetando o excesso de água). Transferir a solução para inserção de Scott água de torneira (2 g / l de NaHCO3, 20 g / L de MgSO 4) para ~ 20 segundos até que a cor azul desejada desenvolve. Lave a inserção de novo com água da torneira (seção 4.1.3). Uma mancha de eosina opcional pode ser introduzida aqui por imersão em solução a inserção eosina 1% durante 10 segundos seguido por uma lavagem com água da torneira. </li><li> Ar seco a membrana de inserção. Usando um bisturi (corte ao redor da borda da membrana) remover a membrana e montá-lo em uma lâmina de vidro para imagens de campo claro Nota: Se o di-N-butylphthalateinxylene (DPX) o meio de montagem é utilizada a inserção lavar com etanol a 100% seguido de xileno antes da remoção e a montagem da membrana. </li></ol> 4.2. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) <ol><li> Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de PFA em PBS durante 20 min. Lavar três vezes em PBS. </li><li> Pós-fixar as membranas durante 30 min em 1% (w / v) De tetróxido de ósmio em 2 O. MQH </li><li> Lavar as inserções em água (secção 4.1.3) e desidratar em um gradiente crescente de etanol (50%, 70%, 90% durante 5 min cada, em seguida 3x com etanol a 100% durante 10 min cada intervalo). </li><li> Trate inserções desidratadas com uma mistura de hexametildisilazano (HMDS): etanol (1:2, em seguida, 02:01 por 5 min). </li><li> Trate inserções com 100% de HMDS para 5 min, ar seco e armazenar em condições dessecadas. </li><li> Retirar a membrana utilizando um bisturi (corte em torno do bordo da membrana). Examine as membranas por microscopia eletrônica de varredura. </li></ol> 4.3. Imunofluorescência <ol><li> Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de PFA em PBS durante 20 minutos, lavar uma vez em solução salina tamponada com Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 154 mM, 0,22 um filtrado). </li><li> Realizar imunocoloração das células na membrana de inserir tal como previamente descrito 26. </li><li> Retirar a membrana utilizando um bisturi (corte em torno do bordo da membrana) e montá-lo em agslides moça com fluorescência meio de montagem. Examinar membrana por microscopia fluorescente. </li></ol>

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</ol>

Autores têm nada a revelar.

A investigação médica em patologias do cérebro sofre muita dificuldade translacional. Na área de acidente vascular cerebral isquêmico agudo, por exemplo, muitas drogas que mostrou uma grande promessa em modelos animais falharam na clínica 38,39. As razões para estes resultados decepcionantes são diversas e incluem infidelidade dos sistemas de testes pré-clínicos com o cenário traçado humana e sobreavaliação dos resultados obtidos a partir de estudos com animais 21. Uma estratégia para melhorar o va...

A certificação é uma interface especializada entre a circulação de sangue periférico e o sistema nervoso central, fundamentalmente responsável para a manutenção da homeostasia do cérebro. Ele compreende células distintas cerebrais microvasculares endoteliais (BEC), que são funcionalmente influenciada por alguns componentes celulares e acelulares (abaixo) para formar uma passagem apertada e dinâmico para o cérebro. Sob condições fisiológicas, a certificação restringe a passagem de células do sangue, componentes do plasma e de substâncias nocivas, todos potencialmente neurotóxicos, no cérebro. Em paralelo, a certificação troca selectivamente iões e nutrientes essenciais (glucose e aminoácidos) e produtos residuais do metabolismo entre o cérebro e a circulação de manter com precisão o ambiente cerebral 1,2. Em anos recentes torna-se evidente que a falha da certificação ocorre numa variedade de patologias cerebrais crónicas, tais como as doenças neurodegenerativas ou inflamatórias relacionadas com (por exemplo, doença de Alzheimer e multiple esclerose, respectivamente) 3, bem como em condições agudas, como acidente vascular cerebral isquémico 4. As propriedades únicas BBB de células endoteliais cerebrais (CEBs) são largamente induzida pelo ambiente cerebral 5, e em particular por astrócitos 6,7. Existe um consenso crescente de que outros tipos de células, tais como pericitos 8, neurónios e microglia 1,3, bem como a membrana de base 9, suportar BEC e formam em conjunto uma unidade funcional denominada &quot;unidade neurovascular&quot; (NVU) que simultaneamente casais neuronal demandas metabólicas aos seus capilares que abastecem 10. O envolvimento do BBB em situações patológicas subjaz inúmeras tentativas de desenvolver em modelos in vitro de BBB para ajudar na investigação relacionada com a certificação 11,12. Estes modelos pretendem imitar o mais próximo possível in vivo de BBB características de acordo com o princípio NVU. In vitro </em&gt; modelos de BBB geralmente dependem de uma monocamada de BECs tight-formadoras de junção (principalmente de bovinos 13, humano 14, 15 rato, rato 16 e suínos 17,18 origens), cultivadas em uma membrana porosa, juntamente com astrócitos apoio (extensivamente revistos por Deli et al., 2005 11). Os astrócitos podem ser cultivadas em condições de não-contacto na parte inferior de uma cultura de tecidos bem, separado BEC (cultivadas na superfície superior da membrana) pelo meio de cultura ainda comunicar com CEBs através factores solúveis 16. Em modelos mais avançados que melhor se assemelham à estrutura anatómica do BBB in vivo, os astrócitos são mantidas em condições de contacto e cultivadas directamente no lado oposto da membrana em estreita proximidade com CEBs 13,15,17 (Figura 1). Esta configuração permite o contato físico entre BEC e astrócitos, criado quando o projeto astrócitosseus processos, através da membrana porosa. É importante ressaltar que para um verdadeiro contato para ocorrer os poros devem ser ≥ 1 Hm de diâmetro, desde astrocitárias finais pés não podem passar por poros menores (ou seja, 0,4 mM) 14,15. Notavelmente, os sistemas de contato de BBB são demonstradas em alguns estudos a ser superiores aos seus equivalentes não-contato em relação à sua resistência elétrica trans-endotelial (TEER) e valores de permeabilidade endoteliais de vários traçadores 13,17,18. Uma dimensão adicional de fluxo de meio foram adicionadas recentemente em um certo número de modelos in vitro de BBB para aplicar forças de cisalhamento ao endotélio para a simulação mais próxima da vasculatura cerebral 12,19. Um dos obstáculos técnicos que superada quando a gerar um modelo de contacto certificação é a semeadura de astrócitos contra a gravidade na superfície abluminal da membrana porosa. 13,20 protocolos anteriores, em que os astrócitos foram simplesmente semeadas numa gota de meios no topo de uma eminserção convertida, permitiu vezes só curto semeadura (isto é, 10 min 13 ou 2 horas 20) que foram encontrados em nossas mãos para ser insuficiente para a fixação das células adequado. Usando este método básico, um período mais longo apego astrocyte requer monitoramento constante das inserções de abertura freqüente da incubadora (causando flutuações de temperatura, pH e umidade) e também é propenso a semeadura de células irregulares devido a fugas de meios através dos poros, especialmente se poros maiores do que 1 mícron são empregues. Aqui, nós descrevemos um protocolo geral para a elaboração de um modelo de certificação contato. Nosso procedimento inclui um método alternativo para a célula-semeadura em inserções invertidos, que trata das limitações acima mencionadas. O método permite a adesão sem perturbações dos astrócitos na superfície abluminal membrana, num incubador equilibrado, por um período de tempo prolongado. Como resultado, uma sementeira uniformes de astrócitos é alcançada o que aumenta a qualidade de barreirae minimiza as variações de permeabilidade basais entre inserções. Como o uso de células humanas é importante para a investigação humana relevante 21, que adicionalmente demonstrar neste artigo a utilização específica de uma nova combinação de BECs humanos primários e imortalizado astrócitos humanos para a criação de um modelo de certificação contato humano com uma capacidade de rastreio de alto rendimento . Desde a visualização de células em membranas porosas podem ser difíceis, nós também técnicas de coloração de detalhes que podem ajudar na determinação da confluência e morfologia das células nas membranas porosas. Finalmente, exemplificam como nosso modelo de certificação humano pode ser utilizado para examinar o efeito do tipo de ativador do plasminogênio tecidual (t-PA) - uma enzima coágulo rebentando que serve como uma opção de tratamento único para o AVC isquêmico agudo - no BBB.

<table><tbody><tr><td>Fator de Ligação</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-210</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliais microvasculares cerebrais (BECs), primárias, humanas</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Meio completo</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-500</td><td>Suplementado com CSC JetFuel</td></tr><tr><td>Meio completo sem soro</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>SF-4Z0-500</td><td>Suplementado com CSC RocketFue</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 com 15 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de crescimento de células endoteliais (de origem bovina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Tubo externo de silicone</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A080.016</td><td>Marca Pumpsil, diâmetro interno de 8 mm, parede de 1,6 mm</td></tr><tr><td>Soro fetal para bezerros</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Pfizer</td><td></td><td>1.000 U/ml</td></tr><tr><td>Hexametildisilazano (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4875</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliais microvasculares do cérebro humano</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Tubo interno de silicone</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A032.016</td><td>Marca Pumpsil, diâmetro interno de 3,2 mm, parede de 1,6 mm</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s solução de hematoxilina</td><td>Amber Scientific</td><td>MH</td><td></td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo com Earle' s solução salina balanceada</td><td>HyClone Laboratories</td><td>SH30244.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de rato I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Marca Cultrex</td></tr><tr><td>Inserções de cultura de tecidos</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3472</td><td>Marca Transwell, 6,5 mm de diâmetro, com membrana porosa de poliéster, 3 &micro; m tamanho de poro</td></tr></tbody></table>

melhoria da metodologia para a elaboração de um baseado em celular, contact modelo humano da barreira hemato-encefálica

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

A barreira sangue-cérebro (BBB) ​​compreende impermeáveis ​​mas adaptáveis ​​capilares do cérebro que controlam o ambiente fortemente cérebro. A falha da certificação tem sido implicada na etiologia de várias patologias cerebrais, criando uma necessidade de desenvolvimento de humano em modelos in vitro de BBB para ajudar na investigação clinicamente relevante. Entre os numerosos modelos de BBB, até agora descritos, uma estático (sem fluxo), contactar modelo certificação, em que os astrócitos e as células endoteliais do cérebro (CEBs) são co-cultivadas nos lados opostos de uma membrana porosa, emergiu como um sistema ainda autêntica simplificado para simular o BBB com capacidade de rastreio de alto rendimento. No entanto, a geração de tal modelo apresenta alguns desafios técnicos. Aqui, descrevemos um protocolo para a elaboração de um modelo de certificação contato humano, utilizando uma nova combinação de BECs humanos primários e astrócitos humanos imortalizados. Especificamente, detalhamos um método inovador para a célula-semeadura em inserções invertidas, bem como especificar insert técnicas de coloração e exemplificar como usamos o nosso modelo de investigação relacionada com a certificação.

A fim de estabelecer um ser humano, o modelo de contato BBB tínhamos de cultivar SVGs e BEC em membranas porosas com um 3 mM poros de tamanho, mostrado para permitir a passagem de astrócitos finais pés para o contato com as células endoteliais 14,15,27,28. Uma representação esquemática do modelo de contacto completa está ilustrada na figura 1 (figura da esquerda). O principal desafio técnico apresentado por um sistema de contacto é a necessidade de semear astrócitos contra a gravidade na supe...

Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Este procedimento tem como objetivo a simulação in vitro da barreira hematoencefálica por meio do cultivo conjunto de astrócitos e células endoteliais em lados opostos de uma membrana porosa. Primeiro, recubra a superfície luminal da membrana porosa com uma matriz extracelular. Proteínas como colágeno preenchem o inserto invertido com um tubo de silicone externo e um tampão interno de silicone para criar um poço removível acima da superfície abluminal da membrana.Agora, semeie as células astrogliais no inserto invertido para que adiram à superfície abluminal. Em seguida, remova a tubulação e coloque o inserto em sua orientação normal dentro de um poço contendo meio. Em seguida, semeie as células endoteliais no compartimento luminal do inserto e mantenha-as em co-cultura com os astrocítos opostos.No final, a passagem de traçadores fluorescentes ou o registro da resistência elétrica transendotelial são utilizados para medir alterações na permeabilidade da BHE in vitro em resposta a diversos agentes estimulantes. A demonstração deste procedimento será feita por Mr. Barry Nigo, pós-doutorando em meu laboratório, que, durante seu doutorado, desenvolveu este protocolo modificado de semea

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra a co-cultura de células pericitos, astrócitos e endoteliais do cérebro humano. Cada camada celular é formada separadamente e depois cultivada em conjunto, criando um sistema de três camadas que imita o arranjo celular da barreira...

Desenvolvendo um modelo de cultura de células triplas da barreira hematoencefálica humana

As células epiteliais do plexo coróide (PC) formam a barreira do líquido cefalorraquidiano (BCSFB). Um modelo in vitro do BCSFB emprega células do papiloma do plexo coróide humano (HIBCPP). Este artigo descreve a cultura e a infecção basolateral de células HIBCPP usando um sistema de inserção de filtro de cultura de células.

Um modelo baseado em células epiteliais do plexo coróide da Barreira Fluid Human Blood-cefalorraquidiano para o Estudo de infecção bacteriana do lado basolateral

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.

Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

Aqui, descrevemos o método para estabelecer um modelo de cultura de células triplas da barreira hematoencefálica baseado em células endoteliais microvasculares cerebrais humanas primárias, astrócitos e pericitos. Este modelo multicelular é adequado para estudos de disfunção da unidade neurovascular durante acidente vascular cerebral isquêmico in vitro ou para a triagem de candidatos a medicamentos.

Um Modelo de Cultura de Células Primárias Triplas da Barreira Hematoencefálica Humana para o Estudo do Acidente Vascular Cerebral Isquêmico In Vitro

Este relatório fornece protocolos para montagem, cultura de células e ensaios na plataforma μSiM para a construção de modelos de barreira hematoencefálica.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Aprenda a criar um modelo celular de contato da barreira hemato-encefálica humana usando cocultura de astrócitos e células endoteliais cerebrais. Este método melhora a adesão celular e permite estudar permeabilidade e efeitos de agentes farmacológicos.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

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