Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

Este procedimento tem como objetivo a simulação in vitro da barreira hematoencefálica por meio do cultivo conjunto de astrócitos e células endoteliais em lados opostos de uma membrana porosa. Primeiro, recubra a superfície luminal da membrana porosa com uma matriz extracelular. Proteínas como colágeno preenchem o inserto invertido com um tubo de silicone externo e um tampão interno de silicone para criar um poço removível acima da superfície abluminal da membrana.

Agora, semeie as células astrogliais no inserto invertido para que adiram à superfície abluminal. Em seguida, remova a tubulação e coloque o inserto em sua orientação normal dentro de um poço contendo meio. Em seguida, semeie as células endoteliais no compartimento luminal do inserto e mantenha-as em co-cultura com os astrocítos opostos.

No final, a passagem de traçadores fluorescentes ou o registro da resistência elétrica transendotelial são utilizados para medir alterações na permeabilidade da BHE in vitro em resposta a diversos agentes estimulantes. A demonstração deste procedimento será feita por Mr. Barry Nigo, pós-doutorando em meu laboratório, que, durante seu doutorado, desenvolveu este protocolo modificado de semeadura que temos usado para simular a barreira hematoencefálica. Tivemos pela primeira vez a ideia deste procedimento após testar métodos de semeadura mais rudimentares e enfrentar muita frustração com vazamento de meio através do inserto, bem como com volumes pequenos de meio.

Isso determinou períodos curtos e insuficientes para acomodação dos astrócitos, o que estamos tentando resolver em nosso procedimento. Coloque os insertos de cultura tecidual nas cavidades de uma placa de 24 poços. Em seguida, adicione 50 microlitros de colágeno de rato a 132 microgramas por mililitro, para revestir a superfície luminal dos insertos, e incube durante a noite em estufa úmida a 37 graus Celsius para remover qualquer resíduo ácido, lavando então ambas as faces, abluminal e luminal, dos insertos com água bidestilada.

Em seguida, inverta os insertos e encaixe suavemente um pequeno pedaço de tubo de silicone elástico ao redor da borda da membrana porosa, criando essencialmente um novo poço acima da superfície abluminal, para selar o lado inferior.

Prepare um tampão feito de tubo de silicone selado em uma extremidade com a ponta cortada de um tubo PCR de 0,2 mililitro. Agora, usando uma pinça estéril, insira o tampão de silicone na cavidade luminal e avance-o até atingir aproximadamente um a dois milímetros da membrana. Em seguida, semeie 40.000 astrócitos em 200 microlitros de seu meio de manutenção diretamente no poço de silicone acima da superfície da membrana abluminal.

Para monitorar o estado de aderência dos astrócitos, utilize uma placa-padrão de 96 poços, pois ela possui a mesma área de superfície do inserto de 6,5 milímetros e permite uma visualização mais fácil das células por microscopia de contraste de fase. Semee um volume idêntico da suspensão celular de astrócitos na placa de 96 poços. Isso será monitorado ao longo do tempo para determinar quando os astrócitos na placa de 96 poços — e, por extensão, na membrana do inserto — tiverem aderido suficientemente para manter a esterilidade.

Transporte os inserts montados entre duas placas de seis poços para minimizar a exposição ao ar não filtrado. Coloque as células no incubador para permitir que os astrócitos adiram. Coloque também a placa-controle de 96 poços no incubador neste momento.

Após cerca de quatro horas, verifique a placa de controle de 96 poços para ver se os astrócitos aderiram. Caso tenham aderido, transfira novamente o conjunto de inserto para a cabine de cultura de tecidos. Remova cuidadosamente a tubulação e as tampas de silicone externas.

Em seguida, retorne os inserts para a orientação normal e ereta em poços contendo 800 microlitros por poço de meio de manutenção de células endoteliais. Sementeie 20.000 células endoteliais cerebrais em 200 microlitros sobre a superfície luminar revestida com colágeno para co-cultivo por três dias em meio BEC sem qualquer troca de meio. Antes do experimento.

Lave os tubos e tampões de silicone em etanol antes da autoclavação para uso posterior. Para estimular a barreira hematoencefálica in vitro, primeiro substitua os meios abluminal e luminal por 600 microlitros e 100 microlitros de meio BECS sem soro, respectivamente. Aspire a lavagem luminal e substitua por 100 microlitros de meio sem soro contendo agentes estimulantes.

Se for induzir a BHE in vitro a partir do compartimento astrocitário, aspire o meio abluminal e substitua por 600 microlitros de meio livre de soro. Incube com agentes estimuladores e prossiga com os ensaios padrão de permeabilidade paracelular ou transcelular dos traçadores marcados para estabelecer um modelo humano de barreira hematoencefálica por contato. Astócitos imortalizados humanos e células endoteliais cerebrais são cultivados em membranas porosas de três mícrons, que permitem a passagem dos astrócitos e de seus pés para contato com as células endoteliais.

O método permitiu um período de semeadura contínuo e ideal de astrócitos e BECs, que por sua vez aderem fortemente à superfície porosa com perda celular mínima e atingem confluência em três dias. Após a semeadura, ambos os tipos celulares mantêm seus marcadores específicos nas membranas porosas, conforme indicado pelos padrões de expressão da proteína glial fibrilar ácida GFAP nos SVGs e do fator de von Willebrand VWF nos NECs.

Conforme a característica mais fundamental de um modelo de BHE de contato, o NFE astrocítico pode passar pelos poros de três mícrons em direção ao compartimento luminar. Assim, o contato pode potencialmente ocorrer entre SVGs e BES assentadas em poros dessa dimensão. Além disso, a imagem de MEV indica que SVGs e BBCs foram capazes de crescer diretamente sobre os poros da membrana, um fenômeno que contribui artificialmente para a função de barreira física dos modelos de contato de BHE in vitro.

Neste estudo, utiliza-se o modelo humano de BBB com contato celular para explorar o efeito do agente fibrinolítico TPAA sobre a BBB. Esses estudos in vitro confirmam que a TPA, de fato, aumentou a permeabilidade da BBB intacta de maneira dependente da concentração e do tempo, ambos dentro de uma faixa farmacologicamente relevante. Alterações morfológicas acentuadas em astrócitos SVG são evidentes nas membranas porosas após exposição à TPA, sugerindo que a resposta astrocitária à TPA subjaz à abertura da BBB induzida pela TPA.

Este método desempenhou um papel fundamental em nossa pesquisa, cujo objetivo era investigar como a barreira hematoencefálica responde ao medicamento trombolítico TPAA utilizado em pacientes com acidente vascular cerebral para dissolver coágulos sanguíneos. Esta é a primeira demonstração deste método na literatura, e esperamos que outros pesquisadores possam adotá-lo para seus próprios fins.