Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

Este procedimento visa uma simulação in vitro da barreira hematoencefálica por meio da cocultura de astrócitos e células endoteliais em lados opostos de uma membrana porosa. Primeiro cubra a superfície luminal da membrana porosa com uma matriz extracelular. Proteínas como o colágeno se encaixam na inserção invertida com um tubo de silicone externo e um tampão de silicone interno para criar um poço removível acima da superfície abluminal da membrana.

Agora semeie as células dos astrócitos na inserção invertida para que elas adiram à superfície abluminal. Em seguida, remova o tubo e coloque o inserto em sua orientação normal dentro de um poço cheio de meio. Em seguida, semeie as células endoteliais no compartimento luminal da inserção e co-cultive com os astrócitos opostos.

Em última análise, a passagem de traçadores fluorescentes ou o registro da resistência elétrica transendotelial é usada para medir as mudanças de permeabilidade na BHE in vitro em resposta a vários agentes estimulantes. Demonstrando este procedimento estará o Sr. Barry Nigo, um pós-doutorado em meu laboratório, que durante o curso de seu doutorado, desenvolveu este protocolo de semeadura modificado que usamos para simular a barreira hematoencefálica. Tivemos uma ideia desse procedimento pela primeira vez depois de testar métodos de assentamento mais rudimentares e ter muita frustração com o vazamento de meio durante a pausa, bem como pequenos volumes de meios.

Isso ditou períodos curtos e insuficientes de assentos de astrócitos, que estamos tentando resolver em nosso procedimento. Coloque as inserções de cultura de tecidos nos poços de uma placa de 24 poços. Em seguida, adicione 50 microlitros de 132 microgramas por mililitro de colágeno de rato, um para revestir a superfície luminal das inserções, incube durante a noite em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius para remover qualquer ácido residual, lave os lados abluminal e luminal das inserções com água destilada duplamente.

Em seguida, inverta as inserções e encaixe suavemente um pequeno pedaço de tubo de silicone elástico ao redor da borda da membrana porosa. Essencialmente, criando um novo poço acima da superfície abluminal. Para selar a parte inferior.

Prepare um tampão feito de tubo de silicone selado em uma extremidade com a ponta cortada de um tubo de PCR de 0,2 mililitro. Agora, usando uma pinça estéril, insira o plugue de silicone na cavidade luminal e avance-o até atingir aproximadamente um a dois milímetros da membrana. Em seguida, 40.000 astrócitos em 200 microlitros de seu meio de manutenção diretamente no silicone bem acima da superfície da membrana abluminal.

Para monitorar o estado de aderência dos astrócitos, use uma placa padrão de 96 poços, pois tem a mesma área de superfície que o inserto de 6,5 milímetros e permite. Visualização mais fácil das células por microscopia de contraste de fase semente, um volume idêntico da suspensão de células de astrócitos na placa oito de 96 poços. Isso será monitorado ao longo do tempo para determinar quando os astrócitos no poço 96 e, por extensão, na membrana de inserção aderiram o suficiente para manter a esterilidade.

Transporte as pastilhas montadas entre duas placas de seis poços para minimizar a exposição ao ar não filtrado. Coloque as células na incubadora para permitir que os astrócitos adiram. Coloque também a placa de controle 96 Well na incubadora neste momento.

Após cerca de quatro horas, verifique bem o controle 96 para ver se os astrócitos aderiram. Em caso afirmativo, transfira o conjunto da pastilha de volta para a capa de cultura de tecidos. Remova cuidadosamente o tubo e os plugues externos de silicone.

Em seguida, retorne as inserções à orientação vertical normal em poços contendo 800 microlitros por poço de meio de manutenção de células endoteliais. Veja 20.000 células endoteliais cerebrais em 200 microlitros na co-cultura da superfície luminal revestida de colágeno por três dias em meio BEC sem qualquer alteração de meio. Antes da experimentação.

Lave os tubos e plugues de silicone em etanol antes de autoclavar para uso posterior. Para estimular a barreira cerebral sanguínea in vitro, primeiro substitua os meios abluminal e luminal por 600 microlitros e 100 microlitros de meio becs livre de soro, respectivamente. Aspire a lavagem luminal e substitua por 100 microlitros de meio livre de soro contendo agentes estimulantes.

Se induzir a BHE in vitro do compartimento astrocítico, aspire o meio abluminal e substitua por 600 microlitros de soro livre. O meio contendo agentes estimulantes continua com os ensaios de permeabilidade paracelular ou transcelular padrão dos marcadores de marcação, a fim de estabelecer um modelo de barreira hematoencefálica de contato humano. Os astrócitos humanos imortalizados e as células endoteliais cerebrais são cultivados em membranas porosas de três mícrons que permitem a passagem de astrócitos e pés para contato com células endoteliais.

O método permitiu um período de semeadura ininterrupto ideal de astrócitos e becs, que por sua vez se ligam fortemente à superfície porosa com perda celular mínima e crescem até a cofluência em três dias. Pós-semeadura. Ambos os tipos de células mantêm seus marcadores específicos celulares em membranas porosas, conforme indicado pelos padrões de expressão da proteína ácida fibrilar glial GFAP em SVGs e fator de von Vand VWF NECs.

Consistente com a característica mais fundamental de um modelo BBB de contato, o NFE astrocítico pode passar pelos poros de três mícrons para o compartimento luminal. Assim, pode potencialmente existir contato entre SVGs e BES assentados em poros dessa dimensão. Além disso, a imagem SEM indica que SVGs e BBCs foram capazes de crescer diretamente sobre os poros da membrana, um fenômeno que contribui artificialmente para a função de barreira física dos modelos de contato BBB in vitro.

Neste estudo, o modelo BBB de contato humano é usado para explorar o efeito do agente fibrinolítico TPAA na BBB. Esses estudos in vitro confirmam que o TPA realmente aumentou a permeabilidade do BBB intacto de maneira dependente da concentração e do tempo, ambos dentro de uma faixa farmacológica relevante. Mudanças morfológicas dramáticas dos astrócitos SVG são evidentes nas membranas porosas após a exposição ao TPA, sugerindo que a resposta astrocítica ao TPA está subjacente à abertura do BBB induzida pelo TPA.

Este método desempenhou um papel fundamental em nossa pesquisa, que teve como objetivo investigar como a barreira hematoencefálica responde ao medicamento trombolítico TPAA usado em pacientes com AVC para dissolver coágulos sanguíneos. É a primeira demonstração desse método na literatura, e esperamos que outros pesquisadores possam adotá-lo para seus próprios propósitos.