Um modelo baseado em células epiteliais do plexo coróide da Barreira Fluid Human Blood-cefalorraquidiano para o Estudo de infecção bacteriana do lado basolateral

O objetivo geral deste método é gerar um modelo baseado em células epiteliais do plexo coróide da barreira sanguínea-líquido cefalorraquidiano humano. Possibilitando o estudo de infecções bacterianas do lado basal-lateral. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre doenças infecciosas do Sistema Nervoso Central, como quais processos estão envolvidos durante as interações bacterianas com o epitélio do plexo coroide.

A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a análise das interações dos patógenos com o lado preto lateral basal das células epiteliais. Este método também pode ser aplicado a outros estudos, como a investigação da transmigração das células imunes e células tumorais através do epitélio do plexo coróide. Tive a ideia de usar o papiloma do plexo corcoide humano, ou células HIBCCP para esse método, quando li o manuscrito de 2005 de Shibata et.al.

descrevendo a linhagem celular. Comece usando uma pinça estéril para colocar inserções de filtro de cultura de células de área de crescimento de 0,33 centímetros quadrados, com poros de três mícrons de cabeça para baixo em poços individuais de uma placa de doze poços. Em seguida, com uma pipeta sorológica, inundar o poço com cerca de três mililitros do meio pré-aquecido, aspirando qualquer solução extra, até que o compartimento inferior esteja cheio.

Em seguida, adicione 100 micrômetros de meio de subcultura de 37 graus suplementado com dez por cento de FCS na parte superior do filtro. Ao adicionar o meio, é muito importante evitar a geração de bolhas de ar, pois as bolhas impedirão que as células sejam alimentadas o suficiente. Quando o meio tiver sido adicionado a todas as inserções, cubra a placa e transfira as inserções para uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius e cinco por cento.

Agora, lave um frasco de células HIBCPP com dez mililitros de PVS, duas vezes com redemoinho. Após a segunda lavagem, adicione três mililitros de EDTA tripsyn a 0,25% às células e agite o frasco. Em seguida, incube as células por cerca de vinte minutos.

No final da incubação, confirmar se as células se levantaram do fundo do balão e apresentam uma forma redonda. As células não se separam completamente umas das outras e são freqüentemente encontradas em aglomerados. Ressuspenda a cultura com 17 mililitros de meio para interromper a reação e transfira a suspensão para um tubo de 50 mililitros.

Em seguida, gire as células e ressuspenda o pellet em um volume apropriado de meio para contagem. Em seguida, dilua as células para uma concentração de uma vez dez elevado à sexta células por mililitro e inverta o tubo para distribuir uniformemente as células. Em seguida, adicione 80 microlitros de células ao topo de cada inserção de filtro.

Quando todas as inserções tiverem sido semeadas, cubra a placa e devolva-a à incubadora para cultura durante a noite. No dia seguinte, adicione um mililitro de meio a cada poço de uma placa de 24 poços. Em seguida, usando uma pinça, levante cada inserto e descarte o meio dentro, colocando os insertos com o lado direito para cima em poços individuais da placa de 24 poços.

Quando as inserções do filtro são viradas da placa de 12 poços para a placa de 24 poços, tome cuidado para não tocar na membrana do filtro com as células crescendo no topo. Encha as inserções com 0,5 mililitros de meio fresco e retorne a placa à incubadora. Transfira as inserções para uma nova placa de 24 poços com meio fresco a cada dois dias, substituindo assim o meio no compartimento superior.

Para medir a resistência elétrica transepitelial, ou TEER das células, primeiro mergulhe as pontas dos eletrodos de um voltímetro de ohm de tecido epitelial em 80% de etanol. Após 15 minutos, remova o eletrodo do etanol para permitir que o eletrodo seque. Em seguida, coloque as pontas em uma alíquota de meio de subcultura por mais 15 minutos.

Quando o eletrodo estiver equilibrado, posicione o braço mais longo de modo que toque o fundo do compartimento inferior de um poço da placa de cultura de células e o braço mais curto de modo que alcance o compartimento de inserção do filtro. Meça os valores de resistência das inserções do filtro de cultura de células em meio sem células para obter os valores em branco. Em seguida, meça o TEER de cada uma das pastilhas semeadas.

Após a medição, coloque o eletrodo de volta em etanol a 80% por 15 minutos, seguido de armazenamento em um tubo seco. Quando os valores de TEER das pastilhas semeadas por HIBCPP excederem 70 ohms por centímetro quadrado, renove o meio usando meio de cultura fresco suplementado com cinco microgramas por mililitro de insulina e um por cento de FCS e devolva a placa à incubadora de cultura de células durante a noite. Para determinar a permeabilidade paracelular das culturas de inserção, adicione 50 microgramas por mililitro de inulina FITC recém-preparada em meio de cultura baixo de soro fresco ao compartimento superior do filtro de cada inserção e retorne as células à incubadora.

Quando as culturas atingirem um TEER de cerca de 500 ohms por centímetro quadrado, infectar as células com uma suspensão bacteriana de interesse em uma multiplicidade de infecção de dez e retornar as células à incubadora para o período de cultura apropriado. Em seguida, lave as células três vezes, transferindo o filtro para um novo poço com um mililitro de meio sem soro. A cada vez, coloque o meio no compartimento do filtro com 500 micro litros do mesmo meio, finalmente, determine a concentração de inulina que passou do compartimento do filtro através da camada celular após a infecção bacteriana, coletando amostras do meio do poço inferior de cada inserção de filtro de cultura de células e medindo todas as amostras em um leitor de microplacas contra dez diluições padrão de um e dois FITC-inulina.

As células HIBCCP exibem funções de barreira específicas que lhes permitem restringir suas trocas moleculares em um grau modesto. Por exemplo, análises de imunofluorescência da junção-tipo associada à proteína, ZO-1, Oclusina e Claudina-1, revelam um sinal ininterrupto nos locais de contato célula a célula. Ilustrando a interconexão das células por filamentos contínuos de junções apertadas.

Quando cultivadas sob as condições apropriadas, as células HIBCPP exibem um alto potencial de membrana, que atinge até cerca de 500 ohms por centímetro quadrado sem tratamento, mantendo as funções de barreira típicas da barreira do líquido cefalorraquidiano, como a formação de um potencial de membrana, bem como uma baixa permeabilidade para macromoléculas. À medida que concentrações crescentes de DMSO são aplicadas, no entanto, os valores de TEER diminuem de maneira dose-dependente, com uma queda significativa semelhante no valor de TEER observada após o tratamento com citocalasina D. Além disso, a adição de dois por cento de volume de DMSO, ou citocalasina D, resulta em um aumento significativo de permeabilidade correspondente para o fluxo de FITC -inulina.

Além disso, a infecção bacteriana das células HIBCCP resulta em uma invasão significativa da camada celular por duas cepas bacterianas patogênicas. MC58 e seu mutante deficiente em cápsula. Considerando que apenas uma pequena invasão é observada para a cepa alfa 14 apatogênica.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não tocar na membrana do filtro após semear as células, pois a camada intacta de HIBCCP será interrompida pelo contato. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de transmigração in vitro, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre os mecanismos de migração de células imunes e tumorais através das células epiteliais do plexo coróide. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da farmacologia da área explorarem a transferência de substratos através do epitélio do plexo coróide in vitro.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar um modelo baseado em células HIBCCP da barreira do líquido cefalorraquidiano no sangue para infecção lateral basal com patógenos. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos humanos pode ser extremamente perigoso e que precauções como trabalhar sob um capuz de segurança adequado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.