Name: Um modelo baseado em células epiteliais do plexo coróide da Barreira Fluid Human Blood-cefalorraquidiano para o Estudo de infecção bacteriana do lado basolateral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a gerar um modelo de barreira hemato-liquórica usando células epiteliais do plexo coróide HIBCPP para estudar infecções bacterianas pelo lado basolateral. Este método permite analisar interações patógeno-epitélio.

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Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Hartwig Wolburg por realizar a microscopia eletrônica.

1. Prepare Cultura celular filtro Incorporações nas células Sementeira HIBCPP em um sistema invertido Modelo <ol><li> Pré-aquecido DMEM / F12 (HAM) suplementado com 5 ug / ml de insulina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de vitelo (FCS). </li><li> Use fórceps estéreis para colocar 0,33 cm² inserções de filtro de cultura de células da área de crescimento com um tamanho de poro de 3 um de cabeça para baixo em uma placa de 12 poços (Figura 1E). </li><li> Encha meio para dentro do compartimento inferior do cartucho do filtro de cultura de células (cerca de 3 ml) e 100 ul de topo do elemento do filtro. Inundar a placa, bem como o compartimento inferior com forma. Aspirar o meio excessiva de tal maneira que o compartimento inferior do inserto filtro fica cheio (Figura 1E). Nota: Recomenda-se a utilização de uma pipeta sorológica para esta etapa. </li><li> Cubra placa de 12 poços, com a tampa e transferir as inserções de filtro preparados de cultura de células para a incubadora, a 37 ° C,5% de CO 2 até adição de células. </li></ol> 2. Cultivo e Passaging de células HIBCPP <ol><li> Prepare DMEM / F12 (HAM) suplementado com 5 ug / mL, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de FCS. </li><li> Pré-quente médio e PBS em banho-maria C 37 °. médio aspirado da garrafa. Adicionar 10 ml de PBS ao balão e redemoinho. Repita este passo uma vez. </li><li> Adicionar 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA para o balão e redemoinho. Colocar na incubadora, a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Após aproximadamente 20 min retirar o balão da incubadora. Certifique-se de que as células são destacadas do fundo do frasco e apresentar uma forma redonda quando pesquisados ​​com o microscópio. Nota: As células não separe completamente uma da outra e são muitas vezes encontrados em aglomerados. Recomenda-se usar as células-se à passagem 38. </li><li> Para parar tripsinização adicione 17 ml de meio. Volte a suspender as células por pipetagem cima e para baixo e transferir a suspensãopara um tubo de 50 ml. Centrifugar a 50 xg durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células num volume apropriado de meio e contar as células utilizando um hemocitómetro. Nota: A concentração de células ressuspensas HIBCPP deve ser de 1 x 10 6 células / ml. Para a manutenção de células HIBCPP sugere-se a transferir uma quantidade de 1-6 x 10 6 células em 10 ml de meio para um frasco de T75-. Mudança do meio cada segundo dia. </li></ol> 3. Sementeira Cultura de Células invertido filtro inserções com células HIBCPP <ol><li> No topo de cada elemento do filtro invertido (isto é, o lado inferior do filtro) adicionar 80 ul de suspensão de células (isto é. 8 x 4 10 células) (Figura 1E). Nota: Certifique-se de que as células são distribuídas uniformemente na suspensão invertendo o tubo antes da semeadura. </li><li> Cobrir as inserções de filtro de cultura de células inoculada com a tampa da placa de 12 poços e transferência para a incubadora, a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> No primeiro dia, preencher 1 ml de meio em poços de uma placa de 24 poços. Levantar as inserções de filtro de cultura de células usando uma pinça para fora da placa de 12 poços, descartar a forma interior, por sua vez as inserções de filtro e colocá-los no padrão de orientação na placa de 24 poços preparados (Figura 1E). </li><li> Colocar as células em meio fresco a cada segundo dia. Preparar 24 cavidades com meio fresco e transferir as inserções de filtro a ele. Preencha inserções com 0,5 ml de meio fresco. Verifique TEER todos os dias, como descrito no ponto 4. </li><li> Quando os valores de TEER HIBCPP de células semeadas em inserções de cultura celular for superior a 70 Ω x cm (cerca de 4 dias após a sementeira), em seguida, continuar a cultura de células em meio contendo 1% de FCS e 5 ug / ml de insulina. Prepare a placas de 24 cavidades com 1 ml de meio para cada poço. Transferir inserções de filtro para os recipientes preparados e meio de permuta no compartimento superior. Nota: Esta retirada soro após confluência leva à formação deum potencial de membrana superior. </li><li> médio aspirado do compartimento do filtro, transferir para o bem preparado e encher com 500 ï¿½ de meio. Repita este passo uma vez. Coloque as células durante a noite na incubadora, a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 4. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER) <ol><li> Mergulhar as pontas dos eléctrodos da voltohmmeter tecido epitelial durante 15 min em etanol a 80%. Transferir voltohmmeter sob o capô e deixá-eletrodo seco por um momento. Coloque eléctrodo no respectivo meio de cultura utilizado para as células por mais 15 minutos para equilibrar. </li><li> Realizar medições ao posicionar o braço mais longo do eléctrodo de modo que toque o fundo do compartimento inferior de cada vez, colocar o braço mais curto no compartimento de cartucho do filtro. Nota: Os valores de resistência de elementos filtrantes de cultura de células sem células em meio deve ser usado como valores em branco ((valor medido (Ω) - valor em branco (Ω)) x filtrosuperfície (isto é, 0,33 cm)). </li><li> Após a medição Coloque o eletrodo de volta para 80% de etanol para 15 min. Armazenar em um tubo seco. </li></ol> 5. Determinação do paracelular Permeabilidade <ol><li> Dissolve-se 1 g de FITC-inulina em 200 ml de meio de cultura suplementado com 5 ng / ml de insulina 1% de FCS. Aplicar 50? G / ml da solução para dentro do compartimento do filtro superior antes da infecção das células. </li><li> Após a infecção recolher amostras de meio do poço inferior para determinar a quantidade de inulina passada do compartimento do filtro através da camada de células. </li><li> Prepara-se uma solução padrão de FITC-inulina e executar 1: 2 diluições, 10 vezes (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% e 0%) . Determinar a fluorescência por medição de todas as amostras em leitor de microplacas. </li></ol> 6. Preparação de bactérias para a infecção de células HIBCPP numa cultura de células de filtro Inserções <ol><li> Um dia antes do experimento, raspar tele N. congelada meningitidis estirpes fora de uma glicerol-estoque e raia para fora em Agar Chocolate com Vitox. Crescer durante a noite na incubadora, a 37 ° C, com 5% de CO 2. </li><li> Extrair 20-30 colónias a partir da cultura durante a noite e transferir para um tubo contendo 8 ml Proteose Peptona meio suplementado com 0,042% de NaHCO 3, 0,01 M de MgCl2 e 1% Polyvitex. </li><li> Agitar as bactérias durante 1,25 h a 220 rpm, 37 ° C. Sedimentar as bactérias por centrifugação a 2684 g durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento bacteriano com meio isento de soro de 8 ml. Vortex para assegurar uma suspensão uniforme. </li><li> Para determinar a densidade da cultura, medida uma diluição de 1:10 a uma densidade óptica (OD) de 600 nm. Ajustar a suspensão bacteriana para uma DO 600 de 0,1. Nota: Esta suspensão contém aproximadamente. 1 x 10 8 UFC / ml. </li><li> Para confirmar a concentração de células bacterianas, dilui-se a suspensão por passos (01:10) até umdiluição de 10 ~ 5 e placa em placas de agar de chocolate. Nota: diluições em série similares precisam ser executadas para calcular curvas de crescimento bacteriano. </li></ol> 7. A infecção de células HIBCPP em inserções de filtro cultura de células e determinação da invasão bacteriana por imunofluorescência Duplo <ol><li> Após continuar a cultura de células em meio contendo 1% de FCS e 5 ug / ml de insulina, as células medir todos os dias utilizando um voltohmmeter tecido epitelial. Se as células atingiram um TEER de cerca de 500 Ω x cm², realizar a infecção. </li><li> Infectar as células com a suspensão bacteriana preparada a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. loja as células infectadas na incubadora, a 37 ° C, com 5% de CO 2 durante o período de tempo indicado. Nota: O MOI pode ser calculado tendo em conta o número de células por inserção do filtro de cultura de células em confluência (1,21 X 10 6 células / cm2). </li><li> Pare o Infectião por lavagem três vezes com meio isento de soro de 500 ul (SFM) contendo albumina de soro bovino 1% (BSA) aplicada ao compartimento do filtro, de 1 ml para o compartimento inferior. </li><li> Bloquear com 500 ul de SFM contendo 1% de BSA em tampão de compartimento do filtro e 1 ml no compartimento inferior durante 20 min a temperatura ambiente para evitar a aderência de anticorpos para locais de ligação não específicos. </li><li> Incubar com 100 uL de anticorpo primário anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) no compartimento de filtro e 500 ul no compartimento inferior durante 20 min à temperatura ambiente. Nota: Se for necessário, a concentração de anticorpo deve ser titulada. </li><li> Lavam-se as células por aspiração a forma do compartimento do filtro, transferir o elemento filtrante a uma SFM bem com 1 mL preparada contendo 1% de BSA e encher o compartimento de filtro esvaziado com SFM 500 ul contendo 1% de BSA. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Fixar as células com 500 uL de 4% de formaldeído no compa filtrortment, 1 ml no compartimento inferior durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavam-se as células por aspiração a forma do compartimento do filtro, transferir o elemento filtrante para um poço preparado com 1 ml de PBS e encher o compartimento de filtro esvaziado com 500 ul de PBS. Repita este passo uma vez. Nota: As amostras podem ser armazenadas durante a noite em PBS a 4 ° C. </li><li> cultura de células fixadas corte filtra das inserções e lava-se com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%. Incubar as células durante 15 minutos à temperatura ambiente com 250 ul marcado fluorescente (comprimento de onda de excitação 594 nm) derivado do anticorpo de galinha anti-coelho (1: 500) para corar bactérias extracelulares. Nota: Se for necessário, a concentração de anticorpo deve ser titulada. </li><li> Permeabilizar as células com 250 ul de PBS contendo 1% de BSA e 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave as células três vezes com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%. </li><li> Incubar com 250 uL de anticorpo primário anti N. meningitidis </em&gt; α-OMP (1: 200) durante 30 minutos para corar bactérias extra e intracelulares. Lave as células três vezes com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%. </li><li> Aplicar 250 ul de marcação fluorescente (comprimento de onda de excitação de 488 nm) anticorpo secundário (1: 500), marcado fluorescente (comprimento de onda de excitação de 660 nm) faloidina (1: 250) e 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) dicloridrato de ( 1: 50000) durante 1 h à temperatura ambiente para corar bactérias intracelulares e extra-, citoesqueleto de actina e núcleos. Nota: Se for necessário, a concentração de anticorpo deve ser titulada. </li><li> Lave as células três vezes com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%. Incorporar as células em meio e armazenar a 4 ° C de montagem até à sua análise por meio de microscópio. </li><li> Determinar o número de bactérias invadidas por campo predefinido. Faça isso por meio da contagem de 20 campos por membrana de filtro. Calcula-se a percentagem de bactérias invadidas. Nota: multiplicar a contagem bacteriana média dos 20 campos microscópicos com um coeffic áreatário. O resultado exprime a quantidade de bactérias totais presentes em uma inserção de cultura de células de filtro de 0,33 cm. Dividir este valor pela quantidade de bactérias cultivadas em meios durante a duração da infecção. </li></ol>

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<li>Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+T-cells+after+infection+of+human+choroid+plexus+papilloma+cells+with+Echovirus+30+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Virus Res. 170, 66-74 (2012).</li>
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<li>Dickson, P. W., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+messenger+RNA+for+transthyretin+%28prealbumin%29+in+human+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus.</a> Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).</li>
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<li>Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+may+be+an+underestimated+site+of+tumor+invasion+to+the+brain%3A+an+in+vitro+study+using+neuroblastoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines.</a> Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As células epiteliais do CP formar o BCSFB que separa o CSF a partir do sangue 2,3. Recentemente, estabeleceu a linha de células HIBCPP como um modelo humano funcional do BCSFB. As células apresentam funções de barreira importantes da BCSFB in vitro, incluindo o desenvolvimento de um potencial de membrana elevada, uma baixa permeabilidade de macromoléculas, bem como a presença de filamentos contínuos de TJs 5. As proteínas TJ contribuir para uma polaridade apical / basolateral das células....

A barreira de fluido cerebrospinal de sangue (BCSFB) é um dos três locais de barreira entre o sangue e o cérebro um. Seu correlato morfológicas são as células epiteliais do plexo coróide (CP) de 2,3, um convoluta-endotelial epitelial, que é fortemente vascularizado e localizado nos ventrículos do cérebro. A CP serve para produzir o fluido cerebrospinal (CSF), bem como para separar o último do sangue. A fim de conseguir a função de barreira, as células epiteliais CP mostram uma actividade pinocitótica baixo, expressar transportadores específicos, e estão densamente ligadas por uma rede contínua de junções apertadas (TJS) 2,3. Células do plexo coróide do papiloma humano (HIBCPP), derivados a partir de um plexo coróide do papiloma maligno de uma japonesa 4, foram utilizados para construir um modelo funcional em vitro da BCSFB. HIBCPP células mostram um par de características de um BCSFB funcional, tal como a formação de TJfios, o desenvolvimento de um potencial de membrana transepitelial alta que pode ser determinado como a resistência eléctrica transepitelial (TEER), e permeabilidades menores para macromoléculas. Além disso, as células HIBCPP expressar transportadores característicos, que podem servir para regular o micro ambiente iónico, e mostram apical / basolateral 5,6,7 polaridade. O BCSFB foi mostrado funcionar como um local de entrada para agentes patogénicos (bactérias, vírus, e fungos) no sistema nervoso central (SNC) 8. A invasão de agentes patogénicos, incluindo Neisseria meningitidis (N. meningitidis), uma bactéria Gram-negativa, podem causar doenças graves, como a meningite. A prova de que ele ultrapassa a barreira epitelial de protecção do CP é suportado por observações histopatológicas em pacientes com doença meningocócica exibindo aumento da quantidade de meningococos nos vasos e as células epiteliais 9,10 CP. Para ganhar a entrada em células hospedeiras bacteria muitas vezes mecanismos de endocitose sequestrar, que são mediados ou desencadeada pelos receptores de superfície específicos localizados nas células hospedeiras. Uma vez que as interacções dos agentes patogénicos com estes receptores pode ser espécies modelos 11, específicos dos animais só pode ser consultado em medida restrita. A linha celular HIBCPP proporciona a oportunidade de estudar o processo de invasão, bem como os mecanismos moleculares subjacentes em um sistema modelo humano. Empregando inserções de cultura de células nos permite analisar as interacções dos agentes patogénicos com células hospedeiras de dois lados celulares distintas. Muitas bactérias, incluindo N. meningitidis, são fortemente sujeito ao impacto da gravidade durante ensaios de infecção. Para optimizar a interacção dos agentes patogénicos com as células HIBCPP durante os ensaios, as bactérias são inicialmente adicionado para dentro do compartimento superior do sistema de cartucho filtrante de cultura de células. Para permitir que a infecção do lado apical ou do lado basolateral da célula, respectivamente, duas variações do sistema in vitro têm sido ESTAestabe-: No sistema standard HIBCPP células são semeadas para dentro do compartimento superior do elemento filtrante, simulando a situação quando os microrganismos estão localizados no lado-CSF a e entrar em contacto com o lado apical das células (Figura 1 A, C). Em contraste, usando as células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de células de filtro invertido reflecte as condições quando as bactérias tenham entrado no fluxo sanguíneo. Microorganismos difundir no sangue e encontro CP células epiteliais do lado basolateral (Figura 1B e D). Digno de nota, neste sistema modelo, foi demonstrado que as bactérias invadem as células HIBCPP numa forma polar especificamente de 5,7 lado basolateral da célula. Subsequentemente à infecção do CP, os agentes patogénicos podem ser invadidos reconhecido pelo sistema imune inato através de ligação a receptores de reconhecimento de padrões (SRRS). membros bem descritas de PRRS pertencem à família dos receptores de tipo Toll (TLR). pode TLRs bind para estruturas características de microorganismos infecciosos, que são padrões moleculares associados a agentes patogénicos denominado (PAMPs). A ligação dos receptores leva à activação da célula hospedeira cascatas de sinalização que provocam a expressão de citocinas e quimiocinas 12, que por sua vez estimulam a transmigração de células imunes em todo o BCSFB 13,14. Tem sido demonstrado que as células HIBCPP expressar vários TLRs ao nível do mRNA e que a infecção com N. meningitidis resulta na secreção de várias citocinas e quimiocinas, incluindo CXCL1-3, IL6, IL8 e TNFa 15,16. Aqui, nós descrevemos o cultivo e infecção da linha celular humana HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertido que imita o BCSFB. Este sistema modelo permite estudar as interacções dos agentes patogénicos com o lado da célula in vivo, relevante basolateral, bem como a subsequente resposta celular.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4&agudo;,6 diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>placas de 12 poços</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>placas de 24 poços</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Neisseria meningitidis &alpha;-OMP</td><td></td><td></td><td>Este anticorpo foi um presente dos Drs. H. Claus e U. Vogel (Universidade de W&uuml; rzburg, Alemanha)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (frango anti-coelho)</td><td>Invitrogen</td><td>A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 (frango anti-coelho)</td><td>Invitrogen</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 660 Faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ágar chocolate</td><td>Biomerieux</td><td>43109</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES sem Phenolred</td><td>Gibco</td><td>11039-047</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulina</td><td>Sigma</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>2393</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Mg + Ca</td><td>Gibco</td><td>14040-174</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Polyvitex</td><td>Biomerieux</td><td>55651</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptona</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Meio sem soro</td><td>Gibco</td><td>10902-096</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de cultura de células mais finas para placas de 24 poços, tamanho de poro 3 &micro; m</td><td>Greiner</td><td>662630</td><td></td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos 75 cm&sup2; tampa vermelha estéril</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 com MERSSTX01 eletrodo</td><td>Millipore</td><td>MERSSTX00</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo baseado em células epiteliais do plexo coróide da barreira fluid human blood-cefalorraquidiano para o estudo de infecção bacteriana do lado basolateral

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

As células epiteliais do plexo coróide (PC), localizadas no sistema ventricular do cérebro, formam a barreira do líquido hemato-cefalorraquidiano (BCSFB). O BCSFB funciona na separação do líquido cefalorraquidiano (LCR) do sangue e na restrição da troca molecular ao mínimo. Um modelo in vitro do BCSFB é baseado em células derivadas de um papiloma do plexo coróide humano (HIBCPP). As células HIBCPP exibem funções de barreira típicas, incluindo a formação de junções apertadas (TJs), o desenvolvimento de uma resistência elétrica transepitelial (TEER), bem como pequenas permeabilidades para macromoléculas. Existem vários patógenos que podem entrar no sistema nervoso central (SNC) através do BCSFB e, posteriormente, causar doenças graves como a meningite. Um desses patógenos é Neisseria meningitidis (N. meningitidis), uma bactéria específica do ser humano. O emprego das células HIBCPP em um sistema de inserção de filtro de cultura de células invertidas permite estudar as interações de patógenos com células do BCSFB do lado da célula basolateral, o que é relevante in vivo. Neste artigo, descrevemos a semeadura e cultura de células HIBCPP em inserções de cultura de células. Além disso, é demonstrada a infecção das células com N. meningitidis, juntamente com a análise de bactérias invadidas e aderidas por imunofluorescência dupla. Como as células da PC também estão envolvidas em outras doenças, incluindo distúrbios neurodegenerativos como a doença de Alzheimer e a esclerose múltipla, bem como durante a metástase cerebral de células tumorais, o sistema modelo também pode ser aplicado em outros campos de pesquisa. Ele fornece o potencial para decifrar mecanismos moleculares e identificar novos alvos terapêuticos.

Aqui, descrevemos a cultura e infecção das células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertida. Este modelo nos permite estudar os mecanismos de invasão e as vias de sinalização molecular subjacente a partir do lado da célula basolateral, reproduzindo uma situação fisiológica de bactérias divulgação e entrar nas células epiteliais através da corrente sanguínea (Figura 1). As células HIBCPP ex...

As células epiteliais do plexo coróide (PC) formam a barreira do líquido cefalorraquidiano (BCSFB). Um modelo in vitro do BCSFB emprega células do papiloma do plexo coróide humano (HIBCPP). Este artigo descreve a cultura e a infecção basolateral de células HIBCPP usando um sistema de inserção de filtro de cultura de células.

Um modelo baseado em células epiteliais do plexo coróide da Barreira Fluid Human Blood-cefalorraquidiano para o Estudo de infecção bacteriana do lado basolateral

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

O objetivo geral deste método é gerar um modelo baseado em células epiteliais do plexo coroide da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano humana, permitindo o estudo de infecções bacterianas a partir do lado basal-lateral. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre doenças infecciosas do Sistema Nervoso Central, como quais processos estão envolvidos durante as interações bacterianas com o epitélio do plexo coroide.A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a análise das interações de patógenos com a face basal lateral preta das células epiteliais. Este método também pode ser aplicado a outros estudos, como na investigação da transmigração de células imunes e células tumorais através do epitélio do plexo coroide. Tive inicialmente a ideia de utilizar o papiloma do plexo coroide humano, ou células HIBCCP, para este método ao ler o manuscrito de 2005 de Shibata et al.descrevendo a linhagem celular. Comece utilizando pin&ccedil;as est&eacute;reis para posicionar inser&ccedil;&otilde;es de filtros para cultura celular com &aacute;rea de crescimento de 0,33 cent&iacute;metros quadrados e poros de tr&ecirc;s m&iacute;crons virados para baixo em po&ccedil;os individuais de uma placa de doze po&ccedil;os. Em seguida, com uma pipeta serol&oacute;gica, encha o po&ccedil;o com cerca de tr&ecirc;s mililitros do meio pr&eacute;-aquecido, aspirando qualquer solu&ccedil;&atilde;o em excesso, at&eacute; que o compartimento inferior esteja completamente preenchido.Em seguida, adicione 100 micrometros de meio de subcultura a 37 graus suplementado com 10% de FCS sobre o filtro. Ao adicionar o meio, é muito importante evitar a formação de bolhas de ar, pois as bolhas impedirão a nutrição adequada das células. Após a adição do meio a todos os inserts, cubra a placa e transfira os inserts para um incubador a 37 graus Celsius com 5% de CO2.Agora, lave um frasco de células HIBCPP com dez mililitros de PVS, duas vezes com movimentos de rotação. Após a segunda lavagem, adicione três mililitros de tripsina 0,25 por cento com EDTA às células e agite o frasco. Em seguida, incube as células por cerca de vinte minutos.No final da incubação, confirme que as células se desprendeu do fundo do frasco e apresentam formato arredondado. As células não se destacam completamente umas das outras e frequentemente são encontradas em aglomerados. Re-suspenda a cultura com 17 mililitros de meio para interromper a reação e transfira a suspensão para um tubo de 50 mililitros.Em seguida, centrifugue as células e re-suspenda o pellet em um volume apropriado de meio para contagem. Depois, dilua as células até uma concentração de um vezes dez à sexta células por mililitro e inverta o tubo para distribuir as células uniformemente. Então, adicione 80 microlitros de células no topo de cada inserto de filtro.Quando todas as inserções tiverem sido semeadas, cubra a placa e retorne-a ao incubador para cultivo durante a noite. No dia seguinte, adicione um mililitro de meio a cada poço de uma placa de 24 poços. Em seguida, utilizando pinças, levante cada inserção, descarte o meio interno e posicione as inserções com a face voltada para cima em poços individuais da placa de 24 poços.Ao transferir os inserts com filtros da placa de 12 poços para a placa de 24 poços, tenha cuidado para não tocar a membrana do filtro com as células que estão crescendo na superfície superior. Preencha os inserts com 0,5 mililitros de meio fresco e devolva a placa ao incubador. Transfira os inserts para uma nova placa de 24 poços com meio fresco a cada dois dias, substituindo assim o meio no compartimento superior.Para medir a resistência elétrica transepitelial, ou TEER das células, primeiro mergulhe as pontas do eletrodo de um volt-ohmímetro de tecido epitelial em etanol a 80 por cento. Após 15 minutos, remova o eletrodo do etanol para permitir que a ponta seque. Em seguida, coloque as pontas em uma alíquota de meio de subcultura por mais 15 minutos.Após a estabilização do eletrodo, posicione o braço mais longo de modo que toque o fundo do compartimento inferior de uma cavidade da placa de cultura celular, e o braço mais curto de forma que alcance o compartimento do inserto de filtro. Meça os valores de resistência dos insertos de filtro para cultura celular em meio sem células para obter os valores em branco. Em seguida, meça a resistência elétrica transepitelial (TEER) de cada um dos insertos semeados.Após a medição, coloque o eletrodo de volta em etanol a 80 por cento por 15 minutos, seguido de armazenamento em um tubo seco. Quando os valores de TER das inserções semeadas com HIBCPP excederem 70 ohms por centímetro quadrado, renove o meio utilizando meio de cultura fresco suplementado com cinco microgramas por mililitro de insulina e um por cento de FCS, e devolva a placa ao incubador de cultivo celular durante a noite. Para determinar a permeabilidade paracelular das culturas em inserções, adicione 50 microgramas por mililitro de FITC-inulina recém-preparada em meio de cultura com baixo teor de soro ao compartimento superior do filtro de cada inserção, e devolva as células ao incubador.Quando as culturas atingirem um TEER de cerca de 500 ohms por centímetro quadrado, infecte as células com uma suspensão bacteriana de interesse numa multiplicidade de infecção de dez e retorne as células ao incubador pelo período de cultura apropriado. Em seguida, lave as células três vezes transferindo o filtro para um novo poço com um mililitro de meio sem soro. A cada vez, coloque o meio no compartimento do filtro com 500 microlitros do mesmo meio. Finalmente, determine a concentração de inulina que atravessou do compartimento do filtro através da camada celular após a infecção bacteriana coletando amostras de meio do poço inferior de cada inserto de filtro de cultura celular e medindo todas as amostras em um leitor de microplacas frente a dez diluições padrão de FITC-inulina um e dois.As células HIBCCP exibem funções de barreira específicas que lhes permitem restringir suas trocas moleculares em grau modesto. Por exemplo, análises por imunofluorescência do tipo de junção associado às proteínas ZO-1, Occludina e Claudina-1 revelam um sinal contínuo nos locais de contato célula a célula, ilustrando a interconexão das células por meio de cadeias contínuas de junções apertadas.Quando cultivadas em condições apropriadas, as células HIBCPP exibem um alto potencial de membrana, que atinge cerca de 500 ohms por centímetro quadrado sem tratamento, mantendo as funções típicas de barreira da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano, como a formação de um potencial de membrana, bem como baixa permeabilidade para macromoléculas. No entanto, à medida que concentrações crescentes de DMSO são aplicadas, os valores de TEER diminuem de maneira dependente da dose, com uma queda significativa semelhante no valor de TEER observada após o tratamento com Citocalasina D. Além disso, a adição de dois por cento em volume de DMSO, ou Citocalasina D, resulta em aumento correspondente e significativo da permeabilidade ao fluxo de FITC-inulina.Além disso, a infecção bacteriana das células HIBCCP resulta em uma invasão significativa da camada celular por duas cepas bacterianas patogênicas, MC58 e seu mutante deficiente em cápsula, enquanto apenas uma invasão mínima é observada para a cepa alfa 14 apatogênica.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de não tocar a membrana de filtro após a semeadura das células, pois a camada intacta de HIBCCP será rompida pelo contato. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de transmigração in vitro, podem ser realizados para responder questões adicionais sobre os mecanismos de migração de células imunes e tumorais através das células epiteliais do plexo coroide. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de farmacologia explorarem a transferência de substratos através do epitélio do plexo coroide in vitro.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar um modelo celular baseado em HIBCCP da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano para infecção lateral basal com patógenos. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos humanos pode ser extremamente perigoso e de que precauções, como trabalhar sob uma capela de segurança apropriada, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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