Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

O objetivo geral deste método é isolar exossomos da bile humana para análises posteriores, incluindo perfis de microRNA. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da doença hepática, como a detecção de um marcador biliar específico para colangiocarcinomas ou outras doenças biliares. A principal vantagem dessa técnica é que ela é robusta e repetível.

Para realizar a colangiopancreatografia retrógrada endoscópica, ou CPRE, comece colocando o paciente em decúbito dorsal. Depois de intubar e passar um duodenoscópio pela boca do paciente, insira-o na segunda parte do duodeno e identifique a papila maior. Canule seletivamente o ducto biliar comum inserindo um esfíncterotomo de lúmen triplo pré-carregado com um fio-guia hidrofílico de 0,35 polegadas ou 0,9 milímetros.

Sob orientação fluoroscópica, avance o fio-guia para o ducto hepático esquerdo e, em seguida, avance o esfincterótomo cinco centímetros para dentro do ducto biliar para adquirir uma posição estável. Depois de remover o fio-guia, conecte uma seringa de 10 milímetros à porta do fio-guia através da trava inferior e use 10 mililitros de pressão negativa para aspirar a bile. Remova a seringa que contém a bile e, após reinserir o fio-guia, injete o agente de contraste através da porta de injeção para opacificar a árvore biliar.

Em seguida, transfira a bile coletada para um tubo de 15 mililitros no gelo e, se armazenar para um tempo posterior, centrifugue a amostra a 500 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos antes de congelar a 80 graus Celsius negativos. Para prosseguir imediatamente com o isolamento do exossomo, transfira 400 microlitros de bile para um tubo de microcentrífuga e centrifugue a 300 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos para coletar células e detritos celulares. Para limpar ainda mais o sobrenadante, transfira a solução para tubos de microcentrífuga novos e centrifugue as amostras a 16.500 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, em um gabinete de biossegurança, colete o sobrenadante em uma seringa e filtre-o através de um filtro de membrana de polietersulfona de 0,2 micrômetro para remover quaisquer partículas restantes maiores que 200 nanômetros. Transfira o sobrenadante filtrado para tubos de ultracentrífuga e use PBS para trazer os tubos até pelo menos dois terços cheios para evitar que os tubos entrem em colapso durante a centrifugação. Pulverizar os exossomas através de ultracentrifugação a 120 000 vezes g e quatro graus Celsius durante 70 minutos.

Um pequeno pellet amarelo conterá os exossomos. Rejeitar o sobrenadante por decantação cuidadosa e desinfetar os resíduos por adição de lixívia a uma concentração final de 10% vol por volume. Em seguida, deixe repousar por 20 minutos.

Para experimentos a jusante, processe os pellets em um pequeno volume de solução apropriada ou ressuspenda-os em 50 a 100 microlitros de PBS e armazene-os a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Depois de preparar grades de vesículas extracelulares coradas com contraste, ou EVs, de acordo com o protocolo de texto, adquira imagens com um microscópio eletrônico usando uma tensão de aceleração de 80 quilovolts começando com ampliações de 20.000 X e aumentando para 100.000 X, ao determinar o tamanho das partículas. Os exossomos são muito pequenos para serem detectados por microscopia regular ou citometria de fluxo; no entanto, esta figura mostra os resultados de uma análise típica de rastreamento de nanopartículas, ou NTA, de exossomos que medem a concentração e a distribuição de tamanho, que teve uma média de 97 nanômetros nesta amostra isolada de bile humana.

A microscopia eletrônica também pode ser usada para confirmar o tamanho das partículas isoladas na bile humana e esta figura mostra um resultado típico de transmissão EM. Esses western blots foram sondados em busca de proteínas enriquecidas em exossomos, como a tetraspanina CD63 e Tsg101. Este gráfico de amplificação em tempo real mostra uma variedade de espécies de microRNA extraídas de exossomos da bile humana.

Como os exossomos carecem de padrões confiáveis, como RNA ribossômico 18S ou 28S ou genes de manutenção, o pico de um microRNA sintético é importante para a normalização. A técnica de isolamento de exos pode ser feita em três horas se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter e processar a bile de pacientes ou animais para isolar e analisar vesículas extracelulares.

Ao retratar este procedimento, é importante lembrar de centrifugar a amostra a 500 G e quatro graus antes de congelar a menos 80, se você não puder prosseguir com a ultracentrifugação. Após este procedimento, outros métodos, como estudos de microRNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como perfis de microRNA. Não se esqueça de que trabalhar com bile pode ser extremamente perigoso, pois pode conter hepatite, e precauções como o uso de luvas e óculos de segurança devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

Após seu desenvolvimento, a técnica abriu caminho para pesquisas no campo da pesquisa de colangiocarcinoma para explorar vesículas extracelulares como potencial biomarcador na bile de pacientes com problemas biliares, como obstrução do PSA.