Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

O objetivo geral deste método é isolar exossomos da bile humana para análises adicionais, incluindo o perfil de microRNA. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de doenças hepáticas, como a detecção de um marcador biliar específico para colangiocarcinomas ou outras doenças biliares. A principal vantagem desta técnica é que ela é robusta e repetível.

Para realizar uma colangiopancreatografia retrógrada endoscópica, ou ERCP, comece posicionando o paciente em posição supina. Após a intubação e a passagem de um duodenoscópio pela boca do paciente, insira-o na segunda porção do duodeno e identifique a papila maior. Canule seletivamente o ducto biliar comum inserindo um esfincterotomo de três luzes pré-carregado com um fio-guia hidrofílico de 0,35 polegadas ou 0,9 milímetro.

Sob orientação fluoroscópica, avance o fio-guia até o ducto hepático esquerdo e, em seguida, avance o esfincterotomo cinco centímetros para dentro do ducto biliar para obter uma posição estável. Após remover o fio-guia, conecte uma seringa de 10 milímetros ao orifício do fio-guia através do bloqueio inferior e utilize 10 mililitros de pressão negativa para aspirar a bile. Remova a seringa contendo a bile e, após reinserir o fio-guia, injete agente de contraste através do orifício de injeção para opacificar a árvore biliar.

Em seguida, transfira a bile coletada para um tubo de 15 mililitros sobre gelo e, se for armazenar para uso posterior, centrifugue a amostra a 500 × g e quatro graus Celsius por 10 minutos antes de congelar a menos 80 graus Celsius. Para prosseguir imediatamente com o isolamento de exossomos, transfira 400 microlitros de bile para um tubo de microcentrífuga e centrifugue a 300 × g e quatro graus Celsius por 10 minutos para coletar células e debris celulares. Para limpar ainda mais o sobrenadante, transfira a solução para tubos de microcentrífuga novos e centrifugue as amostras a 16.500 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, em uma cabine de segurança biológica, colete o sobrenatante em uma seringa e filtre-o através de um filtro de membrana de polietersulfona de 0,2 micrômetro para remover quaisquer partículas remanescentes maiores que 200 nanômetros. Transfira o sobrenatante filtrado para tubos de ultracentrífuga e use PBS para encher os tubos até pelo menos dois terços da capacidade, a fim de evitar que os tubos colapsem durante a centrifugação. Peline os exossomos por ultracentrifugação a 120.000 vezes g e quatro graus Celsius por 70 minutos.

Um pequeno pellet amarelo conterá os exossomos. Descarte o sobrenatante por decantação cuidadosa e desinfete o resíduo adicionando hipoclorito de sódio até uma concentração final de 10% volume por volume. Em seguida, deixe repousar por 20 minutos.

Para experimentos posteriores, processe os pellets em um pequeno volume de solução apropriada ou re-suspenda-os em 50 a 100 microlitros de PBS e armazene a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Após preparar as grades com vesículas extracelulares coradas por contraste, ou EVs, de acordo com o protocolo descrito no texto, adquira imagens com um microscópio eletrônico utilizando uma tensão de aceleração de 80 quilovolts, iniciando em aumentos de 20.000 X e aumentando até 100.000 X, ao determinar o tamanho das partículas. Exossomos são pequenos demais para serem detectados por microscopia convencional ou citometria de fluxo; no entanto, esta figura mostra os resultados de uma análise típica de rastreamento de nanopartículas, ou NTA, de exossomos que mede a concentração e distribuição de tamanho, cuja média foi de 97 nanômetros nesta amostra isolada de bile humana.

A microscopia eletrônica também pode ser usada para confirmar o tamanho das partículas isoladas na bile humana, e esta figura mostra um resultado típico de microscopia eletrônica de transmissão. Esses blots sulfoocidentais foram analisados quanto a proteínas enriquecidas em exossomos, como a tetraspanina CD63 e a Tsg101. Este gráfico de amplificação em tempo real mostra uma variedade de espécies de microRNA extraídas de exossomos da bile humana.

Como os exossomos não possuem padrões confiáveis como o RNA ribossômico 18S ou 28S ou genes de referência, a adição de um microRNA sintético é importante para a normalização. A técnica de isolamento de exossomos pode ser realizada em três horas se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter e processar bile de pacientes ou animais para isolar e analisar vesículas extracelulares.

Ao repetir este procedimento, é importante lembrar de centrifugar a amostra a 500 G e quatro graus antes do congelamento a menos 80, caso não seja possível prosseguir com ultracentrifugação. Após este procedimento, outros métodos, como estudos de microRNA, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como os perfis de microRNA. Não se esqueça de que trabalhar com bile pode ser extremamente perigoso, pois pode conter hepatite, e precauções, como o uso de luvas e óculos de segurança, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

Após seu desenvolvimento, a técnica abriu caminho para pesquisas no campo do colangiocarcinoma, possibilitando explorar vesículas extracelulares como biomarcadores potenciais na bile de pacientes com problemas biliares, como obstrução do PSA.