Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.

O objetivo geral deste procedimento é isolar e digerir as paredes celulares bacterianas para determinar as identidades e frações relativas de diferentes neuropeptídeos. Usando a análise UPLC, isso é feito primeiro pela lise de amostras bacterianas por fervura em ecol sulfato de sódio. Após a lavagem do SDS, o segundo passo é digerir amostras com pronase E para purificar a membrana externa de bactérias gram-negativas.

Em seguida, as amostras são digeridas com mease para solubilizar o peptidoglicano em neuropeptídeos individuais. A etapa final é reduzir os neuropeptídeos e ajustar o pH ao ponto isoelétrico do neuropeptídeo. Em última análise, o UPLC é usado para separar neuropeptídeos de acordo com o tamanho e a hidrofobicidade, facilitando a quantificação de características importantes da parede celular, como grau de reticulação e comprimento médio da fita de glicano.

Este método pode ajudar a revelar as respostas para questões-chave no campo da microbiologia, como as relações entre morfogênese, arquitetura da parede celular, ativação do sistema imunológico e patogênese. Embora este método tenha sido desenvolvido para purificar o peptidil glicano gram-negativo, ele também pode ser aplicado a bactérias gram-positivas com a adição de algumas enzimas e tratamentos químicos Para aumentar as culturas bacterianas de volta, dilua as culturas noturnas de um a 100 em 250 mililitros de mídia fresca e cresça até a densidade óptica desejada em 600 nanômetros enquanto as culturas diluídas estão crescendo. Prepare um banho-maria fervente em uma chapa quente em um copo de um litro.

Quando a água estiver fervendo, alíquota de seis mililitros de dil sulfato de sódio a 6% ou SDS em tubos de polipropileno de 50 mililitros. Adicione uma pequena barra de agitação a cada tubo e aperte bem as tampas dos tubos. Coloque os tubos no banho-maria fervente e mexa a 500 RPM na placa quente.

Colha as culturas de 250 mililitros centrifugando a 5.000 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda os pellets em três mililitros de meio ou um x solução salina tamponada com fosfato. Pipete lentamente as suspensões de células nos tubos de 50 mililitros com SDS de 6% de ebulição para piolhos nas células enquanto os tubos estão submersos no banho-maria fervente e feche novamente as tampas com os dedos.

Cubra o banho-maria fervente e deixe as células ferverem por três horas, verificando o nível da água periodicamente e reabastecendo o banho-maria quando necessário. Após três horas, desligue o fogo da placa quente e continue mexendo durante a noite a 500 RPM. Se o SDS precipitou nos tubos de 50 mililitros durante a noite, coloque o banho-maria para ferver por mais uma a duas horas.

Aqui é mostrado como uma cultura normal deve ficar depois de lisar durante a noite. No SDS, observe a transparência em oposição à opacidade que se correlaciona com a precipitação. Prepare o tampão e prono e ative o E prono a 60 graus Celsius em um bloco de calor por pelo menos 30 minutos.

Use uma ultracentrífuga ajustada a 400.000 vezes G para girar amostras por 20 minutos em temperatura ambiente, a fim de granular as grandes moléculas de peptol glicano ou macro PG e, assim, purificá-las de outros componentes celulares. Remover o sobrenadante cuidadosamente e, em seguida, ressuspender cada pellet à temperatura ambiente. O volume da suspensão de resus de água ultrapura depende do volume dos tubos de ultracentrífuga usados.

Use um volume que encha os tubos pelo menos até a metade, mas não exceda o volume máximo dos tubos. Repita a centrifugação e a lavagem até que a água não forme bolhas durante a suspensão de Resus, indicando que o SDS foi totalmente removido neste ponto. Resus suspende as amostras em 900 microlitros de tampão tris HCL e transfere para dois tubos de mililitros previamente perfurados com furos na parte superior.

Usando uma agulha pequena, adicione 100 microlitros de pronase E ativado a cada amostra antes de incubar a 60 graus Celsius por duas horas. Pare a indigestão propensa adicionando 200 microlitros de 6% SDS a cada amostra e ferva as amostras no bloco de calor de 100 graus Celsius por 30 minutos. Como antes, use uma ultracentrífuga ajustada a 400.000 vezes G para girar as amostras por 20 minutos em temperatura ambiente e lave com água ultrapura em temperatura ambiente até que o SDS seja totalmente removido na última etapa de lavagem por centrifugação, ressus, suspenda as amostras em 200 microlitros de tampão fosfato de sódio 50 milimolar.

Este volume pode ser ajustado de acordo com a quantidade de Pepto glicano na amostra e pode ser dependente da espécie. Se a amostra contiver mais glicano pep, aumente o volume da suspensão. Se a amostra tiver pouco peptídeo glicano.

Reduza o volume da suspensão do resus para um mínimo de 50 microlitros. Transfira as amostras para tubos de 1,5 mililitro e adicione um miligrama por mililitro de mease para obter uma concentração final de 40 microgramas por mililitro. Incube por seis a oito horas ou durante a noite em um bloco de calor de 37 graus Celsius.

Para preparar amostras para UPLC, ligue um bloco de calor a 100 graus Celsius. Ferva as amostras sem SDS por cinco minutos para interromper as amostras da centrífuga de digestão da mease por 10 minutos a 16.000 vezes. G à temperatura ambiente.

Os neuropeptídeos estão agora no sobrenadante. Transferir o sobrenadante para tubos de vidro de 13 por 100 milímetros. Tente recuperar o máximo de sobrenadante possível, chegando muito perto do palato sem perturbá-lo.

Ajuste o pH adicionando tampão borato 500 milimolar à amostra para uma concentração final de tampão borato milimolar de 100 mm e oito tampão é compatível com o agente redutor. Borohidreto de sódio: adicione vários grãos de borohidreto de sódio para reduzir cada amostra e deixe a reação prosseguir por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, ajuste as amostras para pH seis conforme medido com papel indicador de pH com ácido ortofosfórico usando incrementos de 20 microlitros, a amostra deve borbulhar em resposta à adição de ácido ortofosfórico.

A amostra normalmente para de borbulhar quando um pH de seis é atingido. Em seguida, continue a ajustar as amostras para entre pH três e quatro com ácido ortofosfórico usando incrementos de dois microlitros. Filtre a amostra através de uma seringa de 0,22 mícron.

Filtre diretamente para o frasco A-U-P-L-C. Se um precipitado se formou nas amostras uma vez transferido para os frascos de UPLC, aqueça os frascos com várias passagens por uma chama. Coloque o frasco de UPLC no amostrador automático e injete 10 microlitros de cada amostra no instrumento A-U-P-L-C.

Equipado com uma coluna UPLC de fase reversa C 18 e um detector de absorbância definido para monitorar. Amostras de 202 a 208 nanômetros são injetadas sequencialmente. Defina o fluxo para 0,25 mililitros por minuto e use um gradiente linear ao longo de 25 minutos para atingir 100% de solvente B e E sequencial de neuropeptídeos em 30 minutos.

Se a espectrometria de massa for usada para caracterizar neuropeptídeos após UPLC, coletar frações do pico de interesse em um coletor de frações, transferir as frações para um tubo de 1,5 mililitro e, em seguida, secar as frações usando um evaporador centrífugo, as frações devem ser dessalinizadas antes da análise de MS. Neste resultado típico do UPLC. A detecção via absorbância UV em 202 a 208 nanômetros em função do tempo estabelece um tempo de retenção de neuropeptídeos específico.

Observa-se uma resolução clara entre a maioria das espécies de neuropeptídeos e uma forte intensidade de sinal em todo o espectro, o que permite a análise do grau de reticulação do comprimento médio da fita de glicano e a identidade dos neuropeptídeos e suas concentrações. Um exemplo de cromatograma refletindo a precipitação de C de neuropeptídeos é mostrado aqui. Nenhum pico aludido, resultando na ausência de quaisquer dados sobre a composição do PG.

A ausência de picos discerníveis da análise de UPLC pode ocorrer como resultado da superconcentração da amostra ou do ajuste incorreto do pH para bem abaixo do ponto isoelétrico dos neuropeptídeos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em três dias, embora agitados seja executado corretamente Após este procedimento. Outros métodos, como espectrometria de massa, podem ser usados para identificar positivamente espécies de neuropeptídeos com base na massa após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da microbiologia explorarem a função bioquímica das principais enzimas da parede celular e o modo de ação dos inibidores químicos em uma ampla variedade de espécies e mutantes.