Monitorando a competição de subespécies em uma população de células bacterianas por cocultivação de cepas fluorescentes rotuladas

Este método usa o co-cultivo de bacillus sutilis marcado com fluorescência para monitorar a rápida expansão clonal e eliminação de mutações benéficas e prejudiciais em uma população de células bacterianas ao longo do tempo. Primeiro, prepare as pré-culturas das bactérias para o experimento de competição. Misture quantidades iguais das cepas marcadas com fluorescência e co-cultive as bactérias sob diferentes condições nutricionais.

Em seguida, recolher as amostras em diferentes momentos, diluir adequadamente e propagar as células em placas de ágar. Agora visualize e conte as cepas sobreviventes por microscopia de fluorescência estéreo. Em última análise, os resultados podem determinar a porcentagem das bactérias sobreviventes em relação ao número total de colônias contadas.

Ao contrário do monitoramento da competição intra-espécie usando diferentes de antibióticos para rotulagem de cepas. Neste método, as cepas concorrentes marcadas com fluorescência são quase completamente isotônicas e capazes de fermentar nas mesmas placas AGA. O pré-procedimento será apresentado por Lorena, que é uma estudante de doutorado em meu laboratório, inocular os quatro mililitros de meio LB com um microlitro de bactérias de menos 80 graus Celsius, estoques criogênicos e cultivar as pré-culturas durante a noite a 28 graus Celsius e 220 RPM diluir 0,1 mililitros de cultura em 0,9 mililitros de meio LB em um vete de 1,5 mililitro, e determinar a densidade óptica.

Em seguida, para obter populações de células mistas para os experimentos de competição, inocular frascos de agitação de 100 mililitros contendo 20 mililitros de CGLC e CGLC. Meio mínimo na proporção de um para um, transfira 10 mililitros das culturas para tubos de plástico de 15 mililitros. Colha as células por centrifugação por 10 minutos a 4.000 vezes a gravidade e descarte o sobrenadante.

Em seguida, ressuspenda as células em 0,5 mililitros de meio LB fresco e transfira as células para um copo de reação estéril de 1,5 mililitro e adicione 0,5 mililitros de glicerol estéril a 50%. Misture a suspensão por vórtice rigoroso e armazene as amostras em um freezer de 80 graus Celsius negativos. Em seguida, a cultura é a bactéria restante nos frascos agitados.

Mantenha os frascos agitados no escuro para evitar o fotobranqueamento da amostra de força da flora 0,1 mililitros das culturas após sete horas e 24 horas de medição de crescimento e observe a densidade óptica de uma a 10 diluições das amostras fazem estoques criogênicos das amostras para armazenar a menos 80 graus Celsius. Depois de coletar todas as amostras, descongele os estoques criogênicos e dilua as células em uma solução salina a 0,9% para cada placa de tensão. 0,1 mililitros da diluição de 10 a quinta negativa em uma placa de ágar médio SP e distribua as células usando uma pipeta de vidro estéril.

Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius no escuro até que colônias únicas apareçam com uma caneta preta. Divida a parte inferior da placa de ágar em quatro partes para uma melhor orientação enquanto conta os sobreviventes sob o microscópio de fluorescência estéreo. Agora, coloque a placa de cabeça para baixo sob o microscópio e coloque as colônias em foco usando a fonte de luz fria.

Quando as colônias estiverem em foco, mude para o conjunto de filtros apropriado para CFP Flora quatro. Para visualizar as células sobreviventes da cepa marcada com CFP, conte os sobreviventes dessa cepa rotulando as colônias com uma caneta. E anote o número.

Remova os rótulos com etanol. Em seguida, mude para o conjunto de filtros YFP. Para visualizar as células sobreviventes da cepa marcada com YFP.

Conte os sobreviventes novamente rotulando as colônias com uma caneta. E anote o número. Abra as fotos de um ponto que foram tiradas com o conjunto de filtros CFP e o conjunto de filtros YFP.

Otimize o contraste e o brilho para reduzir qualquer fluorescência de fundo da mídia. Vá para uma das fotos e selecione todas. Copie a imagem e cole-a na outra imagem.

Mescle as imagens selecionando no menu de camadas a opção cor mais clara. Neste experimento, uma população de células consistindo de duas cepas de BCI foi marcada com o Fluor CFP e YFP para avaliar o efeito de diferentes fontes de nitrogênio no crescimento por meio de diluição apropriada em placas de ágar. A composição clonal de uma população de células ao longo do tempo pode ser determinada com precisão simplesmente contando as colônias fluorescentes amarelas e azuis.

A atividade da enzima glutamato desidrogenase afeta fortemente a aptidão do otus, dependendo da disponibilidade de glutamato exógeno. Na ausência de glutamato exógeno, o alto nível de atividade do GDH é desvantajoso para as bactérias, pois as enzimas balançam G e B bom degradam o glutamato necessário no anabolismo. Por outro lado, a síntese de dois gdhs funcionais é vantajosa para as bactérias quando o glutamato exógeno está disponível porque, além da glicose G, o glutamato é usado como fonte de carbono.

Resultados semelhantes foram obtidos em um experimento de troca de matriz. Novamente, as bactérias equipadas com alto nível de atividade de GDH foram superadas por células com atividade reduzida de GDH em meios de crescimento sem glutamato. Por outro lado, as bactérias que sintetizam apenas um GDH ativo foram eliminadas da cultura.

Quando o meio foi suplementado com glutamato, claramente a composição inicial da população de células mistas permaneceu quase constante ao longo do tempo. Independentemente do flúor em conjunto. O uso do Flora Force é uma ferramenta poderosa para monitorar a competição intra-espécie em uma população de células bacterianas, uma vez que as forças do competidor foram geradas.

Esta técnica pode ser feita em cinco dias se for realizada corretamente.