Monitoramento Espacial Segregação na superfície Colonizar microbianas Populações

O objetivo geral deste procedimento é observar a distribuição espacial de cepas microbianas durante a movimentação coletiva (swarming), deslizamento (sliding) ou formação de biofilme utilizando microscopia fluorescente. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de microbiologia social, como a forma pela qual a segregação espacial influencia a interação microbiana. A principal vantagem desta técnica é que a aptidão (fitness) e a distribuição espacial de cepas microbianas podem ser facilmente avaliadas por meio de técnicas microscópicas e análise de imagens por subsegmentos.

Theresa Holscher, pesquisadora de doutorado do meu laboratório, demonstrará o procedimento. No dia anterior ao experimento, adicione três mililitros de meio LB a um tubo de cultura e inóculo-o a partir de uma estirpe congelada de B. subtilis. Repita essa inoculação com um tubo separado para cada linhagem de interesse.

Coloque os tubos em um incubador com agitação horizontal a 37 graus Celsius durante a noite. Para preparar as placas para experimentos de movimentação coletiva e deslizamento, despeje 20 mililitros de meio LB temperado em uma placa de Petri de poliestireno de 90 milímetros. Feche a placa imediatamente e coloque-a de lado no interior da câmara de fluxo laminar para esfriar por pelo menos uma hora.

Em seguida, prepare as placas para experimentos de biofilme em colônia vertendo 25 mililitros de meio SG com ágar duas vezes em uma placa de Petri de 90 milímetros. Feche imediatamente as placas e deixe esfriar em pilhas de até quatro por pelo menos uma hora. Para começar, coloque as placas de ágar LB para enxameamento e deslizamento em uma cabine de fluxo laminar e remova as tampas.

Deixe as placas secarem por 20 minutos. A umidade das placas nestes experimentos é crítica. Embora o excesso de umidade permita que as bactérias nadem, a secagem prolongada impede a movimentação coletiva (swarming) e o deslizamento (sliding).

Da mesma forma, a estrutura do biofilme da colônia depende da umidade do meio. Utilizando um espectrofotômetro, determine as densidades ópticas de culturas iniciadoras de crescimento noturno a 600 nanômetros. Em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, misture quantidades normalizadas por densidade das cepas produtoras de proteína fluorescente verde e vermelha, totalizando 200 microlitros.

Vortex a tubo durante três segundos. Usando uma micropipeta, aplique dois microlitros da cultura mista no centro de uma placa de ágar LB de 90 milímetros pré-secada na cabine de fluxo laminar. Deixe a placa secar por 10 minutos.

Por fim, incubar as placas a 37 graus Celsius em posição vertical para evitar que a condensação se acumule na superfície do ágar. Primeiro, colocar as placas de ágar SG duas vezes em uma cabine de fluxo laminar durante 15 minutos para secar. Em seguida, adicionar 100 microlitros de cada uma das culturas iniciadoras da linhagem de biofilme produtora de proteína verde fluorescente e vermelha, B.subtilis 168, em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.

Vortexie o tubo durante três segundos. Prepare tubos com 100 microlitros de meio LB e, utilizando o cultivo misto, crie uma série de diluições de 10 vezes dos inóculos. Usando uma micropipeta, aplique dois microlitros do cultivo misto não diluído na placa de ágar SG duas vezes.

Repita este procedimento com as culturas para as diluições de 10 elevado a um, 10 elevado a dois, 10 elevado a três e 10 elevado a quatro, espaçando os pontos em distâncias iguais para permitir que seis a nove colônias sejam cultivadas em uma única placa. Incube as placas na posição vertical a 30 graus Celsius por um a três dias. Para começar, coloque as placas na plataforma de imagem de um microscópio com detecção de fluorescência.

Para experimentos de deslizamento e movimentação coletiva, posicione a origem da inoculação, no centro da placa de Petri, no canto do campo visível para permitir a medição da expansão radial da colônia. Ajuste a magnificação para a resolução mais alta que permita a aquisição de imagem da maior região possível da placa de 90 milímetros. Ajuste o tempo de exposição adequadamente, dependendo da intensidade do sinal fluorescente.

Para a análise de biofilme, posicione uma colônia de interesse no centro do campo de visão. Ajuste a ampliação na resolução mais alta que permita visualizar toda a colônia. As colônias estão agora prontas para medição e análise.

Por fim, analise os dados conforme descrito no protocolo textual. Esta figura mostra o crescimento de uma colônia típica de Bacillus subtilis co-inoculada com duas cepas. O movimento coletivo na superfície, denominado swarming, que depende de flagelos, resulta em uma população altamente mista.

Neste vídeo com lapso de tempo, o inóculo inicial foi colocado no centro da placa espalhada. A movimentação em camada fina é claramente observada e, conforme a colônia se desenvolve, as duas cepas fluorescentes vermelha e verde parecem misturadas e sobrepostas. Por outro lado, as imagens do comportamento de deslizamento mostram setores definidos de crescimento correspondentes às cepas fluorescentes marcadas de forma distinta.

Este vídeo mostra o crescimento de uma colônia co-inoculada deslizante em que as cepas não possuem flagelos funcionais. Essas colônias ainda são capazes de se espalhar por meio de uma combinação de exopolissacarídeo secretado, hidrofobina e surfactina. As colônias resultantes exibem um arranjo espacial distinto de crescimento em comparação com a cepa que realiza enxameamento.

As colônias produtoras de biofilme com densidades celulares iniciais elevadas influenciaram fortemente a distribuição espacial das colônias resultantes. Colônias iniciadas com alta densidade celular de populações mistas apresentaram pouca ou nenhuma segregação espacial. Em contraste, quando a densidade celular no início era baixa, setores fluorescentes verdes e vermelhos bem definidos puderam ser detectados.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar as abundâncias relativas de cepas marcadas com fluorescência em colônias microbianas, examinar a segregação espacial e estudar a influência da densidade de células fundadoras.