Monitoramento Espacial Segregação na superfície Colonizar microbianas Populações

O objetivo geral deste procedimento é observar a distribuição espacial de cepas microbianas durante a enxameação, deslizamento ou formação de biofilme usando microscopia fluorescente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia social, como como a segregação espacial influencia a interação microbiana. A principal vantagem desta técnica é que a aptidão e a distribuição espacial das cepas microbianas podem ser facilmente avaliadas usando técnicas microscópicas e análise de imagem de subsegmento.

Demonstrando o procedimento estará Theresa Holscher, pesquisadora PhD do meu laboratório. No dia anterior ao experimento, adicione três mililitros de meio LB a um tubo de cultura e inocule-o a partir de um estoque congelador de B. subtilis. Repita esta inoculação com um tubo separado para cada cepa de interesse.

Coloque os tubos em uma incubadora horizontal a 37 graus Celsius durante a noite. Para preparar placas para experimentos de enxameação e deslizamento, despeje 20 mililitros de meio LB temperado em uma placa de Petri de poliestireno de 90 milímetros. Feche o prato imediatamente e coloque-o em um lado do capuz estéril para esfriar por pelo menos uma hora.

Em seguida, prepare placas para experimentos de biofilme de colônia despejando 25 mililitros de ágar duas vezes o meio SG em uma placa de Petri de 90 milímetros. Feche os pratos imediatamente e deixe-os esfriar em pilhas de quatro ou menos por pelo menos uma hora. Para começar, coloque as placas de enxame e deslizamento de ágar LB em uma capela de fluxo laminar e remova as tampas.

Deixe as placas secarem por 20 minutos. A umidade das placas nesses experimentos é crítica. Embora o excesso de umidade permita que as bactérias nadem, a secagem prolongada evita a enxameação e o deslizamento.

Da mesma forma, a estrutura do biofilme da colônia depende da secura do meio. Usando um espectrofotômetro, determine as densidades ópticas das culturas iniciais durante a noite em 600 nanômetros. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, misture quantidades normalizadas de densidade das cepas produtoras de proteína fluorescente verde e vermelha para um total de 200 microlitros.

Vortex o tubo por três segundos. Usando uma micropipeta, coloque dois microlitros da cultura misturada no centro de uma placa de ágar LB de 90 milímetros pré-seca na capela de fluxo laminar. Coloque o prato para secar por 10 minutos.

Finalmente, incube as placas a 37 graus Celsius na posição vertical para evitar que a condensação se acumule na superfície do ágar. Primeiro, coloque as duas placas de ágar SG vezes em uma capela de fluxo laminar por 15 minutos para secar. Em seguida, adicione 100 microlitros de cada uma das cepas de biofilme produtoras de proteína fluorescente verde e vermelha, culturas iniciais B.subtilis 168, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Vortex o tubo por três segundos. Prepare tubos com 100 microlitros de meio LB e, usando a cultura mista, crie uma série de diluições de 10 vezes de inoculados. Usando uma micropipeta, coloque dois microlitros da cultura mista não diluída na placa de ágar duas vezes SG.

Repita isso com inoculantes para 10 para um, 10 para dois, 10 para três e 10 para quatro diluições, espaçando pontos em distâncias iguais para permitir que seis a nove colônias sejam cultivadas em um único prato. Incube as placas na vertical a 30 graus Celsius por um a três dias. Para começar, coloque as placas na plataforma de imagem de um microscópio de detecção de fluorescência.

Para experimentos de deslizamento e enxameação, defina a origem da inoculação, o meio da placa de Petri, para o canto do campo visível para permitir a medição da expansão da colônia radial. Ajuste a ampliação para a resolução mais alta que permita a aquisição de imagens da maior região possível da placa de 90 milímetros. Ajuste o tempo de exposição adequadamente, dependendo da intensidade do sinal fluorescente.

Para análise de biofilme, posicione uma colônia de interesse no centro do campo de visão. Defina a ampliação na resolução mais alta que permite que toda a colônia seja visualizada. As colônias agora estão prontas para medição e análise.

Por fim, analise os dados conforme descrito no protocolo de texto. Esta figura mostra o crescimento de uma colônia típica de Bacillus subtilis co-inoculada com duas cepas. A enxameação, que é um movimento coletivo da superfície dependente de flagelantes, resulta em uma população altamente mista.

Neste vídeo de lapso de tempo, o inoculante inicial foi colocado no centro da propagação da placa. A enxameação de camadas finas é claramente observada e, à medida que a colônia se desenvolve, as duas cepas fluorescentes vermelhas e verdes parecem misturadas e sobrepostas. Por outro lado, as imagens do comportamento deslizante mostram setores definidos de crescimento correspondentes às cepas fluorescentes marcadas de forma diferente.

Este vídeo mostra o crescimento de uma colônia co-inoculada deslizante na qual as cepas não possuem flagelos funcionais. Essas colônias ainda são capazes de se espalhar usando uma combinação de exopolissacarídeo secretado, hidrofobina e surfactina. As colônias resultantes exibem uma variedade de crescimento espacial distinta em comparação com a cepa de enxame

As densidades celulares iniciais das colônias produtoras de biofilme influenciaram fortemente a variedade espacial das colônias resultantes. As colônias iniciadas com alta densidade celular das populações mistas apresentaram menor ou nenhum sortimento espacial. Em contraste, quando a densidade celular no início era baixa, setores fluorescentes verdes e vermelhos claros podiam ser detectados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar as abundâncias relativas de cepas marcadas com fluorescência em colônias microbianas, examinar a segregação espacial e estudar a influência da densidade das células fundadoras.