Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

O objetivo deste procedimento é mostrar como a microscopia de fluorescência de reflexão interna total baseada em polarização é implementada para o estudo da remodelação da membrana durante a exocitose regulada. Isso é feito primeiro garantindo que os elementos ópticos, ou seja, a placa de quarto de onda e os cubos polarizadores, estejam posicionados corretamente para gerar polarizações de excitação p e s discretas. O segundo passo é verificar se os feixes p e s são colina passam pelo eixo óptico do microscópio e iluminam a mesma porção do campo de visualização quando em fluorescência de reflexão interna total ou TIRF.

Em seguida, as células a serem visualizadas são coradas com a matriz de carbonocianeto, matriz D e estimuladas com estímulos despolarizantes para desencadear a exocitose. A etapa final é capturar imagens da fusão de vesículas de núcleo denso enquanto estiver no TIRF. Em última análise, o P-T-I-R-F é usado para adquirir imagens em tempo real para monitorar as mudanças topológicas da membrana que resultam da exocitose das células de cromina.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como pirometria e capacitância de membrana, é que o ptro F relata uma curvatura da membrana e, por extensão, a dilatação da porta de fusão diretamente. A parte mais íngreme da curva de aprendizado com essa técnica é primeiro aprender a alinhar as polarizações de excitação p e s, de modo que elas viajem pela linha central óptica do microscópio e iluminem a mesma parte do campo de imagem. Uma segunda questão que surge com frequência diz respeito à coloração celular, ou seja, quanto tempo expor as células ao dd e o que constitui uma célula bem corada versus uma que está mal corada.

Demonstrando o procedimento estará TA square row, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para iniciar a alimentação em todos os componentes do microscópio, lasers e computadores direcionam um feixe do laser de 488 nanômetros para o plano focal traseiro da lente de abertura numérica de 1,49. Se o feixe de laser estiver focado no plano focal traseiro, ele surgirá, agrupado e aparecerá como um ponto pequeno e bem definido no teto diretamente acima da objetiva.

Em seguida, ajuste o espelho do galvanômetro X para que o feixe de laser seja movido para fora do eixo e saia da objetiva em ângulos progressivamente mais íngremes em relação à normal da objetiva. Em seguida, verifique se a reflexão interna total ou TIR foi alcançada. Adicione 10 microlitros de microesferas fluorescentes a um mililitro de volume de solução salina fisiológica e um prato com fundo de vidro apenas a fluorescência das microesferas no fundo do prato mais próximo da interface TIR deve ser detectada.

A detecção de microesferas flutuantes indica que o ângulo entre a luz incidente e a normal objetiva é insuficiente. Para imagens baseadas em polarização, use o feixe alinhado de 488 nanômetros como guia e ajuste a posição do feixe de laser bruto de 561 nanômetros para que ele viaje ao longo de um caminho óptico idêntico. O laser de 561 nanômetros será usado para imagens do corante de cianeto de carbo.

Uma lente e espelhos divergentes estão a jusante do laser de 561 nanômetros. Usando os botões de ajuste nos espelhos, ajuste o feixe para que ele fique co-alinhado com o feixe de 488 nanômetros e o ponto fique em foco no teto. Quando os espelhos do galvanômetro estão na posição zero, um cubo de polarização reflete o componente vertical do campo elétrico e passa pelo componente horizontal.

Ele é colocado a jusante do feixe polarizado elíptico em um pequeno estágio de translação. Para facilitar o alinhamento subsequente da polarização, os caminhos do feixe usam um segundo cubo polarizador e espelhos para recombinar os feixes. Um obturador é colocado entre o primeiro cubo de polarização e o espelho componente vertical.

Um segundo obturador é colocado entre o espelho componente horizontal e o segundo cubo de polarização. Esses obturadores são controlados pelo software de imagem, permitindo que o usuário selecione rapidamente entre as polarizações do feixe. Use um filtro polarizador para verificar a orientação do campo elétrico em cada caminho do feixe.

Um filtro polarizador só permitirá a transmissão alinhada com o eixo do filtro. Verifique se os componentes vertical e horizontal do feixe de laser estão alinhados entre si e com o feixe de 488 nanômetros, faça os ajustes necessários. Os três feixes devem ser focados no plano focal traseiro e emergir agrupados da objetiva no mesmo ponto no teto.

Este ponto pode ser marcado por um X para facilitar o alinhamento futuro. Em seguida, coloque uma gota de óleo de imersão na objetiva. Coloque o prato contendo microesferas fluorescentes.

No objetivo, insira TIR movendo o espelho do galvanômetro X no software de movimentação do espelho em TIR. O componente vertical do feixe é a polarização S e o componente horizontal do feixe é agora o centro de polarização P, uma placa de um quarto de onda ou qw no caminho do feixe. Imediatamente a jusante da abertura do laser, visualize cada campo evanescente polarizado com uma amostra de domine de bastonete, que se prevê que seja orientada aleatoriamente.

Gire a placa qw para corresponder às intensidades médias de pixels. Isole as células de cromo saudáveis da glândula adrenal do gato, conforme descrito no protocolo de texto, conte as células usando um hemocitômetro e prepare para a transfecção as células transfectadas com DNA que codifica a proteína de interesse usando o sistema de eletroporação de acordo com as recomendações do fabricante. As configurações que fornecem o melhor equilíbrio entre a eficiência da transfecção e a taxa de sobrevivência celular.

Para esta preparação de células de cromina bovina são 1, 100 volts, 40 milissegundos e um pulso seguindo as células da placa de transfecção suavemente em placas tratadas com poli de licina e colágeno em um mililitro de meio eletro desfile aquecido. Coloque os pratos em uma incubadora a 37 graus Celsius. Adicione um mililitro de dois meios antibióticos a cada prato Após seis horas, mude o meio para o meio normal no dia seguinte.

As células cromáticas são normalmente fotografadas 48 horas a cinco dias após a eletroporação com o sistema de imagem no software de aquisição inicial. Verifique se os lasers estão alinhados. Verifique o perfil de campo evanescente usando microesferas.

Preparar o sistema de profusão global e local. Limpe os reservatórios de solução com água deionizada filtrada e encha com soluções salinas fisiológicas basais e estimulantes. Antes de fazer a imagem das células crominas, verifique se a polarização P e a excitação da polarização S iluminam a mesma região do campo de visualização e se as intensidades de iluminação são aproximadamente equivalentes, conforme detalhado no protocolo de texto.

Agora prossiga para a coloração de células de croma bovina com DD.Enxágue o meio de cultura do prato que contém as células de cromina e substitua por dois mililitros de solução salina fisiológica basal. Adicione 10 microlitros de DD 10 milimolares diretamente ao prato que contém as células. Agite suavemente o prato por dois a 10 segundos antes de remover a solução.

Lave o prato três a quatro vezes com solução salina fisiológica basal para remover qualquer DD residual, as células agora estão coradas e prontas para uso. Adicione uma gota de óleo de imersão à objetiva. Coloque o prato contendo células de cromina coradas com Dai D em cima da objetiva.

Posicione a agulha de perfusão local de forma que fique a cerca de 100 mícrons de distância da célula. Concentre-se na membrana celular e ative o hardware de foco automático imediatamente antes da aquisição da imagem de estimulação celular. Comece a aquisição de imagens perfundindo células por 10 segundos com uma solução basal e, em seguida, por 60 segundos com uma solução despolarizante de cloreto de potássio 56 milimolar.

Adquira imagens enquanto cofraga rapidamente entre a polarização P de 561 nanômetros e a polarização de 561 nanômetros para monitorar as mudanças nas emissões de p e s de DD e excitação de 488 nanômetros. Para obter a imagem da sonda de vesícula transfectada, a marcação exuberante da membrana das células da cromina é obtida após uma breve incubação com Dai D.In neste exemplo, a membrana celular é bem corada. Uma célula aderente saudável exibirá diferenças distintas nas emissões de p e s.

A imagem de emissão de P mostra uma borda de célula mais brilhante em relação ao resto da célula. A imagem de emissão S mostra fluorescência aproximadamente uniforme em toda a pegada da célula, calculada pixel a pixel P sobre S e p mais dois s. As imagens são sensíveis à curvatura da membrana e à concentração do corante, respectivamente.

O CHRO e a célula mostrados também foram transfectados com synap OIN one florin para marcar vesículas secretoras. O CHRO e a célula são estimulados com cloreto de potássio para despolarizar a membrana celular e desencadear a exocitose. Uma série de manchas fluorescentes de repente se tornam evidentes à medida que as vesículas do núcleo denso se fundem.

Uma caixa branca é desenhada em torno de um evento de fusão Para analisar este evento de fusão quadro a quadro, foram examinadas as mudanças em sit um florim, po VS e p mais dois s, intensidades de imagem. A intensidade fluorescente de fluorescência do CIT um diminui rapidamente à medida que a proteína se difunde para longe do local de fusão. O recuo que representa o complexo de membrana plasmática da vesícula fundida diminui a uma taxa relativamente mais lenta.

Esta ilustração mostra uma interpretação dessas medidas. A deformação rápida e localizada da membrana é resultado do estímulo evocado pelo influxo de cálcio A despolarização da membrana causa um aumento significativo na fluorescência G Camp 5G, significando um aumento nos níveis subplasmáticos de cálcio. Uma região de 30 por 20 pixels da célula é selecionada e quadro a quadro muda no G camp 5G PS e p mais dois s.

As intensidades de pixel são mostradas nas imagens e gráficos. Vezes zero designa o quadro antes que uma mudança no PS seja evidente. As pontas das setas brancas indicam que a deformação da membrana é acompanhada por uma diminuição na emissão de p mais dois S.

A proteína G CAMP 5G citosólica é excluída da área pela vesícula do núcleo denso fundido. Observe também a diminuição repentina na intensidade do G camp 5G vezes zero. O aumento de longa duração na POS e a diminuição em p mais dois s sugerem um poro de fusão que se dilata lentamente, conforme ilustrado.

Aqui Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir um sistema PTU F e células de imagem para observar as mudanças topológicas da membrana enquanto estiver no gramado após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem mudanças na forma da membrana durante a exocitose, endocitose, citocinese e motilidade celular em células vivas.