Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

O objetivo geral deste procedimento é estudar o perfil metabólico em células cultivadas. Isso é feito extraindo primeiro metabólitos polares das células. O segundo passo é reconstituir os extratos celulares em água e transferir as amostras para frascos de lc.

Em seguida, as amostras são injetadas no instrumento lc QE MS, que foi calibrado e os dados brutos são registrados no computador na etapa final. Os picos de metabólitos são extraídos dos dados brutos usando software comercial, e picos desconhecidos são pesquisados em um banco de dados de massa de alta resolução. Embora este mestre possa fornecer informações sobre os níveis relativos de metabólitos na SARS, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como soro ou tecidos.

Primeiro, prepare 500 mililitros da fase móvel A, que é acetato de amônio de 20 milimolares e hidróxido de amônio de 15 milimolares em aceto a 3%, nitrilo e água. Depois de tampar frouxamente o frasco, sonicar a solução em banho-maria por 10 minutos sem aquecimento. Em seguida, dissolva cinco miligramas de acetato de fluoro de sódio e ácido em cinco mililitros de água para fazer uma concentração final de um miligrama por mililitro.

Em seguida, dissolva o diazinon em metanol para fazer uma concentração final de 10 microgramas por mililitro. Para preparar um mililitro de solução de calibração de baixa massa negativa, misture 960 microlitros de solução de calibração termo-negativa com 20 microlitros de solução de fluoroacetato de sódio e ácido homovanílico. Para fazer um mililitro de solução de calibração de baixa massa positiva, misture 990 microlitros de solução de calibração termopositiva e 10 microlitros da solução de diazinon.

Depois de realizar uma calibração de massa padrão no modo positivo, ajuste a faixa de varredura para uma relação massa/carga de 60 a 900 no painel de controle do instrumento e aplique uma dissociação induzida por colisão de fonte de 25 elétron-volts. Insira íons de calibração personalizados e, quando a fonte de íons estiver estável, inicie a calibração personalizada na página de ajuste. Mude a polaridade para o modo negativo após realizar uma calibração de massa padrão no modo negativo, ajuste a faixa de varredura para 60 a 900 massa para a relação carga/carga no painel de controle do instrumento e aplique uma dissociação induzida por colisão de fonte de 35 elétron-volts.

Insira íons de calibração personalizados e, quando a fonte de íons estiver estável, inicie a calibração personalizada. Na página de ajuste, equipe o instrumento QE MS com a ionização por eletrospray aquecida ou sonda HESI, fixando-o no nível C e, em seguida, conectando-o às entradas de gás nitrogênio, cabo do vaporizador e cabos de tensão. Na página de ajuste do computador, defina os parâmetros de ajuste relevantes para o teste.

Defina a temperatura capilar em 320 graus Celsius e a lente S em 55. Em seguida, no programa de método, crie um método de verificação completa usando os valores a seguir. Estabelecer o método de cromatografia introduzindo as informações do gradiente linear.

Empregue uma coluna intermediária para separação de compostos à temperatura ambiente. Neste ponto, prepare um solvente de extração misturando manualmente 40 mililitros de metanol e 10 mililitros de água em um 50 mililitros. Dois. Quando o câncer de cólon H CT oito células previamente cultivadas atingem 80% de confluência.

Aspire rapidamente o meio e coloque a placa de seis poços em cima do gelo seco. Em seguida, adicione imediatamente um mililitro de solvente de extração a cada poço e transfira a placa para um freezer negativo de 80 graus Celsius. Depois de retirar a placa do freezer, 15 minutos depois, coloque-a em cima do gelo seco e raspe as células no solvente.

Transferir a solução de cada alvéolo para três tubos de 1,7 mililitros e centrifugar as amostras a uma velocidade de 20 000 vezes G a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Após centrifugação, transferir o sobrenadante para dois novos tubos einor. Em seguida, seque as amostras em vácuo de velocidade.

Quando as amostras estiverem secas, guarde-as no freezer de 80 graus Celsius negativos. Depois de retirar as amostras do congelador para análise, deixe-as atingir a temperatura do gelo. Em seguida, adicione 20 microlitros de água gelada e vortex as amostras para dissolver os metabólitos.

Em seguida, centrifugue as amostras a 20.000 vezes G a quatro graus Celsius. Por dois minutos, transfira o SUPERNAT para frascos lc e injete cinco microlitros das amostras no instrumento lc QES para análise. Uma vez que a calibração tenha sido realizada corretamente no instrumento QE MS, equilibre a coluna lc por cinco minutos com 85% da fase móvel B a uma taxa de fluxo de 0.15 mililitros por minuto.

Em seguida, configure a sequência de amostras em uma ordem aleatória para distribuir as flutuações introduzidas pelo LCMS para cada amostra e garantir uma comparação mais precisa entre as diferentes amostras. A cada seis amostras, adicione uma execução de lavagem, seguida por uma amostra em branco para avaliar o histórico do sistema e os níveis de transferência. Salve a sequência e inicie a execução da sequência.

Uma vez que a coluna lc mostre pressão estável próxima a 400 PSI, após a execução das duas primeiras amostras da sequência, verifique os picos nesses cromatogramas em busca de metabólitos desconhecidos para garantir que a sequência da amostra funcione sem problemas. Depois que todos os exemplos da sequência forem concluídos, execute a análise de dados em um computador separado. Escolha o método de alinhamento de pico e extração de estrutura para moléculas pequenas em software disponível comercialmente.

Em seguida, carregue os dados brutos lc ms e agrupe-os com base nos tipos de amostra. Escolha amostras no meio da sequência de execução como uma amostra de referência de cromatografia para alinhamento de pico e escolha um grupo como o grupo de proporção ou o cálculo de mudança completa. Em seguida, carregue uma semente de quadro, incluindo metabólitos conhecidos para a análise de metabólitos alvo com dados coletados e a semente de quadro correspondente.

Em seguida, escolha a varredura de espectro completo no modo positivo ou negativo e salve esse arquivo de processamento de dados na mesma pasta que os dados brutos. Desative a função de pesquisa de banco de dados e execute o fluxo de trabalho. Em seguida, exporte os dados do processo como uma planilha do Excel contendo a área de pico de cada quadro.

Para uma análise de metabólitos não direcionados, escolha o método de extração de componentes. Carregue os dados brutos de amostra e três amostras em branco para subtração em segundo plano. Seguindo esse grupo, os dados brutos e definir as amostras de referência conforme descrito anteriormente.

Defina o limite do componente como 10 elevado ao quinto. Use um banco de dados de metaboloma humano para identificação de compostos desconhecidos. Depois de salvar esse arquivo de processamento, desative a função de pesquisa de banco de dados e inicie o fluxo de trabalho.

Quando o processamento de dados estiver concluído, use coeficientes de variação ou filtros CV para remover componentes com CV grande dentro de amostras replicadas e filtros de intensidade. Para remover componentes detectados no nível de ruído, passe manualmente por cada componente e escolha aqueles com um pico bem definido ou diferença relativamente grande em diferentes tipos de amostra para a pesquisa no banco de dados. Por fim, exporte os dados com ocorrências no banco de dados.

A precisão dos dados metabolômicos depende muito do desempenho do instrumento lc QEMS para avaliar se o instrumento está operando em boas condições e se o método aplicado é adequado. Vários picos de metabólito lc conhecidos são extraídos da cromatografia de íons totais, conforme mostrado aqui. Metabólitos polares, incluindo aminoácidos, glicólise, intermediários, TCA, intermediários, nucleotídeos, vitaminas A, TP e NADP, têm boa retenção na coluna e boas formas de pico nas condições atuais de lc.

Enquanto isso, um teste de erro de massa é feito dentro de 24 horas após a calibração de baixa massa, conforme ilustrado. Aqui, o erro de massa é avaliado comparando a relação massa/carga detectada com a relação massa/carga teórica dos metabólitos alvo. Aqui, os metabólitos visados têm uma relação massa/carga variando de 74 a 744.

O eixo Y representa aqui a percentagem acumulada de metabolitos dentro de um determinado intervalo de erro de massa. A curva azul mostra o resultado de zero a 12 horas, enquanto a curva vermelha mostra os dados coletados de 12 a 24 horas após a calibração. Mais de 90% dos metabólitos estão dentro de cinco partes por milhão de erro de massa, o que significa que o método de calibração de baixa faixa de massa desenvolvido aqui é suficiente para manter cinco partes por milhão de erro de massa para detecção de baixa faixa de massa.

Outra questão a ser abordada é a sensibilidade do instrumento com o método atual e a configuração do instrumento. Uma diluição seriada de amostras triplicadas de uma placa de Petri de 10 centímetros foi realizada cinco vezes com um fator de diluição de seis, resultando em seis concentrações diferentes de amostras. Uma lista direcionada é usada para avaliar o número de metabólitos detectados em diferentes concentrações de amostra.

Os resultados mostrados aqui indicam que o número ideal de metabólitos direcionados detectados está entre 2,78 vezes 10 elevado à quinta e 1,67 vezes 10 elevado às seis células, enquanto uma vez 10 elevado às sete células fornece um número menor de metabólitos detectados, o que se deve aos efeitos de supressão de íons. Este resultado indica que a quantidade ideal de células a serem extraídas para esta análise é aproximadamente a de um poço em uma placa de seis poços. Para análise de metabólitos não direcionados, um ponto de corte CV de 20% e um valor médio de intensidade de 10 elevado a sétimo são usados para filtrar a tabela de componentes.

Os valores de corte CV podem ser aumentados, enquanto os valores médios de intensidade precisam ser diminuídos para incluir mais picos: Após a verificação manual dos picos, os componentes com boas formas são selecionados e pesquisados no banco de dados de metaboloma humano. Os resultados dos dados coletados no modo positivo estão listados aqui, enquanto os resultados do modo negativo estão listados aqui. Alguns dos metabólitos identificados aqui se sobrepõem aos metabólitos da lista alvo, como glutationa e prolina.

Metabólitos adicionais ausentes da lista alvo também são explorados, como metil glioxal, que pode ser derivado da glicólise e uma tomada de força, dois glicerol ELE SN, três fosfocolina, que é detectado no modo positivo com um tempo de retenção de 3,2 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair polimetabólitos de sars cultivados e, em seguida, usar RC QES para medir os níveis metabolizados relativos em diferentes amostras. Obrigado por assistir.