Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

O objetivo geral do experimento a seguir é comparar instantâneos dos perfis metabólicos de diferentes grupos de amostras biológicas. Isso é conseguido usando uma extração líquida para separar moléculas orgânicas e polares. Como segunda etapa, as moléculas são separadas por cromatografia líquida e analisadas por espectrometria de massa de alta resolução, que fornece dados de tempo de retenção, relação massa/carga e intensidade para análise posterior.

As próximas execuções de cromatografia líquida são alinhadas e os recursos são detectados, quantificados e classificados. A fim de identificar características diferencialmente abundantes entre os grupos. Os resultados mostram as diferenças nas características entre as condições de tratamento com base na abundância diferencial de analitos detectada por cromatografia líquida, espectrometria de massa de alta resolução.

Embora esse método possa ser usado para estudar o metabolismo celular, ele também pode fornecer informações sobre a descoberta de biomarcadores ou o metabolismo biótico zeno. Para linhas aderentes, adicione 1,5 mililitros de mídia às células em uma placa de 10 centímetros. Coloque o prato no gelo e raspe suavemente para levantar as células.

Transfira os 1,5 mililitros de suspensão de célula levantada para um tubo de centrífuga de vidro de 10 mililitros pré-rotulado. Em seguida, adicione seis mililitros de metanol de clorofórmio de dois a um a cada um dos tubos de vidro de 10 mililitros contendo as amostras. Agitar as amostras em velocidade baixa durante 30 minutos Depois de agitar, centrifugar as amostras com uma configuração de desaceleração de baixa aceleração a 1.935 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius para separar completamente as fases utilizando uma pipeta de pastagem de caule longo.

Transfira a camada orgânica para um novo tubo de centrífuga de vidro de 10 mililitros pré-rotulado. Em seguida, transfira a camada aquosa para um tubo de plástico limpo de dois mililitros. Neste ponto, evaporar as amostras orgânicas e aquosas sob gás nitrogênio.

Reconstituir as amostras secas em 50 a 100 microlitros da solução inicial para o método UPLC desejado. Pipetar suavemente a amostra para cima e para baixo para ajudar a dissolver os analitos. Em seguida, transfira cada amostra para um filtro de tubo de náilon de 0,22 mícron e gire até 14.000 vezes G por aproximadamente cinco minutos até que a amostra tenha passado completamente pelo filtro.

Inspecione a amostra para garantir que não haja precipitados visíveis restantes na amostra. Transfira o sobrenadante da amostra filtrada para um frasco de UPLC pré-rotulado com tampa de inserção no frasco. Em seguida, sacuda-o para remover quaisquer bolhas do fundo do frasco de amostra.

Coloque a amostra no amostrador automático refrigerado. Agora crie uma corrida para a amostra orgânica usando o software de controle para o cromatógrafo líquido. Em seguida, crie uma execução para a amostra orgânica com base nas condições UPLC otimizadas.

Use as condições UPLC otimizadas para criar um método para a fase aquosa também. Se um conjunto conhecido de analitos alvo for de grande interesse, otimize as condições de UPLC usando o análogo fortemente marcado desses compostos e gere um método. Usando essas condições, permita que o UPLC se equilibre adequadamente.

Isso deve incluir uma preparação completa de solventes Antes de anexar uma coluna e seguir as instruções do fabricante para o volume de equilíbrio de uma nova coluna, mantenha um registro das contrapressões iniciais para ajudar a diagnosticar problemas futuros usando o software de controle para o espectrômetro de massa de alta resolução. Crie um método de modo positivo. Em seguida, usando as mesmas condições, crie um método de modo negativo.

Limpe e calibre o instrumento. Estabelecer um spray estável no espectrómetro e dar tempo para que a solução de calibração se dissipe adequadamente da fonte e da óptica. A estabilidade aceitável do spray deve dar um desvio padrão relativo de intensidade de três a 5% em pelo menos 100 varreduras com injeção de solução de calibração na mesma taxa de fluxo que o método lc usado.

Usando um gerador de números aleatórios e uma chave, configure as amostras de maneira aleatória para evitar quaisquer efeitos de lote introduzidos pela análise. Configure a sequência para todas as amostras. Defina o volume de injeção apropriado e execute um branco antes da primeira amostra.

Se houver suspeita de efeitos de transferência ou matriz entre amostras, execute brancos ou lavagens adequadas, inicie a sequência e monitore periodicamente problemas, incluindo flutuações de pressão ou perda de intensidade de sinal ao longo da corrida. Se forem detectados problemas graves, pare a execução. Limpe e calibre o instrumento.

Estabelecer um spray estável no espectrómetro e dar tempo para que a solução de calibração se dissipe adequadamente da fonte e da óptica. Antes de iniciar a análise diferencial, verifique manualmente as correntes de íons totais ou observe os cromatogramas filtrados para qualquer composto conhecido na amostra. Para garantir a reprodutibilidade das execuções e da estabilidade do spray de corte UPLC por injeção em todas as amostras, transfira os arquivos de dados RAW do espectrômetro de massa para o disco rígido da estação de trabalho onde a peneira está instalada.

Peneira aberta. Inicie um novo experimento e carregue os arquivos apropriados na peneira. Atribua grupos de comparação e selecione um único arquivo de referência para permitir que o SIE V gere os parâmetros para análise.

Siga as instruções e ajuste os parâmetros de acordo com os requisitos de qualquer experimento individual. Carregue a lista de adutos correta para o modo positivo ou negativo nos parâmetros. Quando a análise for concluída, verifique se uma lista de quadros foi preenchida na tela.

Certifique-se de que o alinhamento lc se sobreponha a quaisquer picos de ponto de referência. Se qualquer uma das execuções de lc não alinhadas mostrar um grande desvio nos picos de marcos. Isso pode indicar um problema com a amostra.

Plote os dados por coeficiente de variação dentro de uma população de amostra semelhante. Classifique a lista com base nas características desejadas. Em seguida, examine cada pico para o alinhamento de pico apropriado entre os grupos.

Integração de pico, gaussiano, intensidade do sinal de forma de pico, isótopos e atribuição de adutos. Exporte os dados conforme desejado para análise posterior ou para gerar listas de massa direcionadas para confirmação e MS para os experimentos finais. Um grande número de acertos foi identificado pelos dois programas utilizados para diferenciais, os pontos verdes são características mais abundantes no controle, enquanto os pontos vermelhos são mais abundantes no tratamento.

Um tamanho de ponto maior indica um aumento da magnitude da mudança de dobra entre os grupos e a intensidade da cor demonstra um valor de P decrescente com o aumento da saturação da cor retratada. Aqui estão os cromatogramas que mostram o modo de íon positivo de fase orgânica A janela de análise UPLC MS mostra a corrente total de íons de S Civ 2.0. O cromatograma de íons extraído para o recurso identificado como D paneth pelo XCMS é exibido na janela B.A janela C mostra o cromatograma de íons extraído para o recurso identificado como podridão conhecido de sve.

A janela D mostra o cromatograma de íons extraído para o recurso identificado como podridão conhecido de sve normalizado para a corrente de íons total. Uma característica diferencialmente abundante reduzida no grupo tratado conhecido foi provisoriamente identificada como d panadina por pesquisa precisa em massa no banco de dados. A identidade do analito foi confirmada com espectrometria de massa em tandem U-P-L-C-H-R.

Aqui é mostrada uma comparação dos cromatogramas e espectros de massa da amostra e do composto puro. Não se esqueça de que trabalhar com clorofórmio pode ser extremamente perigoso e as precauções adequadas, como uma capela bem ventilada, devem ser seguidas.