Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

O objetivo geral deste método multiplex aprimorado é aumentar o número de amostras de proteínas que podem ser analisadas simultaneamente, diminuindo o erro da amostra e o tempo do instrumento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nas áreas de envelhecimento, doenças neurodegenerativas, outras doenças relacionadas à idade e câncer relacionadas à patogênese, progressão, diagnóstico, prognóstico e alvos terapêuticos. A principal vantagem dessa técnica é que um instantâneo abrangente das mudanças de proteína em muitas condições pode ser gerado.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a doença de Alzheimer em modelo de camundongo, ele também pode ser aplicado a amostras de tecido de pacientes com Alzheimer ou uma variedade de outros distúrbios. Geralmente, os indivíduos novos neste método acharão desafiador porque há várias amostras para manusear simultaneamente em um curto período de tempo. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando reconhecemos que a acetilação poderia ser combinada com a marcação isórica para nitração de proteínas, o que nos motivou a fazer a técnica funcionar globalmente para todos os peptídeos.

Este estudo analisará os tecidos do cérebro, coração e fígado de um modelo de camundongo com doença de Alzheimer e controles do tipo selvagem. Transfira 60 a 90 miligramas de cada amostra de tecido para um tubo de lise e adicione 500 microlitros de PBS com uréia de oito molares. Homogeneizar as amostras usando um homogeneizador mecânico.

Remover o homogeneizado de tecido do tubo de lise e transferir para um tubo de microcentrífuga. Enxágue o tubo de lise com 100 a 500 microlitros de PBS com uréia de oito molares e combine a solução de enxágue com o homogeneizado de tecido. Centrifugue o homogeneizado de tecido por 15 minutos.

Agarrar o sobrenadante de cada amostra. Após a realização do ensaio BCA para determinar a concentração de proteína, adicione 100 microgramas de proteína de cada amostra aos tubos de microcentrífuga rotulados individualmente. Adicione ditiotreitol a cada amostra.

E incubar a 37 graus Celsius por duas horas. Adicione iodoacetamida, IAM, a cada amostra e incube no gelo no escuro por duas horas. Em seguida, adicione L-cisteína a cada amostra e incube em temperatura ambiente por 30 minutos.

Após 30 minutos, adicione tampão tris com cloreto de cálcio para diluir a ureia até uma concentração final de dois molares. Adicionar a cada amostra a tripsina tratada com metilcetona L1 tosilimitotofeniletilcholer. E incubar a 37 graus Celsius por 24 horas.

No dia seguinte, resfrie a digestão da proteína congelando rapidamente a amostra em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos até o processamento posterior. Antes da marcação por dimetilação, as amostras de peptídeos são dessalinizadas, conforme descrito no protocolo de texto, e secas por centrifugação a vácuo. Para iniciar o procedimento de marcação de dimetilação, reconstitua os peptídeos em ácido acético a 1% dissolvido em HPLC ou água de grau nanopuro.

Remova uma porção de 50 microgramas de cada amostra para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Armazene o restante dos peptídeos reconstituídos a 80 graus Celsius negativos para experimentos futuros. Nas etapas que serão demonstradas a seguir, é fundamental adicionar reagentes rapidamente para que as reações químicas de habilitação ocorram pelo mesmo período de tempo para todas as amostras.

Adicione oito microlitros de uma solução de formaldeído 60 milimolar às amostras para rotulagem com dimetilação leve. Adicione oito microlitros de uma solução de formaldeído marcada com deutério 13 de carbono 60 milimolar às amostras para rotulagem com dimetilação pesada. Adicione oito microlitros de cianoborohidreto de sódio 24 milimolares às amostras marcadas com dimetilação leve.

Adicionar oito mircolitros de cianoboroduderida sódica 24 milimolares às amostras marcadas com dimetilação pesada. Vortex as amostras e, em seguida, agite suavemente em um agitador de tubo por cerca de 10 minutos em temperatura ambiente. Sacie as reações adicionando 16 microlitros de 1% de amônia por cinco minutos.

Reacidifique as misturas de reação adicionando oito microlitros de ácido fórmico a 5%. Combine os peptídeos dimetilados leves e pesados para gerar um total de seis amostras. Execute a dessalinização da amostra conforme descrito no protocolo de texto.

E seque as amostras por centrifugação a vácuo. Para ser marcação isobárica das amostras dimetiladas, primeiro, reconstituir 100 microgramas de peptídeos dimetilados e bicarbonato de trietilamônio, ou tampão TEAB. Em seguida, prepare os reagentes isobáricos de acordo com o protocolo do fabricante do kit de marcação isobárica.

Adicione o volume apropriado, neste caso, 41 microlitros do reagente de marcação isobárica solubilizado a cada uma das amostras de peptídeos e vortex por cerca de 10 segundos. Agite as amostras em um agitador de tubo de microcentrífuga por cerca de uma hora em temperatura ambiente. Para extinguir as reações, adicione 8 microlitros de hidroxilamina a cada amostra.

E incube as amostras por 15 minutos em temperatura ambiente. Agrupe as seis amostras rotuladas em uma única mistura e dessaline. Prepare os peptídeos para cromatogrose líquida reconstituindo os peptídeos em água de grau de espectrometria de massa com ácido fórmico a 0,1%.

Adicione peptídeos reconstituídos a um tubo de microcentrífuga contendo um filtro de 0,65 micrômetro. E centrifugue a 12.000 vezes g por um minuto. Remova e descarte o filtro.

Transfira os peptídeos filtrados para um frasco de amostrador automático. Injete seis microlitros de cada amostra de facção de troca catiônica forte em uma coluna de armadilha. Embale até dois centímetros com material de carbono 18.

Execute os métodos de espectrômetro de massa de separação analítica e aquisição de dados. Foi realizada uma análise cPilot de 12 plex de tecidos cerebrais, cardíacos e hepáticos de um modelo de camundongo com doença de Alzheimer e controles do tipo selvagem. Os dados precursores mostraram peptídeos dimetilados leves e pesados representados pelos picos em m/z 643,854 e 647,875.

Esses peptídeos foram selecionados, isolados independentemente e fragmentados com dissociação induzida por conluio para gerar esses espectros. Os resultados da pesquisa indicaram que os picos pertenciam a um peptídeo da proteína fosfoglicerato quinase um. Esses picos foram isolados ainda mais para espectrometria de massa em tandem de dissociação de conluio de alta energia e os íons repórteres são observados conforme mostrado.

Ambos os conjuntos de espectrometria de massa de estágio triplo são necessários para obter informações sobre as 12 amostras. Neste exemplo, as proporções de íons de controle da doença de Alzheimer para o tipo selvagem são semelhantes nas duas réplicas biológicas para tecidos cerebrais, hepáticos e cardíacos. Os valores de mudança de dobra para cada comparação sugerem que os níveis de fosfoglierato quinase um no cérebro e no coração são mais altos em camundongos com doença de Alzheimer, mas mais baixos no fígado.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente cinco horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter cuidado com o manuseio da amostra. Incorporados a este procedimento, métodos de separação como troca catiônica forte ou fracionamento de pH alto podem ser realizados para aumentar a profundidade e a cobertura diárias.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aprimorar a multiplexação de amostras usando o C-Pilot.