Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

O objetivo geral deste método multiplex aprimorado é aumentar o número de amostras proteicas que podem ser analisadas simultaneamente, ao mesmo tempo que se reduz o erro da amostra e o tempo de uso do equipamento. Este método pode auxiliar na resposta a questões fundamentais nas áreas de envelhecimento, doenças neurodegenerativas, outras doenças relacionadas à idade e câncer, que estão associadas à patogênese, progressão, diagnóstico, prognóstico e alvos terapêuticos. A principal vantagem desta técnica é a possibilidade de gerar um retrato abrangente das alterações proteicas em diversas condições.

Embora este método possa fornecer informações sobre a doença de Alzheimer em modelo murino, ele também pode ser aplicado a amostras de tecido de pacientes com Alzheimer ou uma variedade de outras doenças. Em geral, indivíduos novos neste método encontrarão desafiador porque há várias amostras a serem manipuladas simultaneamente em um curto espaço de tempo. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando reconhecemos que a acetilação poderia ser combinada com marcação isobárica para nitração de proteínas, o que nos motivou a desenvolver a técnica para funcionar globalmente em todos os peptídeos.

Este estudo analisará tecidos cerebrais, cardíacos e hepáticos de um modelo murino de doença de Alzheimer e controles do tipo selvagem. Transfira de 60 a 90 miligramas de cada amostra de tecido para um tubo de lise e adicione 500 microlitros de PBS com oito molar de ureia. Homogeneíze as amostras utilizando um homogeneizador mecânico.

Remova o homogenato tecidual do tubo de lise e transfira para um tubo de microcentrífuga. Enxágue o tubo de lise com 100 a 500 microlitros de PBS contendo oito molar de ureia e combine a solução de enxágue com o homogenato tecidual. Centrifugue o homogenato tecidual por 15 minutos.

Colete o sobrenadante de cada amostra. Após realizar o ensaio BCA para determinar a concentração de proteína, adicione 100 microgramas de proteína de cada amostra em tubos de microcentrífuga individualmente rotulados. Adicione ditiotreitol a cada amostra.

E incubar a 37 graus Celsius por duas horas. Adicione iodoacetamida, IAM, a cada amostra e incube no gelo, no escuro, por duas horas. Em seguida, adicione L-cisteína a cada amostra e incube à temperatura ambiente por 30 minutos.

Após 30 minutos, adicione tampão Tris com cloreto de cálcio para diluir a ureia até uma concentração final de dois molar. Adicione a tripsina tratada com L1-tosilimidotofeniletilcloreto de metila a cada amostra e incube a 37 graus Celsius por 24 horas.

No dia seguinte, interrompa a digestão proteica congelando rapidamente a amostra em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius até o processamento adicional. Antes da marcação por dimetilação, as amostras de peptídeos são desaladas, conforme descrito no protocolo textual, e secas por centrifugação a vácuo. Para iniciar o procedimento de marcação por dimetilação, reconstitua os peptídeos em ácido acético 1% dissolvido em água de grau HPLC ou água nanopura.

Retire uma porção de 50 microgramas de cada amostra para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Armazene o restante dos peptídeos reconstituídos a -80 °C para experimentos futuros. Nos passos que serão demonstrados a seguir, é fundamental adicionar os reagentes rapidamente para que as reações químicas ocorram pelo mesmo período de tempo em todas as amostras.

Adicione oito microlitros de uma solução de formaldeído 60 milimolar às amostras para marcação com dimetilação leve. Adicione oito microlitros de uma solução de formaldeído marcada com carbono 13 e deutério 60 milimolar às amostras para marcação com dimetilação pesada. Adicione oito microlitros de borohidreto de sódio cianeto 24 milimolar às amostras marcadas com dimetilação leve.

Adicione oito microlitros de cianoborohidreto de sódio 24 milimolar às amostras marcadas com dimetilação pesada. Vortexe as amostras e, em seguida, agite suavemente em um agitador de tubos por cerca de 10 minutos à temperatura ambiente. Interrompa as reações adicionando 16 microlitros de amônia 1% durante cinco minutos.

Reacidifique as misturas de reação adicionando oito microlitros de ácido fórmico a 5%. Combine os peptídeos dimetilados leves e pesados para gerar um total de seis amostras. Realize a dessalinização das amostras conforme descrito no protocolo textual.

E seque os amostras por centrifugação a vácuo. Para iniciar a marcação isobárica das amostras dimetiladas, primeiro, reconstitua 100 microgramas de peptídeos dimetilados em tampão de bicarbonato de trietilamônio, ou tampão TEAB. Em seguida, prepare os reagentes isobáricos de acordo com o protocolo do fabricante do kit de marcação isobárica.

Adicione o volume apropriado, neste caso, 41 microlitros do reagente de marcação isobárica solubilizado a cada uma das amostras de peptídeos e vortexe por cerca de 10 segundos. Agite as amostras em um agitador para tubos de microcentrifugação por cerca de uma hora à temperatura ambiente. Para encerrar as reações, adicione 8 microlitros de hidroxilamina a cada amostra.

E incubar as amostras por 15 minutos à temperatura ambiente. Agrupar as seis amostras marcadas em uma única mistura e dessalinar. Preparar os peptídeos para cromatografia líquida reconstituindo os peptídeos em água de grau para espectrometria de massas contendo 0,1% de ácido fórmico.

Adicione os peptídeos reconstituídos a um tubo de microcentrífuga contendo um filtro de 0,65 micrômetro. E centrifugue a 12.000 × g durante um minuto. Remova e descarte o filtro.

Transfira os peptídeos filtrados para um frasco de amostragem automática. Injete seis microlitros de cada amostra da fração de troca catiônica forte em uma coluna de retenção. Empacote com dois centímetros de material carbono 18.

Execute os métodos de separação analítica e de aquisição de dados do espectrômetro de massas. Foi realizada uma análise cPilot 12-plex de tecidos cerebrais, cardíacos e hepáticos de um modelo murino de doença de Alzheimer e controles do tipo selvagem. Os dados de precursores mostraram peptídeos dimetilados leves e pesados representados pelos picos em m/z 643,854 e 647,875.

Esses peptídeos foram selecionados, isolados independentemente e fragmentados com dissociação induzida por colisão para gerar esses espectros. Os resultados da busca indicaram que os picos pertenciam a um peptídeo da proteína fosfoglicerato quinase um. Esses picos foram isolados posteriormente para espectrometria de massas em tandem com dissociação colisional de alta energia e os íons marcadores são observados conforme mostrado.

Os dois conjuntos de espectros de espectrometria de massas em triplo estágio são necessários para obter informações sobre as 12 amostras. Neste exemplo, as razões entre íons de doença de Alzheimer e controle tipo selvagem são semelhantes entre os dois replicados biológicos para os tecidos cerebral, hepático e cardíaco. Os valores de variação expressa para cada comparação sugerem que os níveis de fosfoglicerato quinase um no cérebro e no coração são mais altos em camundongos com doença de Alzheimer, mas mais baixos no fígado.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em aproximadamente cinco horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado com o manuseio da amostra. Incorporados a este procedimento, métodos de separação como troca catiônica forte ou fracionamento em pH elevado podem ser realizados para aumentar a profundidade e a cobertura diárias.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aprimorar a multiplexação de amostras utilizando o C-Pilot.