Name: A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a In vitro Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprenda a clonar genes gag derivados de pacientes em plasmídeos HIV-1 MJ4 para avaliar a capacidade de replicação viral in vitro. Este método viabiliza estudos de patogênese do HIV-1 subtipo C.

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Os investigadores agradecem a todos os voluntários na Zâmbia que participaram deste estudo e a todos os funcionários do Projeto de Pesquisa de HIV Zambia Emory em Lusaka que tornaram este estudo possível. Os investigadores gostariam de agradecer a Jon Allen, Smita Chavan e Mackenzie Hurlston pela assistência técnica e gerenciamento de amostras. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Mark Brockman por suas discussões e generosa doação das células GXR25.
Este estudo foi financiado pelo R01 AI64060 e R37 AI51231 (EH) e pela International AIDS Vaccine Initiative. Este trabalho foi possível em parte graças ao generoso apoio do povo americano por meio da Agência dos Estados Unidos para o Desenvolvimento Internacional (USAID). O conteúdo é de responsabilidade dos autores do estudo e não reflete necessariamente as opiniões da USAID ou do governo dos Estados Unidos. Este trabalho também foi apoiado, em parte, pelo Núcleo de Virologia do Centro Emory de Pesquisa da AIDS (Grant P30 AI050409). DC e JP foram apoiados em parte pela Action Cycling Fellowships. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão básica do Centro Nacional de Pesquisa de Primatas de Yerkes (2P51RR000165-51). Este projeto também foi financiado em parte pelo Centro Nacional de Recursos de Pesquisa P51RR165 e atualmente é apoiado pelo Escritório de Programas de Infraestrutura de Pesquisa / OD P51OD11132.

Os autores não têm nada a divulgar.

Devido à extensão e natureza técnica deste protocolo, há várias etapas que são fundamentais tanto para a construção bem sucedida de plasmídeos quiméricos Gag-MJ4, bem como para a quantificação da capacidade de replicação viral. Embora a estratégia de clonagem baseado enzima de restrição para a introdução de genes gag estrangeira em MJ4 descritas neste protocolo tem inúmeras vantagens sobre os métodos baseados recombinação utilizados anteriormente, o protocolo pode ser tecnicamente difícil, se as etapas críticas...

Determinar o host e as características virais que influenciam HIV-1 patogênese e progressão da doença é fundamental para o desenho racional de vacina. A resposta imune celular é um componente chave da resposta imunitária humana a infecção por HIV-1. Os linfócitos T citotóxicos (CTL) são necessários para o controle inicial da viremia aguda, e permitir que o host para estabelecer um estado de equilíbrio (set point) da carga viral 1,2. Depleção Experimental destas células efectoras resulta na perda de controlo viral 3,4. Apesar disso, escapar mutações surgem dentro do genoma viral que subverter reconhecimento CTL de células infectadas por vírus 5-9. Certos alelos HLA têm sido associados com baixas cargas virais e mais lenta a progressão da doença, incluindo o B * 57, B * 27, B * 81 10-15. Parte do benefício de protecção de alelos de HLA de classe I pode ser atribuída ao facto de que eles têm como alvo regiões funcionalmente restritas do genoma, tais como gage seleccionar a presença de mutações de escape que diminuem a capacidade do vírus se replicar in vitro 16-21. Apesar de fuga do sistema imune celular é benéfica para o vírus no contexto da classe I de HLA de selecção de alelos, o efeito de tais mutações podem ter consequências diferenciais para o hospedeiro durante a transmissão para um indivíduo de HLA desemparelhado 22,23. Portanto, compreender os efeitos de mutações de escape transmissíveis associadas ao HLA sobre a capacidade de replicação viral será importante para promover nossa compreensão de início de HIV-1 patogênese. Embora muito progresso tem sido feito para identificar e caracterizar os defeitos da aptidão de mutações de escape individuais associados a HLA de classe específico I alelos 24-29, que ocorre naturalmente isolados HIV-1 têm pegadas únicas e complexas de polimorfismos HLA-associado, provavelmente decorrente do HLA pressão imune mediada de diferentes origens imunogenéticas 30. Em apanálise revious, Goepfert et al. mostraram que a acumulação de mutações associados a HLA-nas sequências derivadas de Gag transmitidos 88 zambianos agudamente infectadas foi associada com uma redução no ponto de ajuste da carga viral 31. Isto sugeriu que a transmissão de mutações de escape nocivos, especificamente em Gag, para os receptores de HLA desemparelhado fornece um benefício clínico, e pode ser atenuada devido à replicação viral. Seguindo em frente, é imperativo para estudar como as combinações de polimorfismos da mordaça complexa dentro isolados que ocorrem naturalmente trabalhar em conjunto para definir as características do vírus transmitido como a capacidade de replicação, e como replicação precoce pode por sua vez afetar HIV-1 e parâmetros clínicos em estágio final patogênese. Brockman et al. Demonstrou pela primeira vez uma ligação entre a capacidade de replicação seqüências gag-pro do isolado durante a infecção fase crônica e carga viral, tanto subtipo C e infecções B32-35. A abordagem experimental apresentadas nesses estudos, embora adequado para analisar a capacidade de replicação in vitro de sequências derivadas de indivíduos cronicamente infectados, tem algumas ressalvas técnicas e limitações que torna o estudo HIV-1 capacidade de replicação no subtipo C indivíduos infectados de forma aguda difícil. Este método baseia-se na recombinação de seqüências de PCR amplificados com base populacional para o subtipo B NL4-3 pró-vírus, o que derivou em parte de LAV, um laboratório adaptado estoque de vírus 36. Geração de vírus foi realizada por co-transfecção de uma linha de células T baseia-CEM 37 com amplicões PCR digerido e delta-gag-pro NL4-3 ADN. Este método exige o crescimento de vírus durante um período de semanas a meses, distorcendo potencialmente, a natureza do material de vírus recuperado em relação aos quasiespie viral in vivo, e, portanto, altera a medição da capacidade de replicação in vitro. Este método ié mais adequado para o estudo indivíduos cronicamente infectadas, quando seleciona eficazmente para o vírus com a mais elevada capacidade de replicação, e onde a clonagem numerosas variantes virais diferentes a partir de um grande número de indivíduos cronicamente infectados é bastante trabalhoso e, por conseguinte, não é viável. No entanto, dentro de um indivíduo com infecção aguda, há geralmente 1-2 variantes presente e eliminando assim o risco de distorcer a natureza da ação do vírus recuperado, através in vitro pressões de seleção, permite uma avaliação mais precisa da capacidade de replicação em vitro. Em segundo lugar, este método requer sequências gag-pro subtipo C recombinação em um subtipo B espinha dorsal derivadas, e pode apresentar desvios incompatibilidade backbone para a análise. Devido a essas limitações, um grande número de sequências devem ser analisados ​​a fim de superar quaisquer potenciais vieses introduzidos. Aqui nós descrevemos um apro experimental alternativaada apropriado para estudar as sequências derivadas do subtipo C indivíduos com infecção aguda. Nós usamos uma estratégia de clonagem com base de enzima de restrição para introduzir o gene gag derivada de pontos agudos tempo infecção de indivíduos infectados pelo HIV-1 do subtipo C no esqueleto proviral subtipo C, MJ4. O uso de MJ4 como uma espinha dorsal comum, no qual para clonar genes gag é crucial para a análise das sequências derivadas do subtipo C. MJ4 é derivado de um isolado primário 38, e, portanto, seria menos provável a introdução de viés devido ao subtipo incompatibilidade entre o backbone e gene gag. Além disso, a abordagem de clonagem de enzima à base de restrição permite a proviral constrói a ser transfectada directamente em células 293T, e para a recuperação de um estoque de vírus clonal idêntica à sequência gag clonada. O método apresentado a seguir é um método de alto rendimento para avaliar a capacidade de replicação do subtipo C derivado Gag-MJ4vírus quiméricos. A transfecção para células 293T é simples e recuperação de vírus tem apenas três dias. Em capacidade de replicação in vitro é ensaiada na mesma linha de células T baseia-CEM CCR5 criado por Brockman et al. 37, mas usando modificações do protocolo importantes necessárias para a replicação de sucesso do subtipo C MJ4 vírus quiméricos. O uso de uma linha de células T apropriado, em vez de PBMC permite um grande número de vírus do subtipo C-MJ4 quimérica para ser testado com o ensaio de alta reprodutibilidade. Finalmente, usando um ensaio de transcriptase reversa radiomarcado para quantificação do vírus no sobrenadante é mais rentável do que usar p24 disponível comercialmente kits ELISA. Ele também dá uma maior amplitude dinâmica, o que foi importante para a detecção de ambos os vírus mal e altamente replicar dentro do mesmo ensaio e para detectar diferenças sutis na replicação entre os isolados. Em conclusão, o método aqui apresentado tem permitidoo estudo aprofundado da capacidade de replicação das sequências derivadas de gag do HIV-1 subtipo C com infecção aguda indivíduos da Zâmbia, e como está escrito, também poderia ser expandido para estudar outro subtipo C infectados populações. Observou-se um alto grau de variação nas capacidades de replicação entre os diferentes isolados da mordaça. Além disso, fomos capazes de mostrar uma associação estatística entre a capacidade de replicação do Gag transmitida e carga viral do ponto de ajuste, bem como com CD4 + declínio ao longo de um período de três anos 39. Esses resultados destacam a importância de se estudar as características virais como transmissíveis, como a capacidade de replicação, interagir com o sistema imune do hospedeiro para influenciar patogênese durante a infecção inicial e será fundamental para o desenvolvimento de intervenções vacina eficaz, bem como o tratamento.

<table><tr><tbody><td colspan="4">PCR Reagents</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom</td><td>Oligo 25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR</td> <td>3'IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTCTGCTTGCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalinização padrão</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Fabricado pela Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 Tubos de Tira, Azul (Tampa Plana)</td> <td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III sistema RT-PCR de uma etapa</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II DNA polimerase</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucleotide Misture</td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, alta resistência em gel</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb DNA ladder</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Fabricado pela Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel e Sistema de limpeza PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear,</td><td>Fisher</td><td>12-640</td> de um gume <td>Fabricado pela Surgical Design</td></tr><tr><td>Thermocycler, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microbiology & Reagentes de clonagem</td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de poliestireno estéreis 100 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Tubos de polipropileno de fundo redondo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>Endonuclease de restrição de</td> HpaI <td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>Endonuclease de restrição de BclI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>Endonuclease de restrição de HpaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase, 5 U/&mu; l</td><td>Células</td> competentes <td>Roche 10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109, >108 cfu/&mu; g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de minipreparação de plasmídeo PureYield</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Transiluminador de luz azul</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagentes de cultura de células</td></tr><tr><td>Limpador / desinfetante de ampilo</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td></td><td>VWR PAE2311</td><td>Fabricado pela Promega</td></tr><tr><td>Brometo de hexadimetrina (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Placas Costar, 6 poços, planas</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Fabricadas pela Corning Life</td></tr><tr><td>Placas Costar, 24 poços, planas</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Fabricadas pela Corning Life</td></tr><tr><td>Placas Costar, 96 poços, redondas</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Fabricado pela Corning Life</td></tr><tr><td>Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Fabricado pela Corning Life</td></tr><tr><td>Conical Tubes, 50 ml, tampa azul</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Fabricado pela BD Biosciences</td></tr><tr><td>Tubos cônicos, 15 ml, tampa azul</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>Fabricado pela BD Biosciences</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Fabricado pela Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/ Estreptomicina/Glutamina, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS com magnésio e cálcio, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS sem magnésio e cálcio</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Sarstedt, cores sortidas</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Bandejas de reservatório para Multicanal, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca tratada com cultura de tecidos de fundo em V transparente Corning 96 Fisher</td><td></td><td>07-200-96</td><td>Fabricado pela Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES, solução tampão de 1 m</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Definido, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>fabricado pela Promega</td></tr><tr><td>Glutaraldeído, Grau II, 25% em H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M Solução de cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído, para biologia molecular, 36,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potássio hexacianoferrato(II) trihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hexacianoferrato de potássio(III)</td><td>Centrífuga Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15-R</td> Contador de células automatizado <td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Microscópio</td> invertido <td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">Reagentes de Ensaio de Quantificação de Transcriptase Reversa</td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8.0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Deve ser ajustado para pH 7.8 com KOH</td></tr><tr><td>2 M Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Ajustar para solução 1 M</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Ácido poliadenílico (Poly rA) sal de potássio&nbsp;</td><td>Midland Reagent Co.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) primer</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, Tela de Fósforo de Super Resolução, Pequeno</td> Modelo de placa de 96 poços <td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell (M) Policarbonato</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>Fabricado pela Corning Life</td></tr><tr><td>Fita de vedação de alumínio de microplaca de 96 poços Corning, não estéril</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Fabricado pela Corning Life</td></tr><tr><td>DE-81 papel de troca aniônica</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>de autorradiografia</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Cyclone armazenamento de tela de phoshpor</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a enzima de restrição método baseado clonagem para avaliar a<em&gt; in vitro</em&gt; replicação capacidade de hiv-1 do subtipo c gag-mj4 quiméricos vírus

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

O efeito protetor de muitos alelos HLA classe I na patogênese do HIV-1 e na progressão da doença é, em parte, atribuído à sua capacidade de atingir porções conservadas do genoma do HIV-1 que escapam com dificuldade. Alterações de sequência atribuídas à pressão imunológica celular surgem em todo o genoma durante a infecção e, se encontradas em regiões conservadas do genoma, como Gag, podem afetar a capacidade do vírus de se replicar in vitro. A transmissão de polimorfismos ligados ao HLA em Gag para receptores incompatíveis com HLA tem sido associada a cargas virais de ponto de ajuste reduzidas. Nossa hipótese pode ser devido a uma capacidade reduzida de replicação do vírus. Aqui apresentamos um novo método para avaliar a replicação in vitro do HIV-1 influenciada pelo gene gag isolado de pontos de tempo agudos de zambianos infectados pelo subtipo C. Este método usa clonagem baseada em enzima de restrição para inserir o gene gag em um esqueleto proviral comum do HIV-1 subtipo C, MJ4. Isso o torna mais apropriado para o estudo de sequências do subtipo C do que os métodos anteriores baseados em recombinação que avaliaram a replicação in vitro de sequências gag-pro derivadas cronicamente. No entanto, o protocolo pode ser prontamente modificado para estudos de vírus de outros subtipos. Além disso, este protocolo detalha um método robusto e reprodutível para avaliar a capacidade de replicação dos vírus quiméricos Gag-MJ4 em uma linhagem de células T baseada em CEM. Este método foi utilizado para o estudo de vírus quiméricos Gag-MJ4 derivados de 149 zambianos infectados agudamente do subtipo C e permitiu a identificação de resíduos em Gag que afetam a replicação. Mais importante, a implementação dessa técnica facilitou uma compreensão mais profunda de como a replicação viral define parâmetros da patogênese precoce do HIV-1, como carga viral de ponto de ajuste e declínio longitudinal de células T CD4 +.

A fim de executar corretamente este protocolo, o que cria um plasmídeo proviral capaz de montar totalmente funcionais, infecciosas quimeras Gag-MJ4, deve ser tomado muito cuidado para gerar os amplicons PCR adequados. Determinar se a PCR tem gerado o amplicon mordaça de tamanho adequado é fundamental. Os produtos devem estar dentro de 100 pares de bases (pb) do fragmento amplificado de aproximadamente 1700 pb apresentado na Figura 1A. O comprimento exacto deste fragmento irão variar de acordo c...

A patogênese do HIV-1 é definida tanto pelas características virais quanto pelos fatores genéticos do hospedeiro. Aqui descrevemos um método robusto que permite medições reprodutíveis para avaliar o impacto da variação da sequência do gene gag na capacidade de replicação in vitro do vírus.

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a<em&gt; In vitro</em&gt; Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

O objetivo geral deste procedimento é inserir genes gag derivados de indivíduos infectados pelo HIV1 subtipo C em um plasmídeo de HIV1 com capacidade de replicação, a fim de avaliar o efeito de polimorfismos na sequência de gag sobre a capacidade de replicação do HIV1 in vitro. Isso é realizado primeiramente amplificando o gene gag a partir do plasma do paciente. O segundo passo consiste em clonar a sequência de gag derivada do paciente no clone molecular infeccioso competente para replicação MJ-four. Em seguida, o plasmídeo quimérico gag-MJ-four é transfectado para gerar estoques virais infecciosos, que são titulados para avaliar a infectividade em uma linhagem celular indicadora. O passo final é medir a capacidade de replicação in vitro na linhagem celular T GXR-25. Por fim, um ensaio de transcriptase reversa marcado com radionuclídeo é utilizado para quantificar a produção de viriões ao longo do tempo, permitindo visualizar a cinética de replicação viral.O método que vamos descrever hoje pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do HIV. Essas incluem definir os determinantes da aptidão replicativa do HIV e compreender como a aptidão do HIV afeta a patogênese a longo prazo. Descrevendo os métodos hoje estarão Jessica Prince e Dan Claiborne, dois dos meus alunos de pós-graduação.Para iniciar este procedimento, realize a transcrição reversa de cDNA a partir de RNA e amplifique os produtos de DNA da primeira rodada utilizando transcriptase reversa e uma DNA polimerase termoestável em uma reação de RT-PCR em um único passo. Em seguida, usando um microlitro da amplificação PCR da primeira rodada como molde de DNA, realize uma amplificação PCR aninhada de segunda rodada. A seguir, adicione três microlitros de corante carregador 5X a cinco microlitros do volume da reação da segunda rodada.Execute-o a 120 volts em um gel de agarose 1% TAE contendo um corante fluorescente de DNA para UV até que as bandas sejam resolvidas. Em seguida, visualize as bandas de 1,6 kb em um iluminador de luz azul. Depois disso, execute o volume restante da reação de 45 microlitros em um gel de agarose 1% TAE contendo o corante de DNA. Recorte as bandas apropriadas com uma lâmina de barbear limpa e combine três reações positivas por indivíduo. Posteriormente, extraia o DNA do fragmento de gel usando um kit de purificação de gel e elua-o em água livre de nucleases. Congele o produto a menos 20 graus Celsius para uso posterior. 0:15:56 Neste procedimento, após amplificar a região do LTR cinco prime UTR do plasmídeo MJ-quatro, visualize os produtos de PCR de 1,3 kb no iluminador. Recorte os amplicons positivos, purifique-os e congele-os conforme descrito anteriormente. Em seguida, crie os amplicons fundidos LTR-gag do MJ-quatro por meio de PCR de extensão com sobreposição de splice. Visualize, recorte, purifique e congele o amplicon longo de 3,2 kb. Agora, digira 1,5 microgramas do plasmídeo MJ-quatro e 1,5 microgramas do produto de PCR LTR-gag purificado com a endonuclease de restrição BCL-um por 1,5 hora a 50 graus Celsius. Posteriormente, adicione um microlitro de NGOM-quatro à reação de digestão e incube-a a 37 graus Celsius por uma hora. Depois disso, adicione corante de carregamento 5x às reações de digestão por restrição. Realize lentamente a eletroforese do volume total em um gel de agarose 1%, TAE, contendo um corante de DNA por uma a duas horas a 100 volts. Visualize, recorte e purifique as bandas indicadas para clonagem conforme descrito anteriormente.Em seguida, prepare as reações de ligação utilizando o inserto purificado LTR-gag e o DNA do vetor MJ-four numa proporção de três para um de inserto em relação ao vetor. Incube as reações de ligação durante a noite a quatro graus Celsius.Em seguida, transforme bactérias JM-109 quimicamente competentes com os produtos de ligação espalhados em placas de ágar LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube as bactérias transformadas a 30 graus Celsius por pelo menos 22 horas. Para confirmar a fidelidade da clonagem, digira o DNA de mini-prep com as enzimas de restrição NGOM-quatro e HPA-um em um digestão dupla a 37 graus Celsius por duas horas.Posteriormente, analise em um gel de agarose 1% em tampão TAE. Calcule o volume de vírus necessário de cada estoque com base na titulação em UI por microlitro obtida em ensaio com células TZM-BL, a fim de infectar cinco vezes 10 à quinta potência de células GXR-25 com uma multiplicidade de infecção de 0,05. Certifique-se de utilizar equipamento de proteção individual adequado para trabalho com HIV capaz de replicação, o que inclui jaleco completo, máscara facial e luvas duplas. No dia da infecção, retire os estoques de vírus do congelador a menos 80 graus Celsius e descongele. Em seguida, dilua o vírus em meio C-R-P-M-I até um volume de 100 microlitros, de modo a obter um MOI de 0,05. Adicione ao poço em formato de V, tratado para cultura de tecidos, de uma placa de 96 poços, incluindo tanto um controle positivo quanto um controle negativo em cada conjunto de experimentos de replicação, e monte a placa de forma que a cada outro poço esteja vazio, limitando assim a contaminação cruzada entre poços. Posteriormente, conte as células GXR-25 utilizando um contador automático de células e calcule o número total de células necessário para todas as infecções. Aliquote o volume necessário em um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue para obter o pellet celular. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio e ressuspenda em C-R-P-M-I numa concentração de cinco vezes 10 à quinta potência de células por 100 microlitros. Pipete as células em um reservatório estéril e misture completamente. Subsequentemente, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de células em cada poço da placa de 96 poços contendo o vírus diluído e misture completamente. Depois disso, adicione dois microlitros de solução de polibreno a cinco miligramas por mililitro em cada poço e misture bem as células. Incube então a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos com 5% de CO2 por três horas.Para lavar as células infectadas, centrifugue a placa de fundo V de 96 poços para formar o pellet celular. Em seguida, remova cuidadosamente 150 microlitros do meio e substitua por 150 microlitros frescos de C-R-P-M-I sem perturbar o pellet celular. Repita o procedimento mais duas vezes para lavar adequadamente as células. Após a última centrifugação e a adição de 150 microlitros de C-R-P-M-I, ressuspenda o pellet celular com uma pipeta multicanal. Adicione a mistura de cada poço a 800 microlitros de C-R-P-M-I em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Em seguida, coloque a placa em um incubador de cultura de tecidos com 5% de CO₂ a 37 graus Celsius. A cada dois dias, transfira 100 microlitros do sobrenadante da superfície do poço de cultura para um poço de uma placa de fundo U de 96 poços e congele para análise subsequente utilizando o ensaio de RT. Em seguida, ressuspenda completamente as células e remova metade do volume restante para evitar o crescimento excessivo celular. Depois disso, restabeleça o volume original adicionando 550 microlitros de C-R-P-M-I fresco a cada poço. Neste procedimento, adicione um a dois microlitros de DTTP a 10 milicurie por mililitro e quatro microlitros de DTT a um molar a cada alíquota de um mililitro da mistura mestra de RT. Misture cuidadosamente cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo a mistura mestra de RT, DTT e DTTP com uma pipeta de 1000 microlitros e transfira para um recipiente estéril.A seguir, distribua 25 microlitros da mistura de RT rotulada em cada poço de uma placa PCR de 96 poços com paredes finas. Adicione cinco microlitros de cada sobrenadante à placa PCR contendo a mistura mestra de RT. Em seguida, sela a placa PCR com uma tampa de folha adesiva e incuba por duas horas a 37 graus Celsius em um termociclador. Após a incubação, faça pequenos furos na tampa de folha usando uma pipeta multicanal de 200 microlitros. Misture as amostras cinco vezes. Transfira cinco microlitros de cada amostra para papel DE-81 e deixe todas as amostras secarem ao ar por 10 minutos. Coloque as manchas em recipientes de lavagem separados. Posteriormente, lave as manchas cinco vezes com SSC 1X. Depois, duas vezes com etanol a 90% por cinco minutos por lavagem antes de deixá-las secar ao ar. Uma vez secas, envolva cuidadosamente a mancha em filme plástico e exponha-a à tela fosforescente em um cassete hermético durante a noite à temperatura ambiente.Uma vez prontos, analise as telas de fosforilação com um fosfoimager e quantifique os transcritos radioativos.Apresentadas aqui estão as imagens representativas dos géis que mostram a separação eletroforética dos diversos amplicons de PCR necessários para gerar um amplicon de gag derivado de paciente, capaz de ser clonado no vetor plasmidial MJ-four. Esta imagem representativa de gel mostra a separação eletroforética dos digestos de restrição para clonagem dos genes gag de pacientes no MJ four.E esta imagem representativa de gel mostra a separação eletroforética de digestões com enzimas de restrição de um DNA plasmidial purificado do quimera gag MJ-quatro. Este gráfico mostra a reprodutibilidade do ensaio de replicação ao longo do tempo na linhagem celular GXR-25. Os mesmos vírus quiméricos gag MJ-quatro foram utilizados para infectar células GXR-25 em dois experimentos independentes realizados aproximadamente um ano após o outro.Os escores de replicação foram gerados calculando a inclinação dos valores de DLU transformados em log e normalizando essa inclinação ao tipo selvagem MJ-quatro. As duas medições independentes são fortemente correlacionadas e destacam a reprodutibilidade dos ensaios realizados em momentos diferentes e com células em diferentes passagens. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de HIV AIDS explorarem os determinantes virais da patogênese, na infecção aguda pelo subtipo C, o subtipo mais prevalente no mundo. Trabalhar com HIV capaz de replicação pode ser extremamente perigoso. Todas as etapas que envolvem vírus vivos devem ser realizadas em uma instalação BSL dois mais. Todas as superfícies devem ser descontaminadas regularmente e luvas duplas devem ser usadas em todos os momentos.

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Research

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este experimento visualizado é um guia para a utilização de um clone fluorescentes molecular do HIV para viver experiências imagem confocal.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

Dois métodos de formação de heterocários Descobrir Fatores de restrição HCV

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Compreender as conformações dos antígenos de superfície viral é necessário para avaliar a neutralização de anticorpos e orientar o projeto de imunógenos vacinais eficazes. Aqui descrevemos um ensaio ELISA baseado em células que permite o estudo do reconhecimento do Env trimérico do HIV-1 expresso na superfície das células transfectadas por anticorpos anti-Env específicos.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

A competição de crescimento entre vírus quase isogênicos fornece uma medida sensível para determinar a aptidão relativa da replicação. Os protocolos descritos aqui incluem a construção de clones recombinantes do HIV-1, propagação do vírus e competição de crescimento e métodos de análise otimizados para produzir resultados sensíveis e consistentes.

Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos

Aqui, é apresentado um protocolo para a criação de um cromossomo artificial bacteriano infeccioso contendo um cDNA de comprimento total do RNA genômico de fita positiva do vírus da encefalite japonesa. Este protocolo pode ser usado para construir um cDNA funcional de outros vírus de RNA de fita positiva, tornando-o uma poderosa ferramenta genômica para estudar a biologia do vírus.

Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

Nós apresentamos um fluxo de trabalho de engenharia do genoma para a geração de novos modelos in vitro para a infecção de HIV-1 que recapitular integração proviral em locais seleccionados genômicas. Segmentação dos repórteres HIV-derivado é facilitada pela manipulação de genoma CRISPR-Cas9-mediada, site-specific. Protocolos detalhados para geração de clone de célula única, triagem e verificação de direcionamento correta são fornecidos.

Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração

Aqui nós apresentamos uma abordagem profunda de sequenciamento que fornece uma análise imparcial da nascente 3'-termini, bem como perfis mutacional de moléculas de DNA único-encalhado. A aplicação principal é a caracterização de DNAs complementares retrovirais nascentes (cDNAs), os intermediários gerados durante o processo de transcrição reversa retroviral.

Determinante 3'-Termini e sequências de moléculas de ADN Viral de Single-Stranded nascente durante o HIV-1 inverter transcrição em células infectadas

Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.

Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Aqui, descrevemos alguns métodos estabelecidos para determinar o estresse do retículo endoplasmático (ER) e a ativação da resposta proteica desdobrada (UPR), com ênfase particular na infecção pelo HIV-1. Este artigo também descreve um conjunto de protocolos para investigar o efeito do estresse do RE/UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion.

Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

Aprenda a clonar genes gag derivados de pacientes em plasmídeos HIV-1 MJ4 para avaliar a capacidade de replicação viral in vitro. Este método viabiliza estudos de patogênese do HIV-1 subtipo C.

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a In vitro Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus (Vídeo) | JoVE Journal

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a

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