A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a In vitro Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus

O objetivo geral deste procedimento é incorporar genes gag derivados do subtipo CHIV um indivíduos infectados em um plasmídeo HIV um competente para replicação. Para avaliar o efeito dos polimorfismos da sequência gag na capacidade de replicação do HIV um in vitro, isso é feito primeiro amplificando o gene gag do plasma do paciente. O segundo passo é clonar a sequência gag derivada do paciente no clone molecular infeccioso competente para replicação MJ quatro.

Em seguida, o plasmídeo quimera gag MJ quatro é transfectado para gerar estoques virais infecciosos e titulado para avaliar a infectividade em uma linha celular indicadora. A etapa final é medir a capacidade de replicação in vitro na linhagem de células T G XR 25. Em última análise, um ensaio de transcriptase reversa marcado com rádio é usado para quantificar a produção de vírion ao longo do tempo, a fim de visualizar a cinética de replicação viral.

O método que vamos descrever hoje pode ajudar a responder a questões-chave no campo do HIV. Isso inclui a definição dos determinantes da aptidão replicativa do HIV e a compreensão de como a aptidão do HIV afeta a patogênese a longo prazo. Descrevendo os métodos hoje estarão Jessica Prince e Dan Klaban, dois de meus alunos de pós-graduação.

Para iniciar este procedimento, transcreva reversamente o CDNA do RNA e amplifique os primeiros produtos de DNA redondos usando transcriptase reversa e uma DNA polimerase termoestável em uma RT PCR de uma etapa. Em seguida, usando um microlitro da amplificação de PCR de primeira rodada como modelo de DNA, execute uma amplificação de PCR de segunda rodada aninhada. Em seguida, adicione três microlitros de cinco corantes de carga a cinco microlitros do volume de reação da segunda rodada.

Execute-o a 120 volts em um gel TAE 1%aros contendo uma coloração de DNA fluorescente UV até que as bandas sejam resolvidas. Em seguida, visualize as bandas de 1,6 KB em um iluminador de luz azul. Depois disso, execute o volume de reação restante de 45 microlitros em um gel TAE de 1% de aros contendo a coloração de DNA.

Extirpar as faixas apropriadas com uma lâmina de barbear limpa e combinar três reações positivas por indivíduo. Em seguida, extraia o DNA da fatia de gel usando um kit de purificação de gel e use-o na água livre de nuclease. Congele o produto a menos 20 graus Celsius para uso posterior neste procedimento.

Depois de amplificar o terminal longo, repita cinco regiões UTR primárias do plasmídeo MJ quatro. Visualize os produtos de PCR de 1,3 KB no iluminador, retire os amplicons positivos, purifique-os e congele-os conforme descrito anteriormente. Em seguida, crie os amplificadores de mordaça MJ quatro LTR fundidos por meio de PCR de extensão de sobreposição de emenda.

Visualize, excise, purifique e congele o amplicon de 3,2 kb de comprimento. Agora digerir 1,5 microgramas de plasmídeo MJ quatro e 1,5 microgramas de produto de PCR LTR purificado com BCL uma endonuclease de restrição por 1,5 horas a 50 graus Celsius. Em seguida, adicione um microlitro de NGOM quatro à reação de digestão e incube-o a 37 graus Celsius por uma hora.

Depois disso, adicione cinco corantes de carregamento às reações de digestão de restrição. Eletroforese lentamente o volume total em um gel TAE 1% aros contendo uma coloração de DNA por uma a duas horas a 100 volts. Visualize, excise e purifique as bandas indicadas para clonagem, conforme descrito anteriormente.

Em seguida, prepare as reações de ligadura usando mordaça LTR purificada. Insira um DNA de quatro vetores MJ em uma proporção de três para um inserto para vetor. Incube as reações de ligação durante a noite a quatro graus Celsius.

Em seguida, transforme JM 1 0 9 bactérias quimicamente competentes com produtos de ligadura espalhados em placas de trado LB com 100 microgramas por mililitro. A ampicilina cresce bactérias transformadas a 30 graus Celsius por pelo menos 22 horas. Para confirmar a fidelidade da clonagem, corte o DNA da mini preparação com enzimas de restrição NGO M quatro e HPA um em uma digestão dupla a 37 graus Celsius por duas horas.

Depois, analise-o em 1% aros. Gel TAE. Calcule o volume de vírus necessário de cada estoque com base no título de UI por microlitro de um ensaio de células TZM BL para infectar cinco vezes 10 elevado ao quinto G XR duas cinco células a uma multiplicidade de infecção de 0,05.

Certifique-se de usar equipamento de proteção individual adequado para trabalhar com HIV competente para replicação, que inclui um avental completo, máscara facial e luvas duplas no dia da infecção. Remova os estoques de vírus do freezer de 80 graus Celsius negativos e descongele. Em seguida, dilua o vírus em meio C-R-P-M-I para um volume de 100 microlitros.

Para obter um MOI de 0,05, adicione-o à placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos vbo, incluindo um controle positivo e negativo em cada conjunto de experimentos de replicação e configure a placa de forma que todas as outras colunas fiquem em branco para limitar a contaminação cruzada entre os poços. Depois, conte o GXR duas células de cinco usando um contador de células automatizado e calcule o número de células necessárias no total para todas as infecções. Alíquota do volume necessário em um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue para pellet as células.

Em seguida, aspirar cuidadosamente o meio e ressuspender em C-R-P-M-I a uma concentração de cinco vezes 10 elevado à quinta célula por 100 microlitros, pipetar as células para uma calha estéril e misturar bem. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de células em cada poço da placa de 96 poços contendo o vírus diluído e misture bem. Depois disso, adicione dois microlitros de cinco miligramas por mililitro de solução de poli cérebro a cada poço e misture bem as células.

Em seguida, incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos com 5% de CO2 por três horas para lavar a centrífuga das células infectadas. A placa inferior em V de 96 poços para pellet as células. Em seguida, remova cuidadosamente 150 microlitros do meio e substitua por 150 microlitros de C-R-P-M-I sem perturbar o pellet celular.

Repita o procedimento mais duas vezes para lavar suficientemente as células após a última centrifugação e a adição de 150 microlitros de C-R-P-M-I ressuspenda o pellet celular com uma pipeta multicanal. Adicione a mistura de cada poço a 800 microlitros de C-R-P-M-I em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos de 5% de CO2 a 37 graus Celsius a cada dois dias.

Transfira 100 microlitros de sobrenadante da superfície do poço de cultura para um poço de uma placa inferior de 96 poços e congele para análise subsequente usando o ensaio RT, em seguida, ressuspenda as células completamente e remova metade do volume restante para evitar o crescimento excessivo das células. Depois disso, restaure o volume original adicionando 550 microlitros de CRMI fresco a cada poço neste procedimento, adicione um a dois microlitros de 10 milicuries por mililitro de DTTP e quatro microlitros de um molar DIO três etol a cada alíquota de um mililitro de nossa mistura principal. Misture cuidadosamente cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro de RT master mix DTT e DTTP com uma pipeta de 1000 microlitros e transfira para uma calha estéril.

Em seguida, dispense 25 microlitros de RT rotulado. Misture em cada poço de uma placa de PCR de parede fina de 96 poços. Adicione cinco microlitros de cada sobrenadante à placa de PCR que contém a mistura principal RT. Em seguida, sele a placa de PCR com uma tampa de folha adesiva e incube por duas horas a 37 graus Celsius em um termociclador após a incubação, faça pequenos furos na tampa de alumínio usando uma pipeta multicanal de 200 microlitros.

Misture as amostras cinco vezes. Transfira cinco microlitros de cada amostra para papel DE 81 e deixe todas as amostras secarem ao ar por 10 minutos. Coloque as manchas em recipientes separados.

Em seguida, lave os borrões cinco vezes com um XSSC. Em seguida, duas vezes com etanol a 90% por cinco minutos por lavagem antes de deixá-los secar ao ar. Depois de seco, embrulhe cuidadosamente a mancha em filme plástico Saran e exponha-a à tela de fosfato em um hermeticamente fechado durante a noite em temperatura ambiente.

Quando estiver pronto, analise as telas de fosfato com um gerador de imagens de fosfato e quantifique os transcritos radioativos. Mostrado. Aqui estão as imagens de gel representativas que descrevem a separação eletroforética dos vários amplicons de PCR necessários para gerar um amplicon gag derivado do paciente capaz de ser clonado no backbone de quatro plasmídeos MJ. Esta imagem de gel representativa mostra a separação eletroforética de digeridos de restrição para clonagem de genes gag de pacientes em MJ quatro.

E esta imagem representativa do gel mostra a separação eletroforética de digestão de restrição de um DNA de plasmídeo quimera MJ quatro mordaça purificado. Este gráfico mostra a reprodutibilidade do ensaio de replicação ao longo do tempo na linha G XR duas cinco células. O mesmo gag MJ quatro vírus quiméricos foram usados para infectar G XR duas cinco células em dois experimentos independentes realizados com aproximadamente um ano de intervalo.

As pontuações de replicação foram geradas calculando a inclinação dos valores de DLU transformados em log e normalizando essa inclinação para o tipo selvagem MJ quatro. As duas medidas independentes estão fortemente correlacionadas e destacam a reprodutibilidade de ensaios realizados em diferentes momentos e com células em diferentes passagens. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do HIV Aids explorarem os determinantes virais da patogênese.

Na infecção aguda do subtipo C, o subtipo mais prevalente em todo o mundo. Trabalhar com HIV competente para replicação pode ser extremamente perigoso. Todas as etapas envolvendo vírus vivo devem ser realizadas em uma instalação BSL two plus.

Todas as superfícies devem ser descontaminadas regularmente e luvas duplas devem ser usadas o tempo todo.