Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval Drosophila Tecidos In Situ

O objetivo geral deste procedimento é visualizar ou saciar tecidos em C dois usando microscopia de fluorescência após a sonicação. Isso é feito primeiro coletando amostras embrionárias e larvais e, em seguida, fixando-as usando formaldeído, heptano e metanol. O segundo passo é sonicar a amostra fixa para remover a cutícula para permitir a penetração de anticorpos.

Em seguida, a amostra é imunocorada com anticorpos primários e secundários fluorescentes. A etapa final é montar a amostra em uma solução Antifa à base de glicerol. Em última análise, a microscopia confocal ou epifluorescente é usada para visualizar o tecido em desenvolvimento, bem como a expressão e localização de proteínas.

A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos, como a dissecção de tecidos, é que ela permite a visualização de uma variedade de tecidos em desenvolvimento. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a etapa de sonicação depende de vários fatores para alcançar a máxima eficiência, incluindo o posicionamento adequado da sonda sonica. Demonstrando o procedimento estarão Ashley Fiddler e Lauren Bole, duas talentosas pesquisadoras de graduação do meu laboratório.

Para iniciar o experimento, remova cuidadosamente os embriões coletados em uma placa de ágar usando um pequeno pincel casado com tampão fosfato Triton X 100 ou solução PBTX. Em seguida, limpe o pincel carregado de amostra contra a crista voltada para o interior de um filtro de célula. Coloque uma tampa de placa de Petri embaixo do filtro de células.

Em seguida, enxágue o pincel e as paredes do filtro de células com um frasco de esguicho contendo PBTX. Depois que a amostra for transferida para o filtro, despeje PBTX suficiente no filtro para levantar a amostra da malha. Repita esta etapa três vezes para remover o fermento e os resíduos da mosca, remova o PBTX.

Em seguida, despeje a solução de alvejante a 50% na peneira e deixe as larvas repousarem na solução por cinco minutos. Em seguida, remova a solução. Em seguida, lave a amostra com PBTX e deixe-a descansar na solução por três minutos.

Repita a etapa cinco vezes, seque a parte inferior do filtro de células. Em seguida, use um pincel casado com PBTX para transferir a amostra para um frasco de cintilação contendo 1,75 mililitros de pems. Em uma capela de exaustão, adicione 250 microlitros de 37% de formaldeído e oito mililitros de grau de reagente.

Heptano para o frasco para injetáveis de cintilação e agite o frasco a 200 RPM durante 20 minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de metanol ao frasco de cintilação sem remover a fase aquosa e agite vigorosamente a 500 RPM. Depois de agitar, despeje imediatamente o conteúdo em um filtro de células sobre um recipiente de resíduos líquidos.

Adicione metanol extra ao frasco e passe o conteúdo pelo filtro de células. Para garantir que toda a amostra foi removida. Experimente a parte inferior do filtro de células com tecido de laboratório.

Em seguida, aplique um pincel para transferir a amostra do filtro para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 0,5 mililitros de metanol. Aguarde até que a amostra assente. Em seguida, remova o metanol com uma pipeta e substitua-o por uma nova alíquota de 0,5 mililitro de metanol.

Repita esta etapa três vezes e adicione 0,5 mililitro final de metanol ao tubo antes de armazená-lo a 20 graus Celsius negativos. Para mais tarde, use recuperar a amostra armazenada do freezer e remover o metanol com uma pipeta. Em seguida, adicione um mililitro de uma interpolação tampão fosfato de metanol a 50% ou solução PBTW ao tubo e agite o tubo por três minutos.

Em seguida, enxágue a amostra com um mililitro de PBTW duas vezes, permitindo que a amostra assente antes de retirar o PBTW com uma pipeta, adicione 1,0 mililitros de tween tamponada com fosfato de albumina de soro bovino ou BBTW ao frasco e balance-o por três minutos. Deixe a amostra assentar e remova o BBTW com uma pipeta. Repita esta etapa duas vezes.

Tomando cuidado para remover o máximo possível de BBTW sem perder nenhuma amostra. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de BBTW ao tubo e coloque-o no gelo. Em seguida, ajuste o sonicado para 10% de amplitude máxima e um tempo de execução de dois segundos com ação constante, limpe a sonda do ator colocando a ponta da sonda em um tubo cônico de 50 mililitros cheio de água deionizada e execute o sonicate.

Em seguida, seque a sonda sonicada com um lenço de laboratório. Mergulhe a sonda no tubo, três a quatro milímetros acima da amostra e inicie a sonicação. Em seguida, remova o tubo e coloque-o no gelo por 30 segundos para evitar o superaquecimento da sonicação e permitir que a amostra assente no fundo do tubo.

Repita esta etapa conforme exigido pela idade da amostra após a conclusão da sonicação. Enxágue a amostra duas vezes com um mililitro de BBTW. Após cada enxágue, deixe a amostra assentar antes de secar BBTW Com uma pipeta, adicione um mililitro de BBTW ao frasco e coloque-o em um balancim.

Após três minutos, deixe a amostra assentar e remova o BBTW com uma pipeta. Em seguida, repita isso. Etapa duas vezes, bloqueie a amostra com 0,5 mililitros de soro normal a 5% diluído em BBTW no tubo e coloque a amostra em um balancim por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de solução de anticorpo primário e agite a amostra durante a noite a quatro graus Celsius, deixe a amostra assentar no fundo do tubo. Em seguida, retire os anticorpos primários com uma pipeta e enxágue duas vezes com um mililitro de BBTW. Adicione um mililitro de BBTW ao frasco e coloque-o em um balancim por três minutos.

Em seguida, remova o BBTW com uma pipeta e repita isso. Etapa cinco vezes, bloqueie a amostra com solução BBTW de soro normal a 5% e balance-a por 30 minutos. Em seguida, remova a solução.

Adicione o anticorpo secundário diluído em solução de BBTW sérica normal a 5% e envolva o tubo em papel alumínio. Em seguida, balance a amostra durante a noite a quatro graus Celsius. Retirar os anticorpos secundários com uma pipeta e lavar a amostra com um mililitro de PBTW duas vezes.

Em seguida, adicione um mililitro de PBTW ao frasco e coloque-o em uma cadeira de balanço por cinco minutos. Em seguida, deixe a amostra assentar e remova o PBTW com uma pipeta. Repita isso.

Passo três vezes. Adicione 80 a 100 microlitros de solução de DAB co ao tubo e armazene-o a 20 graus Celsius negativos. Finalmente, para montar a amostra, use cinco a 10 microlitros de dab BCO p lene diamina ou PPD anti fade.

Em seguida, visualize-o com microscopia de fluorescência. Essas projeções Z de quatro fatias confocais demonstram a eficácia do protocolo para visualizar características morfológicas, bem como células individuais em C dois durante o embrionário tardio até os estágios iniciais e médios L três do desenvolvimento da drosófila. O desenvolvimento dos testículos é um sistema particularmente bom para ilustrar a eficácia do protocolo porque a maturação dos testículos é dinâmica ao longo do desenvolvimento larval.

Essas imagens destacam as células germinativas nas células vermelhas e centrais e as zonas FU em seções confocais simples verdes de três cérebros médios L. Coloração imunológica para células-mãe ganglionares, neurônios indiferenciados em neurônios verdes e imaturos e primários. Em vermelho, mostram coloração forte com padrões de expressão distintos nos lobos cerebrais e no cordão nervoso ventral, dependendo da orientação de montagem, a imagem permite a visualização do tecido cerebral a partir da superfície dorsal, superfície ventral ou em seção transversal sagital.

Esta técnica in situ permite que os biólogos explorem o desenvolvimento de órgãos na morfogênese tecidual em organismos onde a cutícula protetora impede a penetração de anticorpos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sonicar e imunocorar amostras de esôfago embrionário e larval em estágio avançado para visualizar os tecidos em desenvolvimento em C dois. Não se esqueça de que trabalhar com formaldeído, heptano e metanol pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em uma capela de exaustão.

O uso de luvas apropriadas e jaleco deve sempre ser observado durante a realização deste procedimento.