Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval Drosophila Tecidos In Situ
14 de agosto de 2014
A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar ou saciar tecidos em C dois usando microscopia de fluorescência após a sonicação. Isso é feito primeiro coletando amostras embrionárias e larvais e, em seguida, fixando-as usando formaldeído, heptano e metanol. O segundo passo é sonicar a amostra fixa para remover a cutícula para permitir a penetração de anticorpos.
Em seguida, a amostra é imunocorada com anticorpos primários e secundários fluorescentes. A etapa final é montar a amostra em uma solução Antifa à base de glicerol. Em última análise, a microscopia confocal ou epifluorescente é usada para visualizar o tecido em desenvolvimento, bem como a expressão e localização de proteínas.
A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos, como a dissecção de tecidos, é que ela permite a visualização de uma variedade de tecidos em desenvolvimento. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a etapa de sonicação depende de vários fatores para alcançar a máxima eficiência, incluindo o posicionamento adequado da sonda sonica. Demonstrando o procedimento estarão Ashley Fiddler e Lauren Bole, duas talentosas pesquisadoras de graduação do meu laboratório.
Para iniciar o experimento, remova cuidadosamente os embriões coletados em uma placa de ágar usando um pequeno pincel casado com tampão fosfato Triton X 100 ou solução PBTX. Em seguida, limpe o pincel carregado de amostra contra a crista voltada para o interior de um filtro de célula. Coloque uma tampa de placa de Petri embaixo do filtro de células.
Em seguida, enxágue o pincel e as paredes do filtro de células com um frasco de esguicho contendo PBTX. Depois que a amostra for transferida para o filtro, despeje PBTX suficiente no filtro para levantar a amostra da malha. Repita esta etapa três vezes para remover o fermento e os resíduos da mosca, remova o PBTX.
Em seguida, despeje a solução de alvejante a 50% na peneira e deixe as larvas repousarem na solução por cinco minutos. Em seguida, remova a solução. Em seguida, lave a amostra com PBTX e deixe-a descansar na solução por três minutos.
Repita a etapa cinco vezes, seque a parte inferior do filtro de células. Em seguida, use um pincel casado com PBTX para transferir a amostra para um frasco de cintilação contendo 1,75 mililitros de pems. Em uma capela de exaustão, adicione 250 microlitros de 37% de formaldeído e oito mililitros de grau de reagente.
Heptano para o frasco para injetáveis de cintilação e agite o frasco a 200 RPM durante 20 minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de metanol ao frasco de cintilação sem remover a fase aquosa e agite vigorosamente a 500 RPM. Depois de agitar, despeje imediatamente o conteúdo em um filtro de células sobre um recipiente de resíduos líquidos.
Adicione metanol extra ao frasco e passe o conteúdo pelo filtro de células. Para garantir que toda a amostra foi removida. Experimente a parte inferior do filtro de células com tecido de laboratório.
Em seguida, aplique um pincel para transferir a amostra do filtro para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 0,5 mililitros de metanol. Aguarde até que a amostra assente. Em seguida, remova o metanol com uma pipeta e substitua-o por uma nova alíquota de 0,5 mililitro de metanol.
Repita esta etapa três vezes e adicione 0,5 mililitro final de metanol ao tubo antes de armazená-lo a 20 graus Celsius negativos. Para mais tarde, use recuperar a amostra armazenada do freezer e remover o metanol com uma pipeta. Em seguida, adicione um mililitro de uma interpolação tampão fosfato de metanol a 50% ou solução PBTW ao tubo e agite o tubo por três minutos.
Em seguida, enxágue a amostra com um mililitro de PBTW duas vezes, permitindo que a amostra assente antes de retirar o PBTW com uma pipeta, adicione 1,0 mililitros de tween tamponada com fosfato de albumina de soro bovino ou BBTW ao frasco e balance-o por três minutos. Deixe a amostra assentar e remova o BBTW com uma pipeta. Repita esta etapa duas vezes.
Tomando cuidado para remover o máximo possível de BBTW sem perder nenhuma amostra. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de BBTW ao tubo e coloque-o no gelo. Em seguida, ajuste o sonicado para 10% de amplitude máxima e um tempo de execução de dois segundos com ação constante, limpe a sonda do ator colocando a ponta da sonda em um tubo cônico de 50 mililitros cheio de água deionizada e execute o sonicate.
Em seguida, seque a sonda sonicada com um lenço de laboratório. Mergulhe a sonda no tubo, três a quatro milímetros acima da amostra e inicie a sonicação. Em seguida, remova o tubo e coloque-o no gelo por 30 segundos para evitar o superaquecimento da sonicação e permitir que a amostra assente no fundo do tubo.
Repita esta etapa conforme exigido pela idade da amostra após a conclusão da sonicação. Enxágue a amostra duas vezes com um mililitro de BBTW. Após cada enxágue, deixe a amostra assentar antes de secar BBTW Com uma pipeta, adicione um mililitro de BBTW ao frasco e coloque-o em um balancim.
Após três minutos, deixe a amostra assentar e remova o BBTW com uma pipeta. Em seguida, repita isso. Etapa duas vezes, bloqueie a amostra com 0,5 mililitros de soro normal a 5% diluído em BBTW no tubo e coloque a amostra em um balancim por uma hora em temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros de solução de anticorpo primário e agite a amostra durante a noite a quatro graus Celsius, deixe a amostra assentar no fundo do tubo. Em seguida, retire os anticorpos primários com uma pipeta e enxágue duas vezes com um mililitro de BBTW. Adicione um mililitro de BBTW ao frasco e coloque-o em um balancim por três minutos.
Em seguida, remova o BBTW com uma pipeta e repita isso. Etapa cinco vezes, bloqueie a amostra com solução BBTW de soro normal a 5% e balance-a por 30 minutos. Em seguida, remova a solução.
Adicione o anticorpo secundário diluído em solução de BBTW sérica normal a 5% e envolva o tubo em papel alumínio. Em seguida, balance a amostra durante a noite a quatro graus Celsius. Retirar os anticorpos secundários com uma pipeta e lavar a amostra com um mililitro de PBTW duas vezes.
Em seguida, adicione um mililitro de PBTW ao frasco e coloque-o em uma cadeira de balanço por cinco minutos. Em seguida, deixe a amostra assentar e remova o PBTW com uma pipeta. Repita isso.
Passo três vezes. Adicione 80 a 100 microlitros de solução de DAB co ao tubo e armazene-o a 20 graus Celsius negativos. Finalmente, para montar a amostra, use cinco a 10 microlitros de dab BCO p lene diamina ou PPD anti fade.
Em seguida, visualize-o com microscopia de fluorescência. Essas projeções Z de quatro fatias confocais demonstram a eficácia do protocolo para visualizar características morfológicas, bem como células individuais em C dois durante o embrionário tardio até os estágios iniciais e médios L três do desenvolvimento da drosófila. O desenvolvimento dos testículos é um sistema particularmente bom para ilustrar a eficácia do protocolo porque a maturação dos testículos é dinâmica ao longo do desenvolvimento larval.
Essas imagens destacam as células germinativas nas células vermelhas e centrais e as zonas FU em seções confocais simples verdes de três cérebros médios L. Coloração imunológica para células-mãe ganglionares, neurônios indiferenciados em neurônios verdes e imaturos e primários. Em vermelho, mostram coloração forte com padrões de expressão distintos nos lobos cerebrais e no cordão nervoso ventral, dependendo da orientação de montagem, a imagem permite a visualização do tecido cerebral a partir da superfície dorsal, superfície ventral ou em seção transversal sagital.
Esta técnica in situ permite que os biólogos explorem o desenvolvimento de órgãos na morfogênese tecidual em organismos onde a cutícula protetora impede a penetração de anticorpos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sonicar e imunocorar amostras de esôfago embrionário e larval em estágio avançado para visualizar os tecidos em desenvolvimento em C dois. Não se esqueça de que trabalhar com formaldeído, heptano e metanol pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em uma capela de exaustão.
O uso de luvas apropriadas e jaleco deve sempre ser observado durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para imunomarcação de tecidos de Drosophila melanogaster utilizando sonicação. O método permite a visualização de tipos celulares e proteínas específicas sem a necessidade de dissecação, aumentando a eficiência no estudo de tecidos em desenvolvimento.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Antecedentes
- A imunomarcação é essencial para visualizar proteínas em tecidos.
- Os métodos tradicionais frequentemente exigem dissecação, o que pode ser demorado.
- A sonicação pode facilitar a penetração do anticorpo ao remover a cutícula.
- A microscopia de fluorescência é utilizada para observar a localização proteica.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo eficiente de imunomarcação para larvas em montagem inteira.
- Visualizar a expressão proteica em tecidos de Drosophila.
- Melhorar a acessibilidade da penetração de anticorpos em amostras fixadas.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras embrionárias e larvais.
- Fixação utilizando formaldeído, heptano e metanol.
- Soniccação para remoção da cutícula.
- Imunomarcação com anticorpos primários e secundários fluorescentes.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de tecidos em desenvolvimento utilizando microscopia de fluorescência.
- Penetração eficaz de anticorpos alcançada por meio de sonicação.
- Localização clara de proteínas dentro das amostras.
- O protocolo aumenta a eficiência dos procedimentos de imunomarcação.
Conclusões
- O método descrito simplifica o processo de imunomarcação.
- A sonicação é uma técnica valiosa para o preparo de tecidos de Drosophila.
- Este protocolo pode ser amplamente adotado para estudos semelhantes em biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método de imunofluorescência facilitado por sonicação aborda um gargalo fundamental na pesquisa de biologia do desenvolvimento: a cutícula impermeável em embriões e larvas de Drosophila em estágios tardios, que dificulta a penetração de anticorpos. Ao permitir a imunomarcação em preparações inteiras sem necessidade de dissecação, o protocolo melhora o rendimento e preserva a morfologia tecidual, favorecendo a validação confiável de alvos em telas genéticas e fenotípicas. A abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, fornecendo dados quantitativos e com resolução espacial da expressão proteica, essenciais para a desvinculação mecanicista de hipóteses terapêuticas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização da localização proteica em tecidos intactos, reduzindo a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Apoia o processamento de alto rendimento de grande número de amostras, melhorando a eficiência nos fluxos de trabalho de validação de alvos.
- Valor Estratégico: Facilita a triagem fenotípica ao permitir a análise simultânea de múltiplos tipos de tecidos (por exemplo, testículos, ovários, tecidos neurais) em diferentes estágios de desenvolvimento.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de fluorescência que permitem a avaliação padronizada dos níveis de expressão de antígenos.
- Valor Operacional: Mantém a arquitetura tecidual in situ, garantindo a reprodutibilidade do ensaio e reduzindo a variabilidade decorrente de artefatos de dissecação.
- Valor Estratégico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, confirmando o engajamento do alvo e os padrões de expressão.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece resolução celular relevante para doenças em modelos de Drosophila, apoiando a descoberta translacional de biomarcadores para vias neurodesenvolvimentais e reprodutivas.
- Valor Operacional: Permite a continuidade do estágio de descoberta até a validação pré-clínica, mantendo protocolos consistentes de preparação e coloração de tecidos.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao fornecer dados confiáveis de localização proteica com resolução espacial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes, especialmente quando a triagem fenotípica exige análise de tecido intacto e localização quantitativa de proteínas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a visualização de tipos celulares específicos e da expressão proteica em tecidos em desenvolvimento.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de imunomarcação padronizada e reprodutível, com saídas quantitativas de fluorescência adequadas para avaliação de compostos.
- Análises: Gera resultados mensuráveis (intensidade de fluorescência, padrões de localização) que permitem às equipes comparar condições experimentais e avaliar a modulação de alvos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer dados em nível tecidual alinhados com fenótipos desenvolvimentais relevantes para modelos de doenças humanas.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade de preparação de amostras reutilizável, aplicável em múltiplos projetos de biologia do desenvolvimento e triagem genética.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir falsos negativos decorrentes da má penetração de anticorpos e melhorar a precisão na validação do alvo.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e escalabilidade por meio de um protocolo simplificado, livre de dissecação, compatível com processamento de alto volume.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer insights mecanicistas confiáveis, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados do desenvolvimento do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em padrões de expressão validados e relevância funcional em sistemas relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na otimização de parâmetros de sonicação (posição da sonda, amplitude, duração) para evitar danos à amostra, ao mesmo tempo em que garante a remoção da cutícula.
- Depende do acesso a equipamentos de sonicação com controles precisos de amplitude e tempo, além de reagentes padrão para imunofluorescência e microscopia de fluorescência.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de sonicação e coloração para assegurar a reprodutibilidade entre diferentes usuários e laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos de tecidos e estágios de desenvolvimento de Drosophila, já que a eficiência da sonicação pode variar conforme a idade da amostra e a espessura da cutícula.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de otimizar os tempos de incubação de anticorpos para alvos de baixa abundância e o manuseio cuidadoso de reagentes perigosos (formaldeído, heptano, metanol).
