Name: Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval Drosophila Tecidos In Situ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda imunofluorescência facilitada por sonicação para visualização de tecidos embrionários e larvais de Drosophila melanogaster. Este método eficiente permite a penetração de anticorpos sem dissecação.

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Somos gratos a Ruth Lehman e Dorthea Godt que gentilmente fornecido anticorpos Vasa e Engarrafamento. Gostaríamos de agradecer o Bloomington Banco Central da Universidade de Indiana para a manutenção das existências previstas eo Developmental Studies Hybridoma Banco desenvolvidas sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa. Agradecemos a todos os membros do laboratório Wawersik para os seus conselhos e apoio. Este trabalho foi financiado pela Monroe Scholars Programa Bolsa (para AF e LB) e NSF conceder IOS0823151 (a MW).

1 Preparação de uma gaiola coleção <ol><li> Anestesiar jovens, moscas férteis com CO 2. Transferir moscas anestesiadas para uma gaiola. Para obter o rendimento ideal, use 100-120 moscas adultas variam de 2-7 dias de idade em uma proporção de 4: 1 de mulheres para homens. Permitir moscas um período de aclimatação apropriada, ~ 24 horas antes da obtenção de amostra para a fixação. Se a gaiola foi criado com fêmeas virgens acoplado aos homens, o uso de um 36 - período de aclimatação de 48 hr. </li><li> Na extremidade aberta da gaiola, colocar uma placa de agar pré-preparados sumo de maçã com uma gota do tamanho de uma moeda, de levedura pasta no centro ao longo da abertura da jaula. Em seguida, prenda com fita adesiva. Selar a junção entre a placa de ágar suco de maçã ea gaiola com Parafilm. </li><li> Coloque a gaiola em um contentor secundário com sumo de maçã placa de agar na forma de base e permitir que as moscas para reproduzir a uma temperatura definida por um período de tempo adequado, tal como determinado pela experiência. Nota: Os tempos de colheita de amostras wivai variar. Por exemplo, quando a recolha de embriões de fase tardia / larvas L1 precoce (17 - 24 horas), permitir que as moscas a pôr ovos em placas de agar de sumo de maçã durante 7 horas a 25 ° C, antes do envelhecimento das amostras durante 17 horas a 25 ° C. Da mesma forma, para uma recolha de larvas de primeiro estádio de meados de atraso (36 - 48 h) permitir que as moscas a pôr ovos durante 12 horas a 25 ° C, antes do envelhecimento das amostras durante 36 horas a 25 ° C. </li><li> Uma vez que o período de tempo é completo, toque na gaiola em uma mesa para que as moscas cair longe da placa de ágar suco de maçã sem anestesia. Substituir rapidamente a placa utilizada por uma nova, contendo uma gota de pasta de levedura. Fixe a placa de fresco com fita adesiva e parafilm e armazenar a gaiola com suco de maçã placa de ágar como base. </li><li> Remova cuidadosamente a queda levedura da placa usada com uma espátula de metal. Coloque a tampa na placa de suco de maçã usado e permitir que os embriões colocados para a idade, se experimentalmente necessário. Nota: Embora as amostras de envelhecimento, as placas podem ser armazenadas a 25 ° C, a menos que as temperaturas mais elevadas são experimentally necessária. Exemplos de como envelhecer embriões para a coleta são descritos acima (ver nota para o passo 1.3). A remoção da levedura pasta antes de provar o envelhecimento é realizada para evitar larvas de rastejar na levedura e quebrando o agar por baixo. O resíduo ágar suco de maçã e levedura pasta restante fornecer nutrientes para o crescimento larval. Enquanto os embriões fixados directamente na pasta de levedura são perdidos através de remoção de pasta de levedura, esta perda é preferível para levedura e agar de resíduo na amostra, que pode reduzir a eficiência da coloração. Se uma escolha não remover a pasta de levedura, a levedura pode ser liquefeito com Tampão Fosfato de Triton X-100 (PbTx), misturado com um pincel, e em seguida removido a partir da amostra com um filtro de células antes da fixação. </li></ol> 2 Fixação <ol><li> Uma vez que os embriões fixados sobre a placa de agar de sumo de maçã têm idade para o ponto de tempo desejado, utilizar um pequeno pincel humedecido com solução de tampão fosfato de Triton X-100 (PbTx) para remover cuidadosamente amostras de poe placa. Nota: larvas mais velhas são móveis e podem rastejar para o interior da tampa. Esta amostra pode ser recolhida de forma semelhante por remoção com um pincel. </li><li> Limpe o pincel amostra-laden contra virado para o interior cume de um filtro de células. Em seguida, lave as paredes do filtro e do pincel com uma garrafa de esguicho contendo solução PbTx. Coloque uma tampa de placa de petri por baixo do filtro para capturar a solução PbTx. </li><li> Depois de toda a amostra foi transferida para o filtro, despeje PbTx suficiente no filtro de levantar a amostra para fora da malha. Em seguida, levante a peneira e despeje o conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos. </li><li> Repita o passo 2.3 três vezes para remover fungos e resíduos que possam ter sido transferidos juntamente com a amostra de voar. </li><li> Despeje suficiente 50% de lixívia (ddH2O) (NaOCl) / água no filtro para aumentar as larvas fora da malha. Permitir que as larvas se sentar na solução por 5 min. Em seguida, levante a peneira e deitar fora tele conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos. Nota: Bleach é necessária apenas em amostras embrionárias com idades entre 0-22 horas, a fim de remover a membrana coriônica. A aplicação de água sanitária para amostras mais velhas pode ser omitido, mas a sua inclusão não é prejudicial. Se a omissão for desejado, substituir a água sanitária nesta etapa com PbTx. Água sanitária diluída deve ser utilizada dentro de 24 horas de preparação da solução. </li><li> Lave amostra no coador com PbTx derramando bastante PbTx no coador para aumentar a amostra para fora da malha. Deixar a amostra para sentar-se em solução para 3 min. Em seguida, levante a peneira e despeje o conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos. </li><li> Repita o passo 2.6 cinco vezes. </li><li> Dab parte inferior do filtro de células secas, em seguida, transferir a amostra para um frasco de cintilação contendo 1,75 ml de solução de PEMS utilizando um pincel. </li><li> Trabalhando numa hotte ventilada, adicionar 250 mL de formaldeído a 37% e 8 ml de heptano de grau de reagente para o frasco de cintilação. <br/&gt; Nota: Formaldeído e heptano são perigosos. Por razões de segurança, continuar a trabalhar em um exaustor ventilado e usar luvas apropriadas para as etapas 2,9-3,3. </li><li> Deixe o frasco para agitar a 200 rpm ou uma velocidade moderada semelhante para 20 min. </li><li> Adicionar 10 ml de metanol a ampola de cintilação, sem remoção da fase aquosa anterior e permitir que o frasco para agitar vigorosamente a 500 rpm durante 1 min. Nota: O metanol é perigoso. Continuar a trabalhar em um exaustor ventilado e usar luvas apropriadas. </li><li> Remover o frasco do shaker e imediatamente despeje o conteúdo em um filtro de células sobre um recipiente de resíduos líquidos na capa. Adiciona-se metanol adicional para o frasco e executado através do filtro, conforme necessário para garantir que todo célula da amostra foi removido. Nota: coadores célula pode drenar lentamente. Para remediar esta situação, um toque de tecido de laboratório para a parte inferior do coador de células, de modo a extrair a solução através do filtro de forma mais rápida. Metanol, formaldeído, e heptano deve serarmazenado em lixeiras apropriadas até o descarte adequado de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Inferior a seco de filtro de células utilizando um tecido de laboratório, em seguida, usar um pincel para transferir a amostra capturada na peneira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 0,5 ml de metanol. Nota: Se vários frascos de cintilação estão em uso, conclua as etapas de 2,12 e 2,13 um frasco de cada vez para evitar a amostra de secagem em filtros celulares. </li><li> Assim que a amostra foi adicionada ao tubo de microcentrífuga, remover o metanol, com uma pipeta. Certifique-se de amostra tenha assentado no fundo do tubo. </li><li> Lavar amostra no tubo de microcentrífuga, adicionando cerca de 0,5 ml de metanol ao tubo. Espere por amostra para resolver depois remover o metanol com uma pipeta. </li><li> Repita o passo 15 três vezes. </li><li> Adicionar 0,5 ml de metanol ao tubo, em seguida, armazenar em um freezer -20 ° C para uso posterior. </li></ol> 3. Reidratação e Preparação de Amostras para Imunocoloração <ol><li> Remover o metanol a partir do tubo de microcentrifugadora com uma pipeta, deixando a amostra no tubo. Loja resíduos de metanol para o recipiente adequado de lixo até à hora de eliminação adequada. Nota: Para aumentar a eficiência de ultra-sons, utilizar não mais de 3 mm de amostra depositada no fundo do tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Excesso de amostra pode ser transferida para um tubo separado com uma pipeta, antes de começar a etapa de re-hidratação acima. Cortar a ponta da pipeta com uma lâmina de barbear limpa pode ser usada para evitar o entupimento da ponta da pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de uma solução a 50% de metanol / tampão de fosfato Tween (PBTw) para o tubo e rocha durante 3 min. </li><li> Remover solução de metanol para o recipiente de resíduos adequado e enxaguar com 1,0 l de PBTw duas vezes. Depois de cada lavagem, deixar a amostra para resolver antes de tirar fora do PBTw com uma pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de albumina sérica bovina / tampão fosfato Tween (BBTw) misturar ao frasco e rock. Após 3 min em uma cadeira de balanço, permitir que o sample para resolver e remover o BBTw com pipeta. </li><li> Repita o passo 3.4 duas vezes, tendo o cuidado de retirar o máximo BBTw possível, sem perder de amostra após a última lavagem. </li><li> Adicionar 0,5 ml de BBTw para o tubo e colocar o tubo em gelo. </li></ol> 4. Sonicação de Amostra <ol><li> Defina o sonicador a 10% da amplitude máxima e designar um tempo de execução de 2 seg sonicação constante. Nota: Essas configurações são específicas para o sonicador indicada nos Materiais e Equipamentos Tabela e pode exigir de otimização para diferentes sonicators. </li><li> Antes de ultra-sons de amostra, limpar a sonda de ultra-sons colocando a ponta da sonda em um tubo de 50 ml cheia de água deionizada e de execução sonicador de limpar a sonda. Sonda de ultra-sons a seco com tecido laboratório após corrida. </li><li> Submerge da sonda para o tubo de microcentrífuga contendo amostra de modo que fique posicionado aproximadamente 3 a 4 mm acima da amostra e iniciar sonicação. </li><li> Remover o microcentrifuge tubo e coloca-se em gelo durante pelo menos 30 segundos para dissipar o calor a partir de ultra-sons e permitir que a amostra se depositam no fundo do tubo de microcentrífuga. </li><li> Repita os passos 4.3 e 4.4, conforme necessário, com base na idade da amostra que está sendo processado. Nota: Para um volume ótimo de amostra sonificação, os embriões mais jovens do que 17 horas não necessitam de ultra-som, mas aqueles entre 17 e 24 horas (fase 17 / early-L1) requerem dois sonicações. Larvas entre 24-36 (início / meio-L1), 36-48 (mid / late-L1), 48-60 (início / meio-L2), 60-72 (mid / late-L2), 72-84 ( early-L3), 84-96 (início / meio-L3), 96-108 (mid / late-L3) hr exigem 5, 9, 11, 13, 15, 18 e 22 sonicações respectivamente. Veja a discussão para posterior elaboração em tempos de sonicação. </li><li> Enxágüe com 1,0 ml BBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir que a amostra para resolver antes de tirar fora BBTw com uma pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de BBTw ao frasco e rock. Após 3 min do roqueiro, permitir que a amostra se estabelecer e remover o BBTw com pipeta. &lt;/ Li&gt; <li> Repita o passo 4.7 duas vezes. </li></ol> 5. Imunocoloração <ol><li> Bloquear amostra por adição de 5% de soro normal diluído em BBTw ao tubo de microcentrífuga. Remova o bloco após balançar por 1 hora. Nota: Use soro normal das espécies em que os anticorpos secundários são gerados. </li><li> Diluir anticorpos primários para se apropriar concentração de trabalho na solução de 5% de soro normal de / BBTw. </li><li> Amostra de rocha no anticorpo primário solução O / N a 4 ° C ou durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C. Nota: Os tempos de incubação de anticorpos e as temperaturas podem variar. S / N incubação a 4 ° C ou 3 horas à temperatura ambiente é tipicamente suficiente. No entanto, um período de incubação de dois dias, pode melhorar a qualidade de coloração, especialmente com amostras mais velhas ou quando os anticorpos primários de baixa afinidade são utilizadas. Incubações mais longas são geralmente realizados a 4 ° C. Considerações similares devem ser feitas quando se utiliza anticorpos secundários (ver 5.10). </li><li> Deixar a amostra em repouso para ainferior do tubo de microcentrífuga. Colhem-se anticorpos primários com pipeta. Salve anticorpos para reutilização, se desejar. </li><li> Enxágüe com 1,0 ml de BBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir amostra para resolver antes de tirar fora BBTw com uma pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de BBTw ao frasco e rock. Após 3 min do roqueiro, permitir que a amostra se instalar e remover BBTw com pipeta. </li><li> Repita o passo 5.6 cinco vezes. </li><li> Bloco amostra por adição de uma solução de soro normal de / BBTw 5% para o tubo de microcentrífuga. Remova o bloco de balanço depois durante 30 minutos a 1 hora. Nota: Esta etapa bloqueio adicional não é necessária, mas pode melhorar a qualidade de coloração para detecção de anticorpos específicos. </li><li> Diluir anticorpos secundários se apropriar de concentração de trabalho na solução de 5% de soro normal de / BBTw. </li><li> Enrole tubo de microcentrífuga em papel de alumínio para reduzir o desbotamento devido à exposição à luz. Amostra de rocha na solução de anticorpo secundário por 12 a 48 horas a 4 ° C ou durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C. </li><li> Deixar a amostra em repouso para a parte inferior do tubo de microcentrífuga. Empate fora de anticorpos secundários com pipeta. </li><li> Enxágüe com 1,0 ml de PBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir que a amostra antes de se estabelecer a remoção do PBTw com uma pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de PBTw ao frasco e rock. Depois de 5 minutos sobre o roqueiro, permitir que a amostra se estabelecer e remover o PBTw com pipeta. </li><li> Repita o passo 5.13 três vezes. </li><li> Opcional: Adicione DAPI diluído 1: 1.000 em PBTw. Amostra de rocha embrulhados em papel alumínio por 3 min; em seguida, remover a solução DAPI com uma pipeta. Lavar cinco vezes com 1,0 ml de PBTw, permitindo amostra para resolver antes de remover PBTw com pipeta. </li><li> Adicionar 80 - 100 mL de 1,4-diazabiciclo solução [2.2.2] octano (DABCO) ao tubo de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C. Nota: Um outro agente anti-desbotamento base de glicerol pode ser substituído por. </li></ol> 6 Análise <ol><li> Antes de amostra de montagem em lâminas, adicionar um extra de 5 - 10 mL de DABCO / p-fenylenediamine (PPD) antifade solução para tubo de microcentrífuga. Nota: A amostra pode ser adicionada a lâminas sem a dissecção. O volume de amostra adicionada a uma corrediça varia com o tamanho da tampa deslizante. Quando pipetar amostra em slide, a ponteira pode ser cortada com uma lâmina de barbear para evitar amostra de corte. Muitas vezes, é útil para a linha de exemplo em linhas de análise fácil. A adição de um agente de PPD como antifade adicional pode não ser necessária, mas pode evitar a fotodegradação se as amostras são armazenadas a longo prazo. </li><li> Delicadamente, coloque a tampa de vidro de deslizamento ao longo da amostra. Então, lamínula seguro no local usando unha polonês. </li><li> Ver montado amostra usando microscopia de fluorescência. </li></ol>

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<li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li>
<li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li>
<li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+identity%2C+morphology%2C+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14(2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo fornece um método para atingir com sucesso imunocoloração Drosophila embrionário e larval tecidos in situ, eliminando, assim, a necessidade de dissecção. De acordo com os protocolos anteriores, para a coloração de embriões de 1,2,3, a membrana coriónica é removido usando 50% de lixívia (hipoclorito de sódio). As amostras são fixadas em formol e metanol. Porque a cutícula larval provoca amostra mais para flutuar, a totalidade da amostra é então passada através de um coador de c...

Embriões de Drosophila e larvas de fornecer um excelente modelo para estudar os processos de desenvolvimento em vários órgãos e tecidos. Imagem de células individuais é muitas vezes necessário nestes estudos, a fim de apurar os ambientes complexos em que as células se desenvolvem. A visualização de células em tecidos pode ser realizada através de imunomarcação. Bem descrito imunomarcação existem protocolos para tecidos de Drosophila embrionárias &lt;17 horas após a postura dos ovos (AEL) 1-3. No entanto, se forma uma cutícula protetora para o fim da embriogênese, impedindo a permeação de anticorpos eficazes. Assim, estes protocolos imunocoloração são ineficientes na análise de tecidos em embriões em estágio final e em fases posteriores do desenvolvimento larval (1 º instar (L1), 2 º instar (L2), e 3 º instar (L3)). Essa ineficiência impõe uma barreira à nossa compreensão dos processos dinâmicos que ocorrem durante este período de desenvolvimento prolongado 4. Tissue dissecção é uma técnica amplamente utilizada para contornar essa barreira 5-7. No entanto, a dissecção pode provar ineficiente. Extração podem ser sobrecarregados com dificuldade em localizar ou isolar embrionário e tecidos larvais. Além disso, a remoção física dos tecidos-alvo pode causar danos pela ruptura los ou ao não extraí-los em sua totalidade. A sonicação é um método que emprega ondas sonoras para perturbar interacções intermoleculares. Tem sido usada para romper a integridade da cutícula larval Drosophila, a fim de imunocoloração tipos de células neurais em desenvolvimento 6. Este protocolo foi adaptado para imunocoloração embrionário de fase final e gónadas larvais, o que pode ser tão pequeno quanto 50 um de diâmetro de 8-10. Através desses estudos, o processo de célula-tronco da linhagem germinativa (GSC) formação nicho masculino tem sido caracterizada em fase final de embriões de Drosophila 8-10 e mecanismos que regulam o desenvolvimento de células-tronco e difdife- em fase final de gônadas embrionárias e as larvas foram elucidados 9-12. Assim, de ultra-sons constitui uma alternativa eficiente para a dissecção de tecidos que pode ser difícil por causa do tamanho dos tecidos. Além disso, permite a imunocoloração de tecidos in situ de Drosophila, deixando as células no contexto de todo o organismo e manutenção da morfologia situ. Aqui, nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a fluorescência imunocoramento tarde-estágio embrionário através primeiros tecidos / mid-L3 in situ. Análise de Drosophila gonadal e tecido neural é mostrado nos resultados representativos para demonstrar a eficácia do presente protocolo. Além disso, este protocolo de imuno pode ser adaptado para analisar outros tecidos de Drosophila, bem como os tecidos em outros organismos com uma cutícula externa.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela 1: Reagentes e tampões</td></tr><tr><td>Tampão fosfato Triton X-100 (PBTx)</td><td></td><td></td><td>Para 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Armazene na RT.</td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Para 1 L em dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Adicione componentes e preencha até o volume apropriado. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Triton 10%</td><td></td><td></td><td>Para 50 ml: 5 ml de Triton, 5 ml de PBS 10X, 45 ml de ddH<>2O. Rocha para misturar. Armazene na RT.</td></tr><tr><td>Tubos PEMS</td><td></td><td></td><td>0,1 M (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Armazene na RT.</td></tr><tr><td>Tubos</td><td></td><td></td><td>Para 400 ml de solução 0,25 M (pH 6,9): 30,24 g Tubos dH20 NaOH. Dissolver os tubos em 300 ml dH2O e depois ajustar para pH 6,9 com NaOH. Aumente o volume total para 400 ml com dH2O e autoclave. Armazene na RT.</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td></td><td></td><td>37% formaldeído em peso em metanol. Armazene na RT. Armazene a mistura de resíduos de formaldeído, heptano e metanol em um recipiente hermeticamente fechado na capela antes do descarte de acordo com as diretrizes institucionais.</td></tr><tr><td>Heptano</td><td></td><td>CAS 142-82-5</td><td>n-Heptano. Armazene na RT. Armazene a mistura de resíduos de formaldeído, heptano e metanol em um recipiente hermeticamente fechado na capela antes do descarte de acordo com as diretrizes institucionais.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td>CAS 67-56-1</td><td>Armazene na RT. Armazene formaldeído, heptano e mistura de resíduos de metanol em um recipiente hermeticamente fechado na capela antes do descarte de acordo com as diretrizes institucionais.</td></tr><tr><td>Tampão fosfato Tween (PBTw)</td><td></td><td></td><td>Para fazer 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filtre esterilize após adicionar todos os componentes. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Tween 10%</td><td></td><td></td><td>Para 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml de PBS 10X, 40 ml de ddH2O. Rocha para misturar. Armazene na RT.</td></tr><tr><td>Tampão albumina/fosfato de soro bovino Tween (BBTw)</td><td></td><td></td><td>Para fazer 1 L: 100 ml de PBS 10X, 890 ml de ddH2O, 10 ml de Tween 10%, 1 g de albumina de soro bovino (BSA). Adicione BSA e esterilize usando um 0,2 &mu; Unidade de filtro de vácuo M. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal (NGS)</td> <td>ackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Para fazer 10 ml: Soro de cabra normal 10 ml ddH2O. Adicione ddH2O ao frasco de NGS e esterilize usando um 0,2 &mu; m filtro syrninge. Armazene alíquotas a -20 °C.</td></tr><tr><td>1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO)</td><td></td><td>CAS: 281-57-9</td><td>Para fazer 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml de Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g de DABCO sólido, 3,5 ml de 6N HCl, 250 &mu; l 10N NaOH, 70 ml de glicerol. Em um copo de 250 ml com barra de agitação, adicione ddH2O, Tris HCl e DABCO. Mexa e adicione 6N HCl, 10 N NaOH e glicerol. Em seguida, adicione 10N NaOH gota a gota até que a solução atinja pH 7,5. Alíquota. Armazene alíquotas a -20 °C.</td></tr><tr><td>DABCO + solução de p-fenilenodiamina (PPD)</td><td></td><td></td><td>1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolver o PPD em solução de NaHCO3 e NaCO3. Adicione 60 &mu; l de solução PPD para 500 &mu; l de DABCO. Armazene alíquotas a -20 °C.</td></tr><tr><td>Pratos</td><td></td><td></td> de suco <td>de maçã Para fazer ~ 200 pratos: 45 g de ágar (CAS # 9002-18-0), 45 g de açúcar granulado (comprado na loja), 500 ml de suco de maçã (comprado na loja), 15 ml de Tegosept 10%, 1,5 ml de ddH2O. Adicione o ágar ao ddH2O em um frasco de 4 L e depois autoclave por 30 min. Misture o suco de maçã e o açúcar na placa de agitação aquecida. Aos poucos, adicione a mistura de suco de maçã ao ágar autoclavado. Misturar numa placa de agitação aquecida e, em seguida, alíquotas de 10 ml em placas de Petri de 35 mm e deixar repousar em RT para solidificar. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Tegosept 10%</td><td></td><td></td><td>Para fazer 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml de etanol. Armazene alíquotas a -20 °C.</td></tr><tr><td>Pasta</td><td></td><td></td> de fermento <td>~ 50 g de fermento ativo seco. Aos poucos, adicione ddH2O ao copo que contém o fermento, mexendo até obter uma consistência pastosa. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2: Materiais de coloração</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>1:1000, estoque a 5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Coelho anti-Vasa</td><td></td><td></td><td>1:250, um presente de Ruth Lehmann.</td></tr><tr><td>Rato anti-Fasciclin III</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)</td><td>7G10</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Rato anti-1B1</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)</td><td>1B1</td><td>1:4</td></tr><tr><td>Guniea porco anti-Engarrafamento</td><td></td><td></td><td>1:2500, um presente de Dorthea Godt (Li et al, 2003).</td></tr><tr><td>Rato anti-Próspero</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)</td><td>Prospero MR1A</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Rato anti-Elav</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)</td><td>7EBA10</td><td>1:30</td></tr><tr><td>rato anti-Repo</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)</td><td>8D12</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Porco anti-guniea de cabra Alexa633</td><td>Invitrogen</td><td>A21105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>1:500</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3: Materiais e Equipamentos</td></tr><tr><td>Gaiolas de Mosca</td><td>Feitas à mão; Genesee Scientific Corporation</td><td>Não aplicável; Garrafas: 32-130; Gaiola pré-fabricada: 59-101</td><td>Feito cortando tubos de acrílico fundido transparente (1 3/4 polegada de diâmetro) em segmentos de 4 polegadas de altura com uma serra de esquadria composta a 400 rpm. Tela de aço inoxidável ultrafina (foi fixada em uma extremidade da banheira com cola componsada acrílica. Um método alternativo usando uma garrafa vazia de comida para moscas pode ser encontrado em Drosophila Protocolos ISBN 0-87969-584-4. As gaiolas também podem ser compradas da Genesee Scientific Corporation.</td></tr><tr><td>Sonicador: Sonificador Digital Branson 250</td><td>Modelo Branson</td><td>: Sonador Digital Branson 250</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Sonicadora</td><td>Modelo</td><td>#: 102C (CE)</td><td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Nalgene</td><td>190-25-20</td><td>0.2 &mu; m celulose, filtro de membrana de acetato</td></tr><tr><td>Sistema de imagem: Microscópio confocal de disco giratório com fonte de luz multicromática, câmera digital CCD e software de imagem</td><td>Microscópio: Olympus, Fonte de luz: Lumen Dynamics, Câmera: Q-Imaging, Software de imagem: Intelligent Imaging Inc.</td><td></td><td>Microscópio: BX51 equipado com disco giratório DSU, Fonte de luz: X-Cite 120Q, Câmera: RETIGA-SRV, Software de imagem: Slidebook 5.0</td></tr><tr><td>Unidade de filtro a vácuo</td><td>Nalgene</td><td>450-0020</td><td>0.2 &mu; M Filtro de membrana de nitrato de celulose</td></tr></tbody></table>

facilitou-sonication imunofluorescência coloração de late-estágio embrionário e larval<em&gt; drosophila</em&gt; tecidos<em&gt; in situ</em

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Estudos realizados em Drosophila melanogaster embriões e larvas de fornecer informações cruciais nos processos de desenvolvimento, como especificação de destino celular e organogênese. Imunocoloração permite a visualização do desenvolvimento de tecidos e órgãos. No entanto, uma cutícula protectora que se forma na extremidade da embriogênese impede a permeação de anticorpos em embriões de fase tardia e de larvas. Enquanto dissecção antes de imunomarcação é regularmente utilizado para analisar Drosophila tecidos larvais, prova ineficiente para algumas análises, porque pequenos tecidos podem ser difíceis de localizar e isolar. Sonication fornece uma alternativa para dissecção em protocolos de positividade de larvas de Drosophila. Ela permite a rápida transformação, simultânea de um grande número de embriões em estágio final e larvas e mantém na morfologia situ. Após fixação em formaldeído, uma amostra é sonicada. A amostra é então submetida a imunocoloração com antigénio específico da formiga primárioibodies e anticorpos secundários marcados com fluorescência para visualizar os tipos de células-alvo e as proteínas específicas, através de microscopia de fluorescência. Durante o processo de sonicação, a colocação adequada de uma sonda de ultra-sons acima da amostra, bem como a duração e intensidade de ultra-sons, é crítica. Pequenas modificações adicional a protocolos de positividade padrão pode ser necessária para manchas de alta qualidade. Para os anticorpos com baixa relação sinal-ruído, o tempo de incubação mais longos são tipicamente necessário. Como prova de conceito para este protocolo facilitou-sonificação, mostramos immunostains de três tipos de tecidos (testículos, ovários e tecidos neurais) em uma série de estágios de desenvolvimento.

Para demonstrar a eficácia de imunocoloração à base de ultra-sons na análise de embriões de fase final e tecidos larvais in situ, os embriões de tipo selvagem e as larvas foram processadas para imuno-coloração dos testículos, dos ovários, e tecido neural. As amostras foram fotografadas por microscopia confocal e os resultados representativos são mostrados (Figura 1 e Figura 2). Os resultados revelam que o protocolo descrito é eficaz para a visualização de características morfol...

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar ou saturar tecidos em C dois utilizando microscopia de fluorescência após sonicação. Isso é realizado primeiramente coletando amostras embrionárias e larvais e, em seguida, fixando-as com formaldeído, heptano e metanol. O segundo passo é sonificar a amostra fixada para remover o cutículo e permitir a penetração do anticorpo.Em seguida, a amostra é imunomarcada com anticorpos primários e secundários fluorescentes. O passo final é montar a amostra em uma solução Antifa à base de glicerol. Por fim, utiliza-se microscopia confocal ou microscopia fluorescente por reflexão para visualizar o tecido em desenvolvimento, bem como a expressão e a localização das proteínas.A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como a dissecação de tecidos, é que ela permite a visualização in situ de uma variedade de tecidos em desenvolvimento. Geralmente, indivíduos novos nesse método enfrentarão dificuldades porque a etapa de sonicação depende de diversos fatores para alcançar eficiência máxima, incluindo o posicionamento adequado da ponteira de sonicação. O procedimento será demonstrado por Ashley Fiddler e Lauren Bole, duas pesquisadoras subgraduadas talentosas do meu laboratório.Para iniciar o experimento, remova cuidadosamente os embriões coletados em uma placa de ágar utilizando um pincel pequeno umedecido com solução de tampão fosfato com Triton X-100 ou solução PBTX. Em seguida, passe o pincel carregado com a amostra contra a saliência interna de um filtro celular. Coloque a tampa de uma placa de Petri sob o filtro celular.Em seguida, enxágue o pincel e as paredes do funil de filtração com um frasco de lavagem contendo PBTX. Depois que a amostra tiver sido transferida para o funil, despeje quantidade suficiente de PBTX no funil para suspender a amostra acima da malha. Repita este passo três vezes para remover levedura e resíduos de moscas, removendo o PBTX a cada vez.Em seguida, despeje a solução de água sanitária a 50% na peneira e deixe as larvas em repouso na solução por cinco minutos. A seguir, remova a solução. Depois, lave a amostra com PBTX e deixe a amostra em repouso na solução por três minutos.Repita o passo cinco vezes, seque a parte inferior do funil celular. Em seguida, use um pincel umedecido com PBTX para transferir a amostra para um frasco cintilador contendo 1,75 mililitros de pems. Em uma capela, adicione 250 microlitros de formaldeído a 37% e oito mililitros de reagente grau analítico.Adicione heptano ao frasco de cintilação e agite o frasco a 200 rpm por 20 minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de metanol ao frasco de cintilação sem remover a fase aquosa e agite vigorosamente a 500 rpm. Após a agitação, despeje imediatamente o conteúdo em um filtro celular colocado sobre um recipiente para resíduos líquidos.Adicione metanol extra ao vial e passe o conteúdo pelo filtro celular. Para garantir que toda a amostra tenha sido removida, seque a parte inferior do filtro celular com tecido laboratorial.Em seguida, utilize um pincel para transferir a amostra do coador para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 0,5 mililitro de metanol. Aguarde a amostra sedimentar. Em seguida, remova o metanol com uma pipeta e substitua por uma nova alíquota fresca de 0,5 mililitro de metanol.Repita este passo três vezes e adicione 0,5 mililitro final de metanol ao tubo antes de armazená-lo a 20 graus negativos Celsius. Para uso posterior, retire a amostra armazenada do congelador e remova o metanol com uma pipeta. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução de tampão fosfato com 50% de metanol e tween, ou solução PBTW, ao tubo e agite-o durante três minutos.Em seguida, lave a amostra com um mililitro de PBTW duas vezes, permitindo que a amostra sedimente antes de remover o PBTW com uma pipeta; adicione 1,0 mililitro de albumina sérica bovina tampão fosfato com tween, ou BBTW, ao frasco e agite suavemente por três minutos. Deixe a amostra sedimentar e remova o BBTW com uma pipeta. Repita este passo duas vezes.Tendo o cuidado de remover o máximo possível de BBTW sem perder nenhuma parte da amostra. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de BBTW ao tubo e coloque-o no gelo. A seguir, configure o sonicador para 10% da amplitude máxima e um tempo de execução de dois segundos com ativação contínua, limpe a ponteira do sonicator colocando sua extremidade em um tubo cônico de 50 mililitros cheio com água desionizada e execute o sonicador.Em seguida, seque a sonda do sonicador com um lenço de laboratório. Mergulhe a sonda no tubo, a três ou quatro milímetros acima da amostra, e inicie a sonicação. Em seguida, retire o tubo e coloque-o no gelo por 30 segundos para evitar superaquecimento devido à sonicação e permitir que a amostra se sedimente no fundo do tubo.Repita este passo conforme necessário de acordo com a idade da amostra após a conclusão da sonicação. Lave a amostra duas vezes com um mililitro de BBTW. Após cada lavagem, deixe a amostra sedimentar antes de remover o BBTW com uma pipeta. Adicione um mililitro de BBTW ao frasco e coloque-o em um agitador rotativo.Após três minutos, deixe a amostra decantar e remova o BBTW com uma pipeta. Em seguida, repita este passo duas vezes. Bloqueie a amostra com 0,5 mililitros de soro normal 5% diluído em BBTW no tubo e coloque a amostra em um agitador durante uma hora à temperatura ambiente.Em seguida, adicione 0,5 mililitros de solução de anticorpo primário e agite a amostra durante a noite a quatro graus Celsius, permitindo que a amostra sedimente no fundo do tubo. Em seguida, remova os anticorpos primários com uma pipeta e lave duas vezes com um mililitro de BBTW. Adicione um mililitro de BBTW ao frasco e, então, coloque-o em um agitador durante três minutos.Em seguida, remova o BBTW com uma pipeta e repita este procedimento cinco vezes. Bloqueie a amostra com solução de soro normal 5% em BBTW e agite suavemente por 30 minutos. Em seguida, remova a solução.Adicione anticorpo secundário diluído em solução BBTW com 5% de soro normal e envolva o tubo com papel alumínio. Em seguida, agite a amostra durante a noite a quatro graus Celsius. Remova os anticorpos secundários com uma pipeta e lave a amostra duas vezes com um mililitro de PBTW.Em seguida, adicione um mililitro de PBTW ao vial e coloque-o em um agitador durante cinco minutos. Em seguida, deixe a amostra sedimentar e remova o PBTW com uma pipeta. Repita este procedimento.Dê três passos. Adicione 80 a 100 microlitros da solução co DAB ao tubo e armazene-o a menos 20 graus Celsius. Por fim, para montar a amostra, use cinco a 10 microlitros de diamina de dab BCO p-lene, ou PPD anti-fade.Em seguida, visualize-o por microscopia de fluorescência. Essas projeções Z de quatro cortes confocais demonstram a eficácia do protocolo para visualizar características morfológicas, bem como células individuais em C dois durante as fases tardias embrionárias até as fases iniciais e médias de L três do desenvolvimento de drosophila. O desenvolvimento dos testículos é um sistema particularmente adequado para ilustrar a eficácia do protocolo, pois a maturação dos testículos é dinâmica ao longo do desenvolvimento larval.Essas imagens destacam as células germinativas em vermelho e as células do hub e zonas FU em verde, em seções confocais simples de cérebros de larvas de terceiro estágio médio. Imunomarcação para células-mãe ganglionares e neurônios indiferenciados em verde, e neurônios imaturos e primários. Em vermelho, observa-se marcação intensa com padrões de expressão distintos nos lóbulos cerebrais e no cordão nervoso ventral, dependendo da orientação do montagem; a imagem permite a visualização do tecido cerebral a partir da superfície dorsal, superfície ventral ou em corte sagital.Esta técnica in situ dois permite que biólogos explorem o desenvolvimento de órgãos na morfogênese tecidual em organismos nos quais o cutículo protetor impede a penetração de anticorpos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sonicar e imunomarcar amostras de esôfago em estágios tardios de embriões e larvas para visualizar tecidos em desenvolvimento em C dois. Não se esqueça de que o trabalho com formaldeído, heptano e metanol pode ser extremamente perigoso e exige precauções, como trabalhar em uma câmara de fluxo laminar.Usar luvas apropriadas e jaleco de laboratório deve ser sempre observado ao realizar este procedimento.

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval

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