Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Este vídeo demonstra um procedimento para montar embriões de drosófila para obter imagens de hemócitos. Seus macrófagos embrionários. Os embriões são colocados por moscas em placas de ágar suco de maçã em uma gaiola de postura durante a noite.

No dia seguinte, a placa agrícola é removida e os embriões são lavados da placa agrícola para um filtro de células após lavagens adicionais para remover os detritos. O filtro de células contendo embriões é submerso em alvejante para revestir os embriões. Após a lavagem do alvejante, os embriões são transferidos para uma gota de água.

A gota de água é então aspirada e os embriões são cobertos com óleo de carbono hello. Embriões adequadamente estadiados com citos he visíveis são transferidos para um Petri por membrana entre duas lamínulas afixadas e cuidadosamente alinhados em óleo. Uma terceira lamínula é então colocada sobre os embriões e colada no lugar com esmalte

A motilidade dos hemócitos dentro do embrião agora pode ser visualizada através da lamínula superior em um microscópio. Olá, sou Jennifer Zaed do laboratório Brian Strm na divisão de aluguel de Seul e biofísica molecular no Kings College London. E eu sou Ian Evans, do Laboratório de Madeira do Departamento de Biologia e Bioquímica da Universidade de Bath.

Hoje mostraremos um procedimento para montar Josephs bryo à imagem ao vivo, o local do hemo, os macrófagos embrionários deste organismo. Usamos esse procedimento para estudar a dispersão do desenvolvimento e a resposta do vento a essas importantes células imunes e a maquinaria do citoesqueleto que elas utilizam para realizar esses processos. Então, vamos começar.

Comece este procedimento obtendo linhas TROs OAL apropriadas contendo drivers de gal quatro específicos para hemócitos e repórteres fluorescentes geneticamente codificados sob controle de UAS. Aqui, a serpente gal quatro é usada para conduzir a expressão de um marcador nuclear vermelho fluorescente do UAS Red Stinger. Para uma discussão sobre a gama de quatro drivers GAL recomendados e construções UAS, consulte o protocolo escrito que acompanha 20 drosófilas de cada sexo em uma gaiola de postura.

A gaiola de postura é composta por uma placa agrícola de suco de maçã de 55 mililitros encaixada na parte inferior de um tubo de plástico com gaze cobrindo a outra extremidade para permitir o fluxo de ar. Alternativamente, um simples pico de plástico pode ser usado com furos. Perfurando a base, permita que as moscas se aclimatem à gaiola de postura por pelo menos dois dias após a aclimatação, mude para uma nova grelha de suco de maçã pré-quente e deixe as moscas deitarem durante a noite a 25 graus Celsius.

Para obter informações sobre a coleta de embriões estadiados de forma mais discreta, consulte o protocolo escrito que acompanha. Depois que as moscas forem incubadas pelo tempo adequado para a postura, use um frasco de lavagem para aplicar aproximadamente três mililitros de água no prato. Em seguida, usando um pincel de ponta macia, desalojar os embriões do suco de maçã, os embriões desalojados podem ser facilmente vistos a olho nu segurando um filtro de células sobre um copo.

Despeje a água do suco de maçã no filtro de células para coletar os embriões. Em seguida, adicione mais água ao suco de maçã. Aate. Repita o processo de coação até que o número desejado de embriões seja coletado.

Em seguida, usando um frasco de lavagem, lave os embriões no filtro de células usando aproximadamente 10 mililitros de água. Depois que os embriões forem lavados, coloque o filtro de células na tampa do suco de maçã Arejar. Adicione alvejante puro o suficiente para suspender os embriões no filtro de células para revestir os embriões.

Transfira o filtro de células e a tampa da placa de Petri para um microscópio de dissecção para acompanhar a decoração dos embriões. Sob iluminação de campo claro, a decoração está completa quando os apêndices dorsais se dissolvem, o que deve ocorrer em dois minutos. Após a conclusão da decoração, remova o filtro de células contendo os embriões do alvejante, novamente, segurando o filtro sobre um copo.

Use um frasco de lavagem para lavar suavemente, mas completamente, o alvejante residual. Aplique tecidos de laboratório de cor azul na parte inferior do filtro de células para enxugar a água restante. Se a cor azul mudar para branco ou rosa resíduo de alvejante, continue lavando certificando-se de que todos os vestígios de alvejante foram removidos antes de prosseguir para a próxima etapa.

A remoção do excesso de água do filtro de células facilita a coleta de embriões com um pincel na próxima etapa. Depois que todo o alvejante for removido dos embriões, coloque uma gota de água na tampa de uma placa de Petri com um pincel fino. Colete todos os embriões revestidos do filtro e ressuspenda-os na gota.

Em seguida, aplique um lenço químico na parte externa do filtro de células para secar os embriões. Depois que os embriões estiverem secos, adicione uma gota de óleo de halo carbono, 700 para cobrir todos os embriões. Em seguida, coloque uma segunda pequena gota de óleo adjacente à gota contendo os embriões.

Inspecione os embriões sob um microscópio de dissecção fluorescente. Identifique embriões adequadamente estadiados do genótipo desejado para obter imagens da migração lateral dos citos. Na linha média ventral.

Escolha os embriões do estágio 13 a 14. Neste exemplo, os citos são identificados pelos núcleos fluorescentes e são visíveis na cabeça e ao longo do cordão nervoso ventral e no vaso dorsal em desenvolvimento para visualizar a motilidade dos hemos após a dispersão sobre o embrião, escolha embriões em estágio 15. Nesta fase, os hemos terão se dispersado por todo o embrião.

No entanto, três linhas paralelas de hemos devem ser visíveis no lado ventral do embrião após a migração lateral da linha média. Uma vez que os embriões tenham sido selecionados, use um par de pinças curvas de relojoeiro número cinco para recolher os embriões selecionados. Tomando cuidado para não perfurar as membranas do frasco.

Em seguida, coloque os embriões na segunda gota de óleo na parte inferior de uma placa de Petri perm lumax de 50 milímetros. Coloque duas pequenas gotas de óleo Halo Caron 700 com cerca de um centímetro de distância. Aplique uma lamínula a cada gota sob iluminação de campo claro em um microscópio de dissecação.

Transfira cuidadosamente até 15 embriões usando uma pinça curva. Alinhando os embriões com o lado ventral para cima e paralelo à borda da tampa. Desliza uma vez que os embriões são alinhados em uma pequena gota de óleo e permite que ele se espalhe para formar uma camada homogênea entre as duas lamínulas.

Depois que o óleo se espalhar, isso pode levar alguns minutos. Verifique se os embriões ainda são ventrais. Lado para cima se os embriões rolaram ligeiramente.

Reposicione-os novamente com a pinça. Finalmente usando a pinça número três. Coloque uma terceira lamínula sobre os embriões.

Fazendo a ponte entre as duas lamínulas previamente aderidas. Cole esta lamínula na capa. Deslize os suportes usando esmalte.

Os embriões agora estão prontos para a imagem. Este embrião SRP gal quatro UAS Red Stinger foi montado com o lado ventral para cima e as imagens de lapso de tempo foram adquiridas em um microscópio de dissecção fluorescente Leica M 2 0 5. Os citos são visualizados por seus núcleos marcados em vermelho.

O filme começa no estágio 12 a 13 de desenvolvimento, quando os citos deixam a cabeça e migram para baixo na linha média ventral. Após cerca de uma hora, os citos começam a migrar para fora da linha média para se dispersar para posições laterais ao longo da superfície ventral. Para o restante do desenvolvimento.

Os hemócitos são altamente ativos, migrando por todo o embrião. Temos que mostrar como monitorar o embrião de Joseph para acompanhar o movimento ou o lado hemo ao vivo in vivo. Ao fazer este procedimento, é importante manusear os embriões com cuidado, especialmente na placa de perm de petróleo, para evitar danos Uma vez que os embriões estão em óleo, eles são relativamente resistentes à desidratação, mas deve-se tomar cuidado para não branquear os embriões por muito tempo ao remover o córion.

Por fim, ao montar vários embriões, você terá a melhor chance possível de obter um embrião na orientação perfeita para imagens ao vivo. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.