Name: Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a avaliar a composição e função dos segmentos nefrônicos no rim adulto de Danio rerio usando marcação fluorescente e microscopia. Este protocolo auxilia pesquisadores em estudos de nefrologia e regeneração renal.

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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para a RAW a partir do seguinte: Institutos Nacionais de Saúde concede K01 DK083512, DP2 OD008470, e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor iniciantes Scholar concessão de uma subvenção # 5 FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame College of Science e do Departamento de Ciências Biológicas; e uma generosa doação para a Universidade de Notre Dame de Elizabeth e Michael Gallagher, em nome da família Gallagher para promover a investigação em células estaminais. Os financiadores não tinham qualquer papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa de peixe-zebra em Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar da nossa colônia de peixe-zebra. Finalmente, agradecemos aos membros do nosso laboratório de pesquisa para seus comentários, discussões e idéias sobre este trabalho.

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, descrevemos métodos que permitem a visualização dos componentes do segmento nefrónio no peixe-zebra adultos. A injeção de conjugados de dextran fluorescentes permite rotulagem PCT preferencial devido as propriedades de endocitose dessas células do túbulo proximal 30,38. Este método pode ser realizado com grande flexibilidade, devido à existência de dextranos que pode ser obtida com um grupo de diferentes conjugados fluorescentes. Além disso, a utilização de dextranos de lisina-fixável é uma forma especialmente conveniente para rotular PCT segmentos, como procedimentos de marcação secundárias não são necessários. Isso permite a detecção do sinal relativamente simples e é compatível com muitas outras marcas fluorescentes, imunomarcação e uso de linhas repórter transgênicos. Rotulagem de fosfatase alcalina também marca o túbulo proximal, com forte reação no PCT e reactividade ligeiramente mais fraco no PST. Finalmente, a coloração com DBA permite rotulagem dos segmentos tubulares distais, que exibem um characteristic ramificada morfologia. Várias moléculas de lectina, que são proteínas de ligação de açúcar de origem não-imune, têm sido amplamente utilizados para distinguir os segmentos de nefrónios de mamíferos 47. É interessante que no peixe-zebra DBA correlaciona-se com os segmentos do túbulo distai, uma vez que é utilizado para marcar ductos coletores em rins de mamíferos 47. Tomados em conjunto, estes métodos podem ser utilizados em várias combinações para documentar composição e função renal. Uma vez que todos estes métodos podem ser usados ​​em preparações de rim de inteiros, eles fornecem ferramentas para avaliar estrutura nefrónios e função ao longo do órgão, sem depender exclusivamente a utilização de mais demorado, métodos tediosas, por exemplo, o trabalho de criocorte e imunomarcação. No entanto, os corantes descritos neste artigo métodos são viáveis ​​no criocorte. Análise cryosection gera amostras (em comparação com todo mount) que são mais adequadas para imunohistoquímica para detectar Pepti específicosdes, embora, naturalmente, este tipo de análise requer a disponibilidade de anticorpos primários adequados. Infelizmente uma grande limitação em trabalhar com o modelo animal peixe-zebra continua a ser a fraca disponibilidade de anticorpos. Assim DESEJO continua a ser o mais utilizado, ou seja, &quot;go-to&quot;, procedimento para a análise da expressão gênica. DESEJO usando reações de substrato BCIP, NBT, e / ou INT para produzir precipitados roxo ou vermelho não é compatível com coloração fluorescente em criossecções. Uma opção seria a utilização de invocar a detecção DESEJOS fluorescente, um procedimento que foi optimizado para as amostras de peixes-zebra embrionários e pode ser adaptado para uso com o rim de adulto. A descrição dos métodos neste artigo de vídeo deve permitir uma maior experimentação com técnicas como DESEJO fluorescente em combinação com linhas de peixes-zebra transgénicos em que os segmentos individuais são marcadas com um repórter como eGFP ou mCherry. Alternativamente, os métodos descritos aqui could ser testados em combinação com outros corantes vitais, por exemplo, outras lectinas. Assim, uma nova adaptação e ampliação dos métodos descritos aqui poderia ser invocado para atender às necessidades do investigador para preparações integrais renais montagem e análise. Como tal, estes métodos têm larga aplicação potencial de peixe-zebra com o modelo para os estudos de regeneração em curso e também em modelos de doença genética. Há uma necessidade premente de pesquisas inovadoras e tratamentos para males renais. Milhões de pessoas sofrem de algum tipo de doença renal a cada ano que resulta de causas congênitas, agudas e / ou crônicas. Além disso, a prevalência da doença renal continua a aumentar em todo o mundo, fazendo com que essas doenças um problema global de saúde pública 14,15. Tratamentos como a hemodiálise estão disponíveis através do qual uma máquina de diálise externo serve para livrar o sangue de resíduos metabólicos do paciente, se os seus rins não são capazes de desempenhar esse papel. Infelizmente, Esta intervenção tem limitações, como é necessário para a sobrevivência de tratamento contínuo. Além disso, os doentes irão eventualmente necessitar de um transplante de rim, o que pode levar anos para receber uma vez por paciente é colocado em uma lista de espera. Mesmo depois da obtenção de um transplante de rim, muitos pacientes sofrem efeitos adversos, como resultado do procedimento e deve lutar esses efeitos para o resto de suas vidas. Essas dificuldades demonstram a grande necessidade para o desenvolvimento de novos tratamentos para ajudar a prevenir qualquer doença renal ou talvez aumentar a regeneração dos tecidos 8,16,52,53. Dadas as limitações óbvias éticos da utilização de cobaias em laboratórios biomédicos humanos, os modelos animais são essenciais para o estudo da patogénese da doença humana e para o ensaio de novos tratamentos. Como um resultado da sua semelhança e proximidade anatómica evolutiva, o ratinho se tornou o modelo o mais amplamente usado para a doença humana 45. No entanto, existem algumas limitações com este animal, incluing incapacidade de visualizar o desenvolvimento de órgãos in vivo e praticidade de completar telas genéticos de larga escala. Peixe-zebra é um organismo modelo relevante e útil para o estudo do desenvolvimento dos órgãos e modelagem de doenças humanas 45,46. Em relação à doença humana, homólogos funcionais no peixe-zebra existem para quase 70% de todos os genes humanos 54,55. Trabalhos recentes destacaram a utilidade do peixe-zebra para muitas áreas de 31,37,56 pesquisa renal. Estudos de regeneração e reparo no peixe-zebra após AKI sugerem que a regeneração epitelial tubular e neonephrogenesis são dois processos que ocorrem e se sobrepõem ao longo da regeneração timecourse 30,37. A utilização de um antibiótico aminoglicósido gentamicina chamada tem sido utilizada como um paradigma da lesão, através do qual a estudar os resultados de LRA 29,30,37 em peixes-zebra adultos. Ao longo de aproximadamente duas semanas de período após lesão de gentamicina, a Tubul proximales regenerar, e, entretanto, novos néfrons formar por todo o órgão 29,30,37. Em geral, os mecanismos que regulam a regeneração epitelial permanecem altamente controversa. Em um mecanismo proposto para o processo de reparação, não é o evento lesão aguda inicial, seguido por um desprendimento de células mortas para o lúmen. Em seguida, há uma série de desdiferenciação, proliferação e migração de eventos, após o qual as novas células se diferenciam, o repovoamento da membrana basal lesada e restaurar a função para o local ferido. Alternativamente, outros estudos sugeriram que as células de substituição surgem a partir de células estaminais / progenitoras que residem dentro dos túbulos dos néfrons. No que respeita ao processo de neonephrogenesis no peixe-zebra, agregados celulares foram observadas após AKI pela injeção de gentamicina 29,30. Estes agregados depois amadurecer em novos néfrons que sondar em túbulos já existentes 29,30. O traço comum que une néfrons regeneração epitelial e neonephrogenesis é seu fator de mistério pura: no momento não são exponencialmente mais perguntas sobre como esses feitos regenerativos ocorrer do que há idéias disponíveis. Até o momento, no entanto, várias linhas emocionantes de evidências sustentam a noção de que a pesquisa de regeneração renal usando zebrafish pode realmente fornecer informações comparativas pertinentes para AKI humano que também pode ter direto de translação potencial 56-58. Rastreio químico para identificar pequenas moléculas que aumentam a proliferação das células progenitoras renais no embrião do peixe-zebra recentemente conduziu à identificação do inibidor de histona desacetilase butanoato de metilo-4 (feniltio) (m4PTB) 56,57. A administração desse composto de larvas do peixe com induzida por gentamicina AKI revelou que a sobrevivência larval aumentou e que a proliferação tubular renal foi melhorada 56,58. Quando os ratos com lesão renal aguda induzida por isquemia moderada foram tratados com m4PTB, sua recuperação foi acelerada em association com uma redução tanto atrofia e ciclo celular tubular prisão de proliferação de células tubulares renais 58. Estas descobertas sugerem que as vias responsáveis ​​para o normal desenvolvimento do peixe-zebra renal e / ou a resposta regenerativa de LRA será conservada com mamíferos 56. Assim, embora mais estudos são necessários para separar os mecanismos de regeneração, ou seja identificar as vias de sinalização que estão envolvidos e entender suas interações-o peixe-zebra fornece um caminho promissor para perseguir este objetivo importante na área de nefrologia. As ferramentas tais como as etiquetas de células nefrónio descritos neste protocolo representa um grupo de ensaios que podem ser utilizados para avaliar a composição e funcionalidade renal em modelos LRA. Além disso, eles podem ser utilizados para caracterizar os modelos transgénicos de doença renal e podem proporcionar formas para identificar agentes terapêuticos químicos capazes de promover a restauração da estrutura depois de nefrónio barragem renalidade.

O rim é um órgão complexo que cumpre uma série de funções fisiológicas no corpo. A função mais importante do rim é a excreção de resíduos metabólicos, e esta tarefa está intimamente entrelaçada com a manutenção da homeostase dos fluidos. O rim executa esses trabalhos por filtração do sangue e formação de urina, enquanto concomitantemente regulação da pressão arterial, os níveis de eletrólitos e equilíbrio ácido-base. Túbulos epiteliais altamente especializadas chamadas nefrónios servir como a unidade funcional de base do rim 1,2. Nos vertebrados adultos, néfrons são normalmente organizados em um arranjo bem enrolada em torno de um sistema de drenagem centralizada, permitindo, assim, muitos túbulos de embalar para o relativamente pequeno órgão. Por exemplo, cada rim humano pode conter mais de 1 milhão de néfrons 3. Outros mamíferos como o mouse possuem na ordem de 8-10000 néfrons por renal 4. O grau de complexidade renal difere entre esses mamíferos e outras vertebrates devido a variações no número total de néfrons e seu layout arquitetônico dentro do rim. Espécies de vertebrados formar até três sucessivas estruturas renais durante o desenvolvimento, e cada forma exibe uma complexidade crescente em relação à dotação de néfrons e disposição: os pronephros, mesonephros e metanefro. A última estrutura renal a ser retida serve como o rim adulto tipicamente um órgão ou um mesonefros metanefros 2. Cada forma de rim, no entanto, tem uma composição à base de nefrónio 2. O néfron é o carro-chefe do rim e é responsável pela filtragem do sangue, juntamente com secreção metabólito e reabsorção. Néfrons são estruturas tubulares simples formadas por células epiteliais e têm uma organização segmentar, em que domínios discretos, altamente especializados e de epitélios diferenciados executar tarefas específicas. Na ordem do fluxo de filtrado através do néfron, normalmente há três partes principais que comprise cada uma das unidades: (1) o corpúsculo renal, (2) um túbulo proximal com, intermédia, e distais, e (3) uma conduta de recolha 1. O túbulo proximal é responsável pela reabsorção de solutos orgânicos, mais notavelmente glicose e os aminoácidos 1. O túbulo intermediário (ou alça de Henle) é um importante local de sal e água a regra 1. Finalmente, ajuste fino de sal e outros íons ocorre no túbulo distal e ducto coletor e é altamente regulado pelo sistema endócrino 1. A partir daí, o filtrado viaja através do ureter e da bexiga, em última análise, que sai do corpo como um produto residual 1. A perda da função renal pode ser resultado de uma multiplicidade de causas que impedem a atividade de néfrons normal. Essas causas podem ocorrer durante o desenvolvimento do rim, por exemplo, defeitos congênitos que levam à má formação de néfrons 5 ou causas de diferentes tipos de lesão (decorrente tanto genética e environmeorigens ntal). Lesões adquiridas são amplamente classificados como lesão renal aguda (IRA) ou lesão renal crônica (DRC). LRA envolve uma perda abrupta da função renal, muitas vezes resultante de isquemia ou toxina exposição 6,7. Nos mamíferos, reparação epitelial de néfrons é possível após tais lesões 8, e muitas pessoas exibem a restauração completa da função renal após AKI. No entanto, AKI também está associada com alta morbidade e mortalidade que foram relatados através de uma ampla 30 - 70% de incidência 6,7. DRC, em contraste, está associada com a perda progressiva da função renal que resulta de anos de danos prolongado, tipicamente associada com fibrose 8,9. Além disso, existe uma interação entre AKI e CKD, como qualquer um pode predispor um indivíduo para o outro 10-12. Por exemplo, aqueles que sofreram AKI são mais suscetíveis à doença renal crônica e mesmo a morte 13. A incidência da doença renal, em ambos os EUA e em todo o mundo, atingiu epideproporções de microfone e está prevista a aumentar como a população idosa expande-, portanto, há uma necessidade crescente de identificar intervenções de medicina regenerativa para o rim 14,15. Apesar do conhecimento de que pacientes com LRA pode se recuperar, há muito tempo se pensou que o rim é um órgão sem poderes regenerativos inatas. Esta visão tradicional foi revisado drasticamente nos últimos anos 16. Estudos investigando dano renal em camundongos e ratos após AKI têm mostrado que as células epiteliais do túbulo do néfron podem proliferar e reconstruir néfrons funcionais 17-20. Embora os mamíferos possuem essa capacidade adaptativa para regenerar néfrons, existem limitações notáveis ​​e respostas inadaptadas podem ser desencadeadas que levam a fibrose renal e CKD 21. Por exemplo, um estudo recente demonstrou que a ablação das células epiteliais repetido em nefrónios murino foi associada com a regeneração diminuída e nefrónios-sugerindo fibrose renal havea limitada limiar regeneração 22. Não há nenhuma evidência de que o rim de mamífero adulto forma novas nefrónios para substituir os perdidos ou danificados, assim, a sua destruição leva a um défice de 8,9 nefrónio permanente. Curiosamente, alguns vertebrados respondem a AKI regenerando néfrons epitélio e por também produzir novos néfrons, um processo conhecido como neonephrogenesis ou néfrons neogênese 23. Neonephrogenesis ocorre em peixes após exposição a uma toxina ou ressecção parcial e modelos de lesão incluíram historicamente o peixinho 24,25, tilápia 26, patim 27, medaka 28 e, mais recentemente, o peixe-zebra 29,30. Destes, peixe-zebra fornecer um modelo de pesquisa genética viável para descobrir as vias celulares e moleculares responsáveis ​​pela regeneração renal. Neste artigo de vídeo, demonstramos como rotular segmentos dos néfrons em peixe-zebra adulto. O conhecimento da anatomia de néfrons, as características moleculares,e características funcionais são essenciais para estudos renais futuro de sucesso usando zebrafish. O rim adulto do peixe-zebra é uma estrutura mesonefros e é inerentemente menos complexo, em termos de número de nefrónios e organização do que a estrutura de metanefros encontrada em mamíferos adultos, aves, répteis e 31. Contudo, a organização segmento nefrónio do peixe-zebra é análogo aos mamíferos, e foi documentada no rim embrionário com base em estudos de expressão de genes 31-35. Nefrónios de embriões de peixes-zebra conter segmentos lineares tubulares que incluem o túbulo proximal (PCT), túbulo proximal recta (PST), distal precoce (DE), e distal tarde (DL) 31-35 (Figura 1). Nefrónios adultos Zebrafish possuem segmentos tubulares semelhantes 30,31,36,37 (Figura 1). O PCT, também podem ser identificados por um fenótipo funcional: As células epiteliais na PCT irá incorporar compostos de dextrano marcados com fluorescência (10-70 kDa em tamanho) presentes nocirculação, que foi usado tanto no rim embrionário do peixe-zebra e adulto para avaliar a absorção de endocitose por essas células do túbulo proximal, 38-41 (Figura 1). Uma diferença em segmentos dos néfrons entre peixe-zebra e mamíferos é que carecem de um peixe-zebra túbulo intermediário, ou alça de Henle 30-37; uma vez que este segmento funciona em mamíferos para conservar a água e peixe-zebra são uma espécie de água doce, sem a urgência de concentrar a urina, não é de estranhar que zebrafish falta neste segmento 32,33. Assim, a composição global nefrónio é largamente conservada entre o peixe-zebra e rim de mamífero 32,33. Estas semelhanças permitiram peixe-zebra para ser uma ferramenta eficaz de investigação para investigar as funções dos genes expressos-renais durante nefrogênese desenvolvimento 32-35,42 e modelar inúmeras doenças renais 43,44, o que agrava a lista substancial das condições humanas que podem ser investigada usandozebrafish 45,46. Hoje, o rim adulto peixe-zebra é um modelo atraente para estudos comparativos de regeneração renal devido à sua rastreabilidade genética eo palato expansão dos recursos tecnológicos disponíveis para interrogar a função do gene e vias de sinalização nesta espécie. Vários estudos têm utilizado os mesonephros peixe-zebra para investigar os mecanismos de regeneração após AKI 29,30,37. Para a pesquisa AKI continuou usando o rim adulto peixe-zebra, é essencial dispor de métodos requintados para rotular diferentes regiões e métodos de néfrons para examinar a funcionalidade de néfrons. Existem vários métodos de análise de rim adulto foram adaptados a partir de protocolos de rim embrionário. A injecção intraperitoneal de dextrano marcado fluorescentemente no peixe-zebra adultos rótulos do epitélio em PCT Mesonefros nefrónios via endocitose 30, como em embriões de peixe-zebra 38-41 (Figura 1). Este método tem sido utilizado para visualize quando túbulos proximais recuperar a sua propriedade reabsorvendo seguinte AKI, o que permite uma avaliação das restaurado função fisiológica 30 (Figura 1). Outra característica do túbulo proximal nefrónio é que as células epiteliais deste segmento possuir uma borda em escova 37 que apresenta elevados níveis de actividade de fosfatase alcalina endógena. Assim, o epitélio proximal pode ser localizada visualmente no rim adulto peixe-zebra utilizando uma técnica de fluorescência com base conhecido como ELF- (Enzyme-Labeled Fluorescência) -97 47. Aqui, nós descrevemos como realizar ensaios de captação de dextrano fluorescentes 30,48 no rim adulto peixe-zebra, de modo a obter uma avaliação funcional do túbulo proximal e mapear o tamanho e os contornos do segmento tubular. Em seguida, descreve-se técnicas para identificar as regiões do túbulo proximal do nefrónio adulto com a fosfatase alcalina marcador fluorescente. Em terceiro lugar, mostramos pela primeira vez que o Rhodamina marcada com lectina de aglutinina de Dolichos biflorus (DBA), a qual tem sido utilizada como um marcador geral das condutas de recolha no rim de mamíferos 49, marca os túbulos distais do rim adulto peixe-zebra. Como DBA é mutuamente exclusiva à coloração da fosfatase alcalina, esses rótulos fornecem uma maneira de distinguir amplamente pan-proximal contra trechos pan-distais do néfron zebrafish adulto. Ao longo da implementação destas manchas fluorescentes em todo tanto montagem e cortes histológicos criostáticas, nós correlacionar esses rótulos com domínios de genes transportadores de soluto que identificam cada um dos segmentos de néfrons de expressão. Portanto, este protocolo também contém um guia para os procedimentos de processamento de tecidos modificados para todo tecido adulto montagem de hibridação in situ (desejo) a análise com base em nosso protocolo DESEJO embrião 50. Estes procedimentos podem ser utilizados em combinações diferentes (Figura 2) para documentar características morfológicas e funcionais of adultos néfrons nos rins do peixe-zebra. Assim, estes protocolos podem ser aplicados a estudos de regeneração, a caracterização fenotípica dos outros modelos de doenças renais, e até mesmo utilizado para estudar a formação de rim adulto.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Feito diluindo 10 X PBS em água destilada.</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% Tween-20 detergente em 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS com 0,05% de detergente Tween-20</td><td></td><td></td><td>Tween-20 em 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolva 4% PFA (p/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) em 1 X PBS, leve para ferver em uma placa quente em uma capela de exaustão. Resfrie e congele as alíquotas para armazenamento no freezer a -20 graus C. Descongele imediatamente antes de usar e não congele novamente os estoques.</td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Padrão de Pinça #55&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâmina</td><td>de vidro Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>Branco Frost&nbsp;</td></tr><tr><td>Lamínula de vidro</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Massa de modelar</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Outras massas de modelar podem ser substituídas e funcionam de forma semelhante</td></tr><tr><td>Porta-lâminas</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Opcional: bandeja de papelão para armazenar lâminas planas</td></tr><tr><td>Solução de</td><td></td><td></td> <td>branqueamentoFórmula de mistura de alvejante (para uma solução de 20 ml): 1,6 ml de solução de hidróxido de potássio a 10% 0,6 ml de solução de peróxido de hidrogênio a 30% 100 &mu; l de 20% Tween Encher até 20 ml com água destilada</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de bloqueio <td>Solução de bloqueio (para uma solução de 10 ml): 8 ml de PBS 1X com 0,05% de Tween 2 ml de soro fetal de bezerro 150 &mu; l de DMSO</td></tr><tr><td>Detecção de atividade de fosfatase alcalina</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>Utilizamos o Kit de Detecção de Fosfatase Endógena ELF 97.&nbsp; Para preparar a solução de substrato de trabalho, dilua o substrato 20 vezes no tampão de detecção, de acordo com as instruções do fabricante.</td></tr><tr><td>Solução de lavagem</td><td></td><td></td> de fosfatase alcalina <td>Receita para solução tampão de lavagem (para uma solução de 100 ml): 5 ml de 0,5 M EDTA 120 mg de Levamisol 95 ml de 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluoresceína, 40.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Diluir com água destilada para fazer uma solução estoque de 50 mg/ml, e armazenar alíquotas no freezer a -20 graus C.</td></tr><tr><td>Dextrana, azul em cascata, 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Diluir com água destilada para fazer uma solução-mãe de 50 mg/ml e armazenar alíquotas no freezer a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Dextrano, amarelo de lúcifer, 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Diluir com água destilada para fazer uma solução-mãe de 50 mg/ml e armazenar alíquotas no freezer a -20 graus Celsius.</td></tr><tr><td>Dextrano, tetrametilrodamina (fluoro-rubi), 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Diluir com água destilada para fazer uma solução-mãe de 50 mg/ml e armazenar alíquotas no freezer a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus aglutinina (DBA)-rodamina</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>Solução de Coloração DBA (para um 100 &mu; l solução): 1 &mu; l de DBA 99 &mu; l de 1X</td></tr><tr><td>PBS Propidium iodeto</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard set montagem média</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro vidro de cobertura</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, solução 0,5 M, pH 8,0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Meio de congelamento de tecidos</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 lâminas de microscópio adesivas</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de líquidos - caneta super PAP</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de umidade de imunocoloração</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&trade; Estereomicroscópio Criostato</td><td></td>HM 525</tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Azul GFP/DAPI; 83457 P-Dotar GFP/FITC; 83457 O conjunto de filtros P-TRITC</td><td>usado foi o seguinte: O filtro Hoechst / DAPI foi usado para detecção de DAPI, iodeto de propídio, azul de cascata de dextrana e fosfatase alcalina. O filtro GFP/FITC foi usado para detecção de dextran-FITC, amarelo de lúcifer dextrano e anti-GFP. O filtro TRITC foi usado para detecção de dextrano-fluoro-rubi, PI e DBA.</td></tr><tr><td>Microscópio composto</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>O conjunto de filtros usado foi o seguinte: O filtro Hoechst/DAPI foi usado para detecção de DAPI, iodeto de propídio, azul de cascata de dextrana e fosfatase alcalina. O filtro GFP/FITC foi usado para detecção de dextran-FITC, amarelo de lúcifer dextrano e anti-GFP. O filtro Texas Red foi usado para detecção de dextrano-fluoro-rubi, PI e DBA.&nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

análise de composição nephron e função no rim adulto zebrafish

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

O modelo de peixe-zebra tem emergido como um sistema relevante para estudar o desenvolvimento do rim, a regeneração e a doença. Ambos os rins de peixes-zebra embrionários e adultos são compostas de unidades de nefrónios funcionais conhecidos como, que são altamente conservadas com outros vertebrados, incluindo mamíferos. Pesquisa em zebrafish demonstrou recentemente que dois fenômenos distintos transpire após néfrons adultos estão sujeitos a danos: primeiro, não há regeneração robusta dentro de néfrons existentes que substitui as células epiteliais do túbulo destruídos; segundo, inteiramente novos nefrónios são produzidos a partir de células progenitoras renais em um processo conhecido como neonephrogenesis. Em contraste, os seres humanos e outros mamíferos parecem ter apenas uma capacidade limitada de regeneração epitelial nefrónio. Até à data, os mecanismos responsáveis ​​por esses fenômenos de regeneração renal permanecem pouco compreendidos. Desde rins peixe-zebra adulto sofrer tanto a regeneração epitelial néfrons e neonephrogenesis, eles fornecem um par experimental excelentedigma para estudar esses eventos. Além disso, há uma grande variedade de ferramentas genéticas e farmacológicos disponíveis no modelo de peixe-zebra que podem ser utilizadas para delinear os mecanismos celulares e moleculares que regulam a regeneração renal. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve um conjunto de técnicas de marcação que podem ser usadas para medir a composição e funcionalidade renal teste nefrónio do rim adulto peixe-zebra. Assim, estes métodos são amplamente aplicáveis ​​para o futuro caracterização fenotípica dos paradigmas de peixe-zebra adultos de lesão renal, que incluem mas não estão limitados a, os regimes de exposição nephrotoxicant ou métodos genéticos de morte celular-alvo, tais como a nitro-redutase mediada técnica de ablação celular. Além disso, estes métodos podem ser utilizados para estudar a formação de perturbações genéticas em rim de adultos e pode também ser aplicado para avaliar o estado da doença renal crónica durante a modelação.

O rim adulto do peixe-zebra é um excelente sistema para os estudos de regeneração e de doenças renais. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve várias metodologias que podem ser implementadas para avaliar a composição de néfrons túbulo e avaliar a reabsorção renal.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a composição e a funcionalidade do segmento de néfrons no rim de peixe-zebra adulto. Isso é feito injetando primeiro dextrina marcada com fluorescência em um ninho que amarra o peixe-zebra. O segundo passo é remover e consertar o rim para preparar o tecido para métodos de rotulagem subsequentes.Em seguida, o rim é branqueado para remover a pigmentação e, em seguida, corado para marcar fluorescentemente os segmentos de néfrons desejados. Os resultados são obtidos usando imunofluorescência, microscopia e/ou imagens de campo claro que permitem a visualização da anatomia renal com base na coloração ou colorações selecionadas. Os métodos de rotulagem a seguir podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo renal em relação à anatomia do órgão e podem ser usados para estudar a composição do néfron e avaliar a funcionalidade renal antes e depois de um evento de lesão.As implicações dessas técnicas se estendem ao estudo de anomalias genéticas na formação renal adulta e também podem ser aplicadas para avaliar o estado renal durante a modelagem de doenças crônicas. Para começar, decantar a solução de um peixe anestesiado e cuidadosamente colocar o animal em um molde de esponja molhada lado ventral. Em seguida, encha uma seringa de insulina com 20 microlitros de solução estoque de dextrina descongelada.Coloque a agulha de forma que a inserção ocorra em um ângulo raso na linha média ventral do abdômen. Para evitar injetar ligeiramente os órgãos, levante a agulha logo após a injeção para levantar a parede do corpo e criar um espaço para injetar a solução. Após a injeção, retorne suavemente o peixe ao tanque para se recuperar da anestesia.Para começar, decantar qualquer solução extra de um peixe anestesiado e coloque-o sobre um lenço de papel ou toalha de papel. Depois de remover a cabeça e os órgãos internos, use agulhas de dissecção super finas para prender as paredes do corpo. Localize o órgão renal que está aderente à parede dorsal do animal.Use uma pinça fina para separar o rim da parede dorsal. Coloque delicadamente o rim em um frasco de vidro de cinco mililitros contendo um XPBS e lave três vezes por cinco minutos cada. Remova o rim com uma pipeta de transferência e coloque-o em um copo limpo Deslize com uma a duas gotas de um XPBS.Use uma pinça fina para achatar o rim na lâmina, certificando-se de que nenhum tecido tenha se enrolado ou virado sobre si mesmo. Uma ferramenta de fio de tungstênio pode ser usada para fazer pequenas incisões no tecido conjuntivo para facilitar o posicionamento plano do rim. Em seguida, coloque pequenos pedaços de massa de modelar em cada canto de uma lamínula de vidro de 18 por 18 milímetros.Lentamente, coloque a lamínula no rim, mantendo um ligeiro ângulo. Para minimizar o aprisionamento de bolhas de ar, adicione uma gota adicional de um XPBS para preencher o espaço entre a lamínula e a corrediça, se necessário. Um grupo separado de peixes-zebra é sacrificado e embebido em fixador durante a noite.Quando estiver pronto, use uma pinça fina para separar cuidadosamente o rim da parede dorsal do corpo e coloque o órgão em um frasco de vidro. Lave o rim dissecado três vezes com três a cinco mililitros de um XPBS com 0,05% tween por cinco minutos cada. Em seguida, remova a solução de PBS e enxágue o rim com três mililitros de uma solução de sacarose a 5% por 30 minutos.Após esse período, substitua a solução por três mililitros de sacarose a 30% e armazene durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Remova a solução e lave o rim duas vezes antes de adicionar três a cinco mililitros de solução clareadora. Para remover a pigmentação dos melanócitos presente no órgão renal, coloque o frasco de vidro em um rotador e observe cuidadosamente como a pigmentação desaparece.A despigmentação normalmente leva aproximadamente 20 minutos, mas ocasionalmente pode levar até 60 minutos. Se a solução clareadora for deixada por muito tempo, pode ocorrer desintegração e, portanto, é aconselhável monitorar a amostra a cada 10 a 15 minutos para verificar a integridade quando a pigmentação tiver sido removida da lavagem renal duas vezes e incubar com solução de PFA a 4% por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução de PFA a 4% e lave o rim três vezes após a última lavagem a três a cinco mililitros de solução bloqueadora e incube o rim em temperatura ambiente por duas horas.Quando o bloqueio estiver concluído, prossiga diretamente para o protocolo de coloração selecionado. Remova a solução de bloqueio e lave o rim três vezes antes de deixar o rim de molho em um XPBS por pelo menos 10 minutos. Durante esse tempo, transfira o rim para uma placa de cultura de 12 ou 24 poços.Substitua o XPBS por uma solução de substrato de fosfatase alcalina suficiente para cobrir a amostra e coloque a amostra em um rotador por 30 minutos à temperatura ambiente. Após este tempo, interrompa a reação lavando o rim em solução tampão de lavagem de fosfatase alcalina. Enxágue o rim com três trocas de solução tampão de lavagem por 10 a 15 minutos.Em seguida, remova a solução tampão de lavagem e monte o rim em um copo limpo. Deslize o meio de montagem de fosfatase incluído no kit de rotulagem. Visualize o rim corado com fosfatase alcalina usando um microscópio estéreo ou microscópio composto com um conjunto de filtros Debbie conectados.Primeiro, prepare uma solução de DBA de trabalho de 200 microlitros diluindo o DBA em um XPBS. Substitua a solução PBS por 200 microlitros de solução DBA e coloque a amostra em um rotador por uma hora em temperatura ambiente. Após este tempo, remova a solução de DBA e lave o rim três vezes com três a cinco mililitros de um XPBS por cinco minutos cada.Remova o XPBS e monte o rim em uma lâmina de vidro limpa. Conforme demonstrado anteriormente, visualize os segmentos distais corados com DBA do rim usando um filtro vermelho Trixie ou Texas padrão em um microscópio estéreo fluorescente ou microscópio composto. Nesta imagem de campo claro de um rim não branqueado, a pigmentação preta corresponde à população dispersa de melanócitos.Aqui, os segmentos de PCT do néfron são visualizados três dias após a injeção de dextrina. A inserção contém uma imagem de um único néfron com melanócitos. Esta imagem mostra um rim adulto após a remoção da pigmentação dos melanócitos.Essas imagens representativas mostram pequenas variações morfológicas entre os segmentos de PCT, enquanto muitos PCTs de néfrons são firmemente enrolados. Outros néfrons contêm regiões PCT que têm dextrina azul em cascata de dextrina de enrolamento mínimo, amarelo de Lúcifer e dextrina fluoro Ruby, todos marcam preferencialmente os segmentos de PCT em néfrons renais, tanto a dextrina Cascade Blue quanto o amarelo de Lúcifer mostram alguma marcação não específica com fundo muito maior observado em rins tratados com amarelo de Lúcifer. Em contraste, a dextrina fluor Ruby mostrou um fundo drasticamente reduzido com intensa marcação de PCT.Um rim adulto corado pelo desejo de detectar um marcador específico do tipo de célula transportadora PCT mostra um padrão de expressão característico da captação de dextrina com uma distribuição de vários domínios PCT em loop bem enrolados, bem como trechos PCT mais alongados que mostram um diâmetro amplo consistente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular com sucesso segmentos de néfrons dentro do rim de peixe-zebra adulto, como o túbulo proximal com fosfatase alcalina e o túbulo distal médico com DBA. Não se esqueça de que trabalhar com 4% de paraldeído pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar casaco, luvas e óculos devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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