Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a composição e a funcionalidade do segmento de néfrons no rim de peixe-zebra adulto. Isso é feito injetando primeiro dextrina marcada com fluorescência em um ninho que amarra o peixe-zebra. O segundo passo é remover e consertar o rim para preparar o tecido para métodos de rotulagem subsequentes.

Em seguida, o rim é branqueado para remover a pigmentação e, em seguida, corado para marcar fluorescentemente os segmentos de néfrons desejados. Os resultados são obtidos usando imunofluorescência, microscopia e/ou imagens de campo claro que permitem a visualização da anatomia renal com base na coloração ou colorações selecionadas. Os métodos de rotulagem a seguir podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo renal em relação à anatomia do órgão e podem ser usados para estudar a composição do néfron e avaliar a funcionalidade renal antes e depois de um evento de lesão.

As implicações dessas técnicas se estendem ao estudo de anomalias genéticas na formação renal adulta e também podem ser aplicadas para avaliar o estado renal durante a modelagem de doenças crônicas. Para começar, decantar a solução de um peixe anestesiado e cuidadosamente colocar o animal em um molde de esponja molhada lado ventral. Em seguida, encha uma seringa de insulina com 20 microlitros de solução estoque de dextrina descongelada.

Coloque a agulha de forma que a inserção ocorra em um ângulo raso na linha média ventral do abdômen. Para evitar injetar ligeiramente os órgãos, levante a agulha logo após a injeção para levantar a parede do corpo e criar um espaço para injetar a solução. Após a injeção, retorne suavemente o peixe ao tanque para se recuperar da anestesia.

Para começar, decantar qualquer solução extra de um peixe anestesiado e coloque-o sobre um lenço de papel ou toalha de papel. Depois de remover a cabeça e os órgãos internos, use agulhas de dissecção super finas para prender as paredes do corpo. Localize o órgão renal que está aderente à parede dorsal do animal.

Use uma pinça fina para separar o rim da parede dorsal. Coloque delicadamente o rim em um frasco de vidro de cinco mililitros contendo um XPBS e lave três vezes por cinco minutos cada. Remova o rim com uma pipeta de transferência e coloque-o em um copo limpo Deslize com uma a duas gotas de um XPBS.

Use uma pinça fina para achatar o rim na lâmina, certificando-se de que nenhum tecido tenha se enrolado ou virado sobre si mesmo. Uma ferramenta de fio de tungstênio pode ser usada para fazer pequenas incisões no tecido conjuntivo para facilitar o posicionamento plano do rim. Em seguida, coloque pequenos pedaços de massa de modelar em cada canto de uma lamínula de vidro de 18 por 18 milímetros.

Lentamente, coloque a lamínula no rim, mantendo um ligeiro ângulo. Para minimizar o aprisionamento de bolhas de ar, adicione uma gota adicional de um XPBS para preencher o espaço entre a lamínula e a corrediça, se necessário. Um grupo separado de peixes-zebra é sacrificado e embebido em fixador durante a noite.

Quando estiver pronto, use uma pinça fina para separar cuidadosamente o rim da parede dorsal do corpo e coloque o órgão em um frasco de vidro. Lave o rim dissecado três vezes com três a cinco mililitros de um XPBS com 0,05% tween por cinco minutos cada. Em seguida, remova a solução de PBS e enxágue o rim com três mililitros de uma solução de sacarose a 5% por 30 minutos.

Após esse período, substitua a solução por três mililitros de sacarose a 30% e armazene durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Remova a solução e lave o rim duas vezes antes de adicionar três a cinco mililitros de solução clareadora. Para remover a pigmentação dos melanócitos presente no órgão renal, coloque o frasco de vidro em um rotador e observe cuidadosamente como a pigmentação desaparece.

A despigmentação normalmente leva aproximadamente 20 minutos, mas ocasionalmente pode levar até 60 minutos. Se a solução clareadora for deixada por muito tempo, pode ocorrer desintegração e, portanto, é aconselhável monitorar a amostra a cada 10 a 15 minutos para verificar a integridade quando a pigmentação tiver sido removida da lavagem renal duas vezes e incubar com solução de PFA a 4% por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução de PFA a 4% e lave o rim três vezes após a última lavagem a três a cinco mililitros de solução bloqueadora e incube o rim em temperatura ambiente por duas horas.

Quando o bloqueio estiver concluído, prossiga diretamente para o protocolo de coloração selecionado. Remova a solução de bloqueio e lave o rim três vezes antes de deixar o rim de molho em um XPBS por pelo menos 10 minutos. Durante esse tempo, transfira o rim para uma placa de cultura de 12 ou 24 poços.

Substitua o XPBS por uma solução de substrato de fosfatase alcalina suficiente para cobrir a amostra e coloque a amostra em um rotador por 30 minutos à temperatura ambiente. Após este tempo, interrompa a reação lavando o rim em solução tampão de lavagem de fosfatase alcalina. Enxágue o rim com três trocas de solução tampão de lavagem por 10 a 15 minutos.

Em seguida, remova a solução tampão de lavagem e monte o rim em um copo limpo. Deslize o meio de montagem de fosfatase incluído no kit de rotulagem. Visualize o rim corado com fosfatase alcalina usando um microscópio estéreo ou microscópio composto com um conjunto de filtros Debbie conectados.

Primeiro, prepare uma solução de DBA de trabalho de 200 microlitros diluindo o DBA em um XPBS. Substitua a solução PBS por 200 microlitros de solução DBA e coloque a amostra em um rotador por uma hora em temperatura ambiente. Após este tempo, remova a solução de DBA e lave o rim três vezes com três a cinco mililitros de um XPBS por cinco minutos cada.

Remova o XPBS e monte o rim em uma lâmina de vidro limpa. Conforme demonstrado anteriormente, visualize os segmentos distais corados com DBA do rim usando um filtro vermelho Trixie ou Texas padrão em um microscópio estéreo fluorescente ou microscópio composto. Nesta imagem de campo claro de um rim não branqueado, a pigmentação preta corresponde à população dispersa de melanócitos.

Aqui, os segmentos de PCT do néfron são visualizados três dias após a injeção de dextrina. A inserção contém uma imagem de um único néfron com melanócitos. Esta imagem mostra um rim adulto após a remoção da pigmentação dos melanócitos.

Essas imagens representativas mostram pequenas variações morfológicas entre os segmentos de PCT, enquanto muitos PCTs de néfrons são firmemente enrolados. Outros néfrons contêm regiões PCT que têm dextrina azul em cascata de dextrina de enrolamento mínimo, amarelo de Lúcifer e dextrina fluoro Ruby, todos marcam preferencialmente os segmentos de PCT em néfrons renais, tanto a dextrina Cascade Blue quanto o amarelo de Lúcifer mostram alguma marcação não específica com fundo muito maior observado em rins tratados com amarelo de Lúcifer. Em contraste, a dextrina fluor Ruby mostrou um fundo drasticamente reduzido com intensa marcação de PCT.

Um rim adulto corado pelo desejo de detectar um marcador específico do tipo de célula transportadora PCT mostra um padrão de expressão característico da captação de dextrina com uma distribuição de vários domínios PCT em loop bem enrolados, bem como trechos PCT mais alongados que mostram um diâmetro amplo consistente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular com sucesso segmentos de néfrons dentro do rim de peixe-zebra adulto, como o túbulo proximal com fosfatase alcalina e o túbulo distal médico com DBA. Não se esqueça de que trabalhar com 4% de paraldeído pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar casaco, luvas e óculos devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.