Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

O objetivo geral deste procedimento é gerar um ensaio quantitativo da função renal em peixe-zebra. Isso é feito primeiro anestesiando embriões de peixe-zebra a 72 HPF. Em seguida, os embriões são transferidos para um molde de injeção e orientados de forma que seus corações fiquem à esquerda do campo de visão.

Em seguida, a cavidade pericárdica é injetada com um corante fluorescente dextra de rúmina e são necessárias imagens fluorescentes da região cardíaca usando um microscópio de dissecação de epifluorescência. Em última análise, a depuração renal de um corante fluorescente é avaliada usando microscopia de epifluorescência. A principal vantagem dessa técnica é que ela produz uma leitura quantitativa da função renal do peixe-zebra sem exigir exames de sangue ou urinários, o que não é possível no peixe-zebra.

Este método fornece uma ferramenta poderosa para avaliar a função renal em modelos de doença do peixe-zebra. Depois de puxar as agulhas e preparar um molde de acordo com o protocolo de texto, molde o molde despejando primeiro uma solução de 2% de aro feita em água de peixe em uma placa de Petri de 90 milímetros. Coloque o molde na placa de Petri, permitindo que as bordas das corrediças empilhadas submerjam em um ângulo sob a superfície agrícola.

Deixe agir por 30 minutos. Remova o molde da lâmina e use água fresca de peixe contendo anestésico trica na proporção de um para 25. Para cobrir o slide, aros impresso para realizar injeções de corante fluorescente em peixes-zebra.

Use uma configuração de microinjeção padrão que consiste em um compressor de ar conectado a um sistema regulador de pressão que alimenta um porta-pipeta reto para uso com capilares de diâmetro externo 1,0. O porta-pipetas deve ser alojado dentro de um compacto MN 33. Micro manipulador de controle de três eixos preso a uma placa de base de aço por um microscópio de dissecação do usuário de suporte magnético para visualizar, manipular e injetar embriões, mantendo o peixe-zebra usando condições padrão, conforme descrito no protocolo de texto.

Use linhagens de peixe-zebra do tipo selvagem ou transgênico conforme apropriado para o experimento. Manter uma densidade de estocagem de 15 machos a 15 fêmeas por tanque de oito litros para garantir que o máximo de ovos seja coletado sem perturbar os peixes. Mergulhe os tanques de reprodução em tanques de estoque do tipo selvagem na noite anterior à coleta.

No dia da coleta, aguarde de 30 a 40 minutos para que os peixes desovam. Em seguida, use uma peneira de malha e água fresca do aquário para coletar e enxaguar os ovos. Deposite os ovos limpos em uma placa de Petri de 90 milímetros contendo embriões, meio e incube a 28,5 graus Celsius para inibir a miogênese.

Às oito horas. Pós-fertilização ou HPF. Transfira os embriões viáveis em líquido mínimo para placas de Petri frescas contendo de um a 100 PTU para o meio embrionário e incube ainda mais a 28,5 graus Celsius.

Use uma pinça de ponta fina para quebrar a ponta da agulha. Em seguida, mova o RD para a ponta da agulha, maximizando a duração do pulso para a configuração de minutos. Quando a solução atingir a ponta, volte para milissegundos.

Coloque um micrômetro no microscópio stage e com o regulador de pressão e refinamentos na ponta da agulha, ajuste o tamanho da gota de expulsão para 100 mícrons de diâmetro ou um volume de 0,5 nanolitros antes da injeção. Configure 2 placas de Petri de 35 milímetros. Cada um contendo cinco mililitros de meio embrionário rotula um trica e o outro recuperação.

Adicione 200 microlitros de caldo trica ao prato rotulado trica. Quando estiver pronto para injetar, selecione um embrião individual com 72 HPF. Transfira o mínimo de líquido para a placa trica e monitore a atividade do embrião.

Depois que o embrião estiver anestesiado, transfira-o para o molde de injeção e oriente-o na calha de forma que o lado esquerdo fique voltado para cima. Posicionar o coração no lado esquerdo do campo de visão. Para injetar o DR no coração, use a agulha para perfurar o pericárdio e injete um nanolitro de RD na cavidade pericárdica.

Depois de retirar a agulha, transfira o embrião injetado em líquido mínimo para o prato de recuperação e monitore por um minuto. Em seguida, transfira o embrião individual para uma placa de 24 poços contendo um mililitro de meio embrionário fresco contendo PTU e rotule adequadamente. Depois de injetar pelo menos 10 embriões por grupo experimental, incubar a 28,5 graus Celsius por três horas.

Três horas após a injeção ou HPI anestesiaram embriões conforme descrito anteriormente. E transfira para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo 3% de metilcelulose. Empurre suavemente os embriões para a metilcelulose e oriente-os para que o lado lateral possa ser visualizado.

Usando um filtro de emissão de 570 nanômetros para luz UV, adquira uma imagem do embrião. Permita que o embrião se recupere antes de substituí-lo no poço designado, adquira imagens para todos os embriões injetados e, em seguida, continue a incubar a 28,5 graus Celsius. Depois de adquirir uma segunda rodada de imagens a 24 HP, uso o software de imagem J para quantificar a intensidade de fluorescência de cada embrião injetado, abrindo uma imagem e especificando uma região de interesse ou ROI.

Ao escolher editar seleção, especifique e defina o valor em 100 pixels quadrados. Posicione o coração no centro do ROI e escolha analisar, definir medidas e definir as medidas para incluir a escala média de cinza e a área. Em seguida, faça a medição, quantifique a fluorescência para cada conjunto de imagens em três HPI e 24 HPI por embrião e transfira os valores médios da escala de cinza para uma planilha para processamento posterior.

Use o software apropriado para realizar análises estatísticas e comparar grupos quanto à significância estatística usando o teste T de Student, conforme mostrado aqui. A injeção de RD em nove peixes injetados com Morpho resultou em 40% dos embriões desenvolvendo cistos fricosos pronos cinco dias após a fertilização. Além disso, o peixe morfina exibiu uma redução na capacidade de limpar o corante fluorescente após 24 HPI em comparação com os controles.

Uma vez que um grupo de 10 peixes pode ser injetado em 15 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aproveitar a transparência óptica do peixe-zebra para monitorar quantitativamente a depuração temporal de um corante fluorescente microinjetado como uma leitura eficaz da função renal do peixe-zebra.