Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

O objetivo geral deste procedimento é gerar um ensaio quantitativo de função renal em peixes-zebra. Isso é realizado primeiramente anestesiando embriões de peixes-zebra aos 72 HPF. Em seguida, os embriões são transferidos para um molde de injeção e orientados de modo que seus corações fiquem à esquerda do campo de visão.

Em seguida, a cavidade pericárdica é injetada com um corante fluorescente rumine dextra e são obtidas imagens fluorescentes da região cardíaca utilizando um microscópio estereoscópico de fluorescência epiluminiscente. Por fim, a depuração renal de um corante fluorescente é avaliada utilizando microscopia de fluorescência epiluminiscente. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma leitura quantitativa da função renal de peixes-zebra sem necessidade de testes sanguíneos ou urinários, os quais não são viáveis em peixes-zebra.

Este método fornece uma ferramenta poderosa para avaliar a função renal em modelos de doenças de peixe-zebra. Após preparar as agulhas e moldar de acordo com o protocolo descrito, faça o molde vertendo inicialmente uma solução de 2%aro preparada em água para peixes em uma placa de Petri de 90 milímetros. Coloque o molde sobre a placa de Petri, permitindo que as bordas sobrepostas dos lâminas afundem em um ângulo sob a superfície de agro.

Deixe repousar por 30 minutos. Remova o molde de lâmina e utilize água fresca de peixe contendo anestésico trica na proporção de um para 25. Para cobrir a lâmina, imprima aros para realizar injeções em peixe-zebra com corante fluorescente.

Utilize uma configuração padrão de microinjeção composta por um compressor de ar conectado a um sistema regulador de pressão que se conecta a um suporte reto para micropipetas, para uso com capilares de diâmetro externo 1,0. O suporte para micropipetas deve ser acomodado dentro de um manipulador microscópico compacto MN 33. Um micromanipulador de controle em três eixos fixado a uma placa de base de aço por meio de um suporte magnético e um microscópio estereoscópico para dissecção, utilizado para visualizar, manipular e injetar embriões, mantendo os peixes-zebra em condições padrão conforme descrito no protocolo textual.

Utilize linhagens selvagens ou transgênicas de peixe-zebra conforme apropriado para o experimento. Mantenha uma densidade de estocagem de 15 machos para 15 fêmeas por tanque de oito litros para garantir a coleta máxima de ovos sem perturbar os peixes. Submerja os tanques de reprodução nos tanques de linhagem selvagem na noite anterior à coleta.

No dia da coleta, aguarde de 30 a 40 minutos para que os peixes desovem. Em seguida, utilize um coador de malha e água fresca do aquário para coletar e lavar os ovos. Coloque os ovos limpos em uma placa de Petri de 90 milímetros contendo meio embrionário e incube a 28,5 graus Celsius para inibir a miogênese.

Após oito horas pós-fertilização (HPF). Transfira os embriões viáveis com o mínimo de líquido para novas placas de Petri contendo de um a 100 PTU no meio para embriões e continue a incubação a 28,5 graus Celsius.

Use pinças de ponta fina para quebrar a extremidade da agulha. Em seguida, mova o RD até a ponta da agulha maximizando a duração do pulso para o ajuste de minuto. Quando a solução atingir a ponta, volte para milissegundos.

Coloque um micrômetro na platina do microscópio e, com o regulador de pressão e ajustes na ponta da micropipeta, ajuste o tamanho da gota expelida para um diâmetro de 100 mícrons ou um volume de 0,5 nanolitros antes da injeção. Prepare dois pratos de Petri de 35 milímetros, cada um contendo cinco mililitros de meio para embriões; rotule um como trica e o outro como recuperação.

Adicione 200 microlitros da solução estoque de trica à placa rotulada com trica. Quando estiver pronto para injetar, selecione um embrião individual com 72 HPF. Transfira o mínimo de líquido possível para a placa de trica e monitore a atividade do embrião.

Uma vez que o embrião esteja anestesiado, transfira-o para o molde de injeção e posicione-o no sulco com o lado esquerdo voltado para cima, de modo que o coração fique no lado esquerdo do campo de visão. Para injetar o RD no coração, use a agulha para perfurar o pericárdio e injete um nanolitro de RD na cavidade pericárdica.

Após retirar a agulha, transfira o embrião injetado com o mínimo de líquido para a placa de recuperação e monitore por um minuto. Em seguida, transfira o embrião individual para uma placa de 24 poços contendo um mililitro de meio fresco para embriões contendo PTU e rotule adequadamente. Após injetar pelo menos 10 embriões por grupo experimental, incube a 28,5 graus Celsius por três horas.

Três horas após a injeção (HPI), anestesiar os embriões conforme descrito anteriormente e transferi-los para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo 3% de metilcelulose. Empurrar suavemente os embriões para dentro da metilcelulose e orientá-los de modo que o lado lateral possa ser imageado.

Usando um filtro de emissão de 570 nanômetros para luz UV, adquira uma imagem do embrião. Deixe o embrião se recuperar antes de devolvê-lo ao poço designado, adquira imagens de todos os embriões injetados e, em seguida, continue a incubação a 28,5 graus Celsius. Após adquirir uma segunda rodada de imagens às 24 HP, utilizo o software ImageJ para quantificar a intensidade de fluorescência de cada embrião injetado, abrindo uma imagem e especificando uma região de interesse ou ROI.

Ao escolher editar seleção, especifique e defina o valor em 100 pixels quadrados. Posicione o coração no centro da ROI e escolha analisar, definir medições e configure as medições para incluir escala de cinza média e área. Em seguida, realize a medição, quantifique a fluorescência para cada conjunto de imagens em três HPI e 24 HPI por embrião e transfira os valores médios de escala de cinza para uma planilha para processamento adicional.

Utilize um software apropriado para realizar a análise estatística e comparar os grupos quanto à significância estatística utilizando o teste T de Student, conforme mostrado aqui. A injeção de RD em peixes Morpho com nove bbbs resultou em 40% dos embriões desenvolvendo cistos pronefricos até cinco dias após a fertilização. Além disso, os peixes morpholino exibiram uma redução na capacidade de eliminar o corante fluorescente após 24 HPI em comparação com os controles.

Deve-se injetar um grupo de 10 peixes dentro de 15 minutos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aproveitar a transparência óptica do peixe-zebra para monitorar quantitativamente a eliminação temporal de um corante fluorescente microinjetado como uma leitura eficaz da função renal do peixe-zebra.